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在内质网转位过程中停滞的蛋白质会堵塞Sec61通道，需要通过转位子质量控制（TQC）机制予以清除。遗传筛选提示Derlin家族蛋白Dfm1参与TQC，但其作用机制尚不明确。我们在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中使用经工程改造的及与疾病相关的转位子堵塞底物，发现Dfm1在依赖Ste24的TQC分支中发挥作用，但不参与依赖Hrd1或Ltn1的途径。DFM1缺失会增加转位子堵塞蛋白的积累及其毒性。增加野生型或催化失活型Hrd1或Ste24的表达量均可缓解毒性，支持这些因子在TQC中具有非酶促缓冲功能。这些发现确立了Dfm1作为关键TQC因子的地位，其在清除堵塞转位子中的关键功能缺失可通过多种方式得到补偿。我们的结果提示，增强TQC可能保护细胞免受疾病相关转位子堵塞底物引起的蛋白质毒性应激，并可能对糖尿病中的胰腺β细胞功能障碍具有潜在意义。重要性声明O_LI细胞依赖转位子质量控制（TQC）来清除堵塞Sec61转位子的蛋白质，但Derlin家族蛋白Dfm1如何参与这一过程尚不明确。C_LIO_LI我们证明，Dfm1特异性地在依赖Ste24的TQC途径中发挥作用，并发现即使不具备催化活性，提高TQC因子Hrd1或Ste24的水平也能补偿Dfm1缺失，揭示了一种出乎意料的非酶促缓冲功能。C_LIO_LI本研究明确了Dfm1在TQC中的作用机制，为理解细胞如何在转位应激期间维持内质网功能提供了新的见解，并为研究能够抵御转位子相关疾病的保守途径建立了框架。堵塞。C_LI
9
圣裘德儿童研究医院发育神经生物学系，田纳西州孟菲斯；圣裘德儿童研究医院生物医学科学研究生院
，田纳西州孟菲斯
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Jacob M. Miller
1
鲍尔州立大学生物学系
，印第安纳州曼西
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Hailey J. Barton
1
鲍尔州立大学生物学系
，印第安纳州曼西
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Eric S. Fults
1
鲍尔州立大学生物学系
，印第安纳州曼西
10
哥伦布地区医院家庭医学科
，印第安纳州哥伦布
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Robert J. Tomko
Jr.
2
佛罗里达州立大学医学院生物医学科学系
，佛罗里达州塔拉哈西
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Jr.
Eric M. Rubenstein
1
鲍尔州立大学生物学系
，印第安纳州曼西
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摘要
在内质网转位过程中停滞的蛋白质会堵塞 Sec61 通道，需要通过转位子质量控制（TQC）机制予以清除。遗传筛选提示，derlin 家族蛋白 Dfm1 参与 TQC；然而，其作用机制
仍不清楚。我们在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中使用人工构建的及疾病相关的转位子堵塞底物，证明Dfm1参与转位子质量控制（TQC）中依赖Ste24的分支，但不参与依赖Hrd1或Ltn1的途径。DFM1缺失增加了转位子堵塞蛋白的积累及其毒性。提高野生型或催化失活型Hrd1或Ste24的表达量均可缓解毒性，支持这些因子在TQC中具有非酶促的缓冲功能。这些发现表明，Dfm1是关键的TQC因子，其在清除堵塞转位子方面的关键作用可通过多种方式得到补偿。我们的结果提示，增强TQC可能保护细胞免受疾病相关转位子堵塞底物所引发的蛋白质毒性应激，并可能对糖尿病中胰腺β细胞功能障碍的研究具有启示意义。
研究意义声明
细胞依赖转位子质量控制（TQC）来清除堵塞Sec61转位子的蛋白质，但derlin家族蛋白Dfm1如何参与这一过程仍不清楚。
我们证明，Dfm1特异性地参与依赖Ste24的TQC途径，并发现即使不具备催化活性，提高TQC因子Hrd1或Ste24的水平仍可补偿Dfm1缺失，揭示了一种出乎意料的非酶促缓冲功能。
本研究明确了Dfm1在TQC中的作用机制，为理解细胞如何在转位应激期间维持内质网功能提供了新的见解，并为研究抵御转位子堵塞相关疾病的保守途径建立了框架。
引言
约三分之一的真核生物蛋白质在到达其最终目的地之前会进入内质网（ER）（Chen et al., 2005；Choi et al., 2010）。其中许多蛋白质通过穿过……来跨越内质网膜。
Sec61易位子（Itskanov and Park, 2023）。蛋白质在内质网（ER）转位过程中偶尔会发生停滞，导致Sec61通道堵塞及功能受损（Rubenstein et al., 2012；Ast et al., 2016；Wang and Ye, 2020）。细胞具有多种保守的易位子质量控制（TQC）机制，以疏通这些堵塞的通道（Wang and Ye, 2020）。其中若干机制是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中发现并得到初步表征的。锌金属蛋白酶Ste24（人同源蛋白为ZMPSTE24）和泛素连接酶Hrd1（人同源蛋白为gp78和HRD1）在疏通由翻译后进入易位子的蛋白质所堵塞的易位子方面，具有部分冗余的功能（Rubenstein et al., 2012；Ast et al., 2016；Runnebohm et al., 2020）。相比之下，泛素连接酶Ltn1（又称Rkr1；人同源蛋白为Listerin）可降解因翻译停滞而堵塞易位子的蛋白质，这是其核糖体质量控制功能的延伸（Crowder et al., 2015；von der Malsburg et al., 2015；Arakawa et al., 2016；Ennis et al., 2025）。哺乳动物还具有其他层面的TQC机制，包括由类泛素修饰因子UFM1标记翻译停滞的内质网结合核糖体（Wang et al., 2020；Scavone et al., 2023）。
两项遗传筛选提示，derlin家族蛋白Dfm1参与TQC（Ast et al., 2016；Kayatekin et al., 2018）。Derlin家族蛋白是内质网驻留的菱形假蛋白酶，在内质网蛋白质质量控制（PQC）、脂质生物合成和细胞器稳态中发挥多种作用（Lemberg, 2013；Kandel and Neal, 2020；Bhaduri et al., 2023a；Bhaduri et al., 2023b；Scott et al., 2026）。酵母编码两种derlin家族蛋白，即Der1和Dfm1，而哺乳动物编码Derlin-1、Derlin-2和Derlin-3（Bhaduri et al., 2023b）。Dfm1和哺乳动物Derlin-1
以及Derlin-2（但不包括酵母Der1或哺乳动物Derlin-3）具有C端SHP基序，可招募AAA ATP酶Cdc48/p97。Cdc48为内质网跨膜蛋白逆向转位至细胞质提供动力（Sato and Hampton, 2006；Goder et al., 2008；Stolz et al., 2010；Lim et al., 2016）。
Der1促进异常内质网腔蛋白的逆向转位，使其得以降解（Knop et al., 1996；Carvalho et al., 2006；Horn et al., 2009；Wu et al., 2020），而Dfm1在内质网蛋白质质量控制（PQC）中的作用则一直存在争议。早期研究报道，Dfm1对内质网PQC的贡献有限或并无贡献（Sato and Hampton, 2006；Goder et al., 2008），但后续研究表明，Dfm1可促进内质网泛素连接酶Hrd1和Doa10的跨膜PQC底物发生逆向转位，并降低其毒性（Stolz et al., 2010；Neal et al., 2018；Vitali et al., 2024）。早期的阴性结果已被解释为dfm1Δ细胞中迅速发生的遗传抑制效应，这通常通过HRD1基因扩增及Hrd1复合物重塑，形成替代性的逆向转位途径来实现（Neal et al., 2018；Neal et al., 2020）。
全基因组研究表明，DFM1缺失会损害表达工程化转位子堵塞底物Clogger的酵母的生长（图1A）（Ast et al., 2016），并使细胞对阻塞转位子的寡聚型胰岛淀粉样多肽（IAPP）酵母模型更加敏感（图3A）（Kayatekin et al., 2018）。然而，Dfm1在转位子质量控制（TQC）中的作用机制仍不明确。在此，我们利用由Ste24、Hrd1或Ltn1靶向的明确界定的转位子堵塞蛋白，证明Dfm1能够清除转位子堵塞，并减轻主要由Ste24途径处理的蛋白质的毒性，但对依赖Hrd1或Ltn1机制处理的蛋白质则无此作用。我们进一步表明，增加野生型或
催化失活的 Hrd1 或 Ste24 可缓解转位通道堵塞蛋白在 dfm1Δ 酵母中引起的毒性。这种缓解伴随着成功转位频率的升高，但并未清除堵塞内质网转位通道的蛋白形式，提示 Ste24 和 Hrd1 在疏通堵塞的转位通道时发挥非酶促功能。我们的研究发现，Dfm1 在转位通道质量控制（TQC）中发挥关键作用，但其缺失所致的缺陷可被抑制，并为细胞如何缓解转位应激提供了新的机制性见解。
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图 1.
Dfm1 是 TQC 所必需的。
（A）Clogger 是一种人工构建的转位通道堵塞蛋白，是 Ste24 和 Hrd1 复合物（Hrd1、Ubc7、Cue1）的靶标。Clogger 由经翻译后转位进入内质网的糖蛋白 Pdi1、能够快速折叠并堵塞转位通道的大肠杆菌二氢叶酸还原酶（DHFR）、额外的糖基化位点以及 HA 标签组成。蓝色圆圈表示发生糖基化的氨基酸。（B）Clogger 的蛋白质免疫印迹。（C）Clogger 的环己酰亚胺追踪实验。（D–F）将酵母进行 6 倍梯度稀释后，点样于含葡萄糖或半乳糖的培养基上。（F）中的酵母转化了空载体或编码 Dfm1（−3HA）的质粒。（G）左图：稳态提取物中 Clogger 和 Pdi1 的蛋白质免疫印迹。右图：采用单因素方差分析及 Tukey 多重比较检验，比较处于插入前状态的 Clogger 百分比的均值。*，p < 0.05。，p < 0.01。*，p < 0.001。****，p < 0.0001。（C、G）Pgk1 为上样对照。所有实验均重复三次。
结果与讨论
Dfm1 是转位通道质量控制所必需的
我们获得了最初的 Clogger 降解筛选中构建的 dfm1Δ 菌株（Ast 等，2016）。Clogger 的糖基化状态和电泳迁移率反映了其相对于内质网膜的位置（图 1B）。迁移最慢、完全糖基化的
这些形式已完全转位至内质网腔内。迁移率居中、半糖基化的形式为堵塞转位子的 Clogger。迁移最快的未糖基化形式位于细胞质中，但其与 Ste24 的高效相互作用（Ast 等，2016）提示，它们可能代表早期内质网相关中间体或转位中间体。堵塞型和细胞质型 Clogger（统称为“插入前”Clogger）在 TQC 缺陷细胞中积累，其丰度与适合度下降相关。
为评估 Dfm1 在 TQC 中的作用，我们采用环己酰亚胺追踪实验，分析了野生型酵母、缺失已知 TQC 因子 Hrd1 和 Ste24 的菌株以及 dfm1Δ 细胞中 Clogger 的动态变化（图 1C）。在野生型细胞中，Clogger 主要以完全转位形式存在。与先前报道一致，ste24Δ 酵母中插入前 Clogger 发生积累，而 HRD1 缺失则使堵塞型 Clogger 的稳定性略有增加。STE24 和 HRD1 同时缺失进一步增加了插入前 Clogger 的水平，这与二者在解除转位子堵塞方面具有重叠作用的观点一致（Runnebohm 等，2020）。值得注意的是，dfm1Δ 细胞中的插入前 Clogger 也表现出显著的稳定性增加。dfm1Δ 细胞中各类 Clogger 的分布与 ste24Δ 细胞高度相似，提示 Dfm1 和 Ste24 在同一通路中发挥作用。
随后，我们比较了野生型菌株与 TQC 突变菌株对转位子堵塞应激的敏感性（图 1D）。Clogger 的表达由 GAL1 启动子驱动。在不表达 Clogger 的条件下（葡萄糖培养基），DFM1 缺失并未损害适合度。与先前的观察一致（Runnebohm 等，2020），HRD1 与 STE24 之间表现出合成性负相互作用。诱导 Clogger 表达降低了野生型细胞的适合度。HRD1 缺失略微增强了细胞对 Clogger 的敏感性。缺失
STE24或DFM1的缺失显著加剧了这一缺陷，这与有毒的预插入态Clogger清除受损相一致。
由于上述分析中使用的dfm1Δ菌株直接分离自最初的遗传筛选，并携带该筛选特有的其他遗传改变（Ast et al., 2016），我们独立构建了表达Clogger的dfm1Δ菌株以进行验证。鉴于已有研究报道dfm1Δ酵母中经常出现遗传抑制现象（Neal et al., 2018；Neal et al., 2020），我们先在携带质粒编码的DFM1拷贝的细胞中敲除DFM1，随后再去除该质粒。
三个独立的dfm1Δ分离株对堵塞应激表现出明显的敏感性（图1E），但其程度低于筛选获得的菌株。第四个分离株仅表现出轻微的适合度缺陷，提示其可能携带抑制突变。通过质粒表达DFM1可恢复对堵塞应激的抵抗力，且C端3HA标签不影响其互补功能（图1F）。重要的是，预插入态Clogger的积累（图1G）与生长受损程度相关。与转位子堵塞相一致，DFM1缺失还损害了内源性Pdi1向内质网的转运，其受损程度与Clogger敏感性及预插入态分子的积累程度成正比（图1G，下图）。综上，这些结果确立了DFM1作为真正的TQC因子的地位。
Dfm1在Ste24 TQC通路中发挥作用
Hrd1和Ste24介导部分冗余的TQC机制。dfm1Δ细胞中Clogger各形态的分布及其敏感性更接近ste24Δ细胞，而非hrd1Δ细胞（图1C和1D）。此外，与任一单突变体相比，ste24Δ dfm1Δ双突变体并未表现出更高的Clogger敏感性（图2A），也未出现更多预插入态Clogger的积累（图2B），这不同于在hrd1Δ
ste24Δ 酵母（图 1C，Runnebohm 等，2020）。这些结果表明，Dfm1 在 Ste24 依赖性通路中发挥作用。
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图 2.
Dfm1 在 Ste24 依赖性易位子质量控制（TQC）中发挥作用。
（A）将酵母按 6 倍梯度稀释后点种于含葡萄糖或半乳糖的培养基上。（B）左图，稳态细胞提取物中 Clogger 的蛋白质印迹。右图，采用单因素方差分析及 Tukey 多重比较检验，比较 4 次生物学重复中处于预插入状态的 Clogger 百分比的均值。，p < 0.01；*，p < 0.001。（C）在两个典型跨膜区段插入后，Deg1*-Sec62 的部分 N 端尾部以环状结构进入内质网易位子，并持续与之结合。Deg1*-Sec62 主要由 Hrd1 靶向识别。（D）左图，Deg1*-Sec62 的环己酰亚胺追踪实验。右图，绘制 3 次生物学重复中 Deg1*-Sec62 残留百分比均值随时间变化的曲线。采用单因素方差分析及 Tukey 多重比较检验，比较 60 min 时 Deg1*-Sec62 残留百分比的均值。***，p < 0.001，适用于 hrd1Δ 酵母与其余 3 个菌株分别进行的比较。（E）翻译停滞的内质网靶向蛋白由 Ltn1 介导的核糖体质量控制途径靶向识别。（F）CPY-K12-13myc 是一种内质网靶向的 Ltn1 模型底物。左图，稳态细胞提取物中 CPY-K12（翻译停滞产物）和 CPY-K12-13myc（通读产物）的蛋白质印迹。3 次实验中，每次均包含 dfm1Δ 的 3–4 次生物学重复。右图，对于每次重复，均将 CPY-K12 的信号强度归一化至 Pgk1。将 4 次生物学重复的野生型平均值设为 1。采用单因素方差分析及 Tukey 多重比较检验对均值进行比较。p 值标于图上方。（C、E）红色圆圈，泛素。（B、D、G）Pgk1，上样对照。
我们先前的研究表明，Dfm1 并非必需
对于Hrd1介导的TQC而言，Hrd1依赖性底物Deg1*-Sec62的降解（图2C）不依赖于Dfm1（Rubenstein et al., 2012）。由于dfm1Δ表型容易受到遗传抑制，我们使用三个独立构建的dfm1Δ菌株重复了这一分析（图2D和S1A）。尽管理论上仍不能排除遗传抑制的可能性，但多个dfm1Δ分离株均未能使Deg1*-Sec62稳定积累，这支持了Dfm1不参与Hrd1 TQC通路的结论。
接下来，我们使用模式底物CPY-K12（Crowder et al., 2015）检验了Dfm1是否参与Ltn1介导的共翻译TQC（图2E）。CPY-K12由靶向内质网的CPY及其后依次连接的两个蛋白A标签、一段引起翻译停滞的多聚赖氨酸（K12）序列和13个myc标签组成，其中myc标签仅在翻译通读K12序列时才会被翻译（图2F）。翻译停滞产物（CPY-K12）与通读产物（CPY-K12-13myc）可通过分子量加以区分。TQC缺陷表现为CPY-K12丰度升高。DFM1缺失并未显著改变停滞产物CPY-K12的丰度（图2G）。综上，这些结果表明，Dfm1在TQC中的功能主要局限于Ste24通路。
Dfm1缓解IAPP诱导的转位子应激
为进一步研究Dfm1在TQC中的功能，我们评估了细胞对6xIAPP的敏感性；6xIAPP是一种寡聚态胰岛淀粉样多肽（IAPP）的酵母表达模型（Kayatekin et al., 2018）（图3A）。糖尿病中的β细胞功能衰竭与寡聚态IAPP的积累相关，而寡聚态IAPP会阻碍转位子功能（Lorenzo et al., 1994；Jurgens et al., 2011；Mukherjee et al., 2017；Kayatekin et al., 2018）。与我们的Clogger实验结果一致，DFM1缺失使细胞对半乳糖诱导的6xIAPP表达更为敏感，其程度与
程度与 STE24 缺失相当，而 hrd1Δ 酵母仅表现出极低的敏感性（图 3B）。
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图 3.
Dfm1 和 Ste24 减轻 IAPP 毒性。
(A) 用于酵母表达的 6xIAPP 变体包含 Kar2 信号序列（SS），以确保高效靶向内质网（ER）；还包含由短连接肽分隔的 6 个成熟 IAPP 拷贝，以及 3 个 HA 标签。(B) 将转化了编码 6xIAPP-3HA 的质粒或空载体的酵母进行 6 倍梯度稀释，并点种于含葡萄糖或半乳糖的培养基上。(C) 上：6xIAPP-3HA 的环己酰亚胺追踪实验。左下：根据 3 次生物学重复，绘制总 6xIAPP-3HA（胞质 + ER）剩余百分比均值随时间变化的曲线。采用单因素方差分析结合 Tukey 多重比较检验，比较 90 min 时 6xIAPP-3HA 剩余百分比的均值。未观察到显著差异。右下：采用单因素方差分析结合 Tukey 多重比较检验，比较 ER 中 6xIAPP（SS 已切除）的稳态丰度均值（相对于野生型归一化）。，p < 0.01。*，p < 0.001。Pgk1 为上样对照。
接下来，我们通过环己酰亚胺追踪实验，检测了野生型、hrd1Δ、ste24Δ 和 dfm1Δ 细胞中 6xIAPP 的加工情况（图 3C）。尽管 6xIAPP 在所有情况下均高度稳定，但其成熟过程的差异与 ste24Δ 和 dfm1Δ 细胞中转位子清障受损的情况一致。这两种突变株中驻留于 ER 的 6xIAPP（即信号序列已切除的蛋白质）丰度均降低，与 ER 转位效率下降及转位子堵塞未能解除的情况一致。这些结果进一步支持这样一种模型：Dfm1 与 Ste24 协同应对转位子堵塞。
增加野生型或失活型 HRD1 或 STE24 的基因剂量可挽救 dfm1Δ 的 TQC 表型
Dfm1 在错误折叠的跨膜蛋白 Hrd1 逆向转位中的必要性
Hrd1 的过量表达可绕过底物的这一需求，为膜提取提供一条替代途径（Neal 等，2018）。我们检测了增加 TQC 因子 Hrd1 或 Ste24 的表达是否能够挽救原始筛选中获得的 dfm1Δ 酵母对 Clogger 的敏感性。携带由各自天然启动子驱动的 HRD1 或 STE24 的低拷贝（CEN）质粒显著改善了 dfm1Δ 细胞在堵塞胁迫下的生长（图 4A）。值得注意的是，催化失活的 Hrd1 或 Ste24 变体也恢复了细胞对 Clogger 的抗性（图 4B）。在原始筛选获得的菌株（图 4A 和 4B）及新构建的 dfm1Δ 菌株（图 4C）中均观察到了这种挽救效应。
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图 4.
增加 HRD1 或 STE24 的剂量可挽救 dfm1Δ 酵母对转位子堵塞的敏感性。
（A–C、F、I、J）将携带所示质粒的酵母进行 6 倍梯度稀释，并点种于含葡萄糖或半乳糖的培养基上。（D、G、H、K）左：对携带所示质粒的酵母的稳态提取物中的 Clogger 进行蛋白质印迹分析，包含 3 次生物学重复。（G）和（H）中还检测了带有 N 端 3HA 标签的 Ste24（-H297A），（K）中检测了 GFP。右：采用单因素方差分析并结合 Tukey 多重比较检验，对 3 次生物学重复中预插入的 Clogger 百分比均值进行比较。*，p < 0.05；，p < 0.01；*，p < 0.001；****，p < 0.0001。（E）对（D）中以葡萄糖培养的代表性平行培养物制备的稳态裂解液进行蛋白质印迹分析，检测带有 C 端 3HA 标签的 Hrd1（-C399S）。Pgk1 为上样对照。•，非特异性条带。
为确定这种挽救效应是否反映了 Clogger 清除的改善，我们检测了表达质粒编码的野生型或失活型 Hrd1 或 Ste24 的 dfm1Δ 细胞中 Clogger 的动态变化。令人意外的是，增加 HRD1
或 STE24 的基因剂量并未降低预插入态 Clogger 的绝对丰度。相反，这始终提高了完全插入（即位于腔内）的 Clogger 的比例（图 4D 和 4G）。通过免疫印迹确认了质粒编码的 Hrd1 和 Ste24 的表达（图 4E 和 4G）。这一效应具有特异性，因为质粒驱动的 GFP 表达既不能挽救生长缺陷，也不能增加完全插入的 Clogger（图 4J 和 4K）。
通过质粒测序（文件 S1）和表型分析确认了催化失活。野生型 Hrd1 可部分挽救 ste24Δ hrd1Δ 细胞的合成性生长缺陷，而 hrd1-C399S 则不能（图 4F）。同样，野生型 Ste24 可回补 ste24Δ 细胞的 TQC 缺陷，而 ste24-H297A 则不能（图 4H 和 4I），表明在正常条件下，Ste24 的催化活性是必需的。
这些发现表明，提高 Hrd1 或 Ste24 的水平可促进堵塞的易位子的解堵，且这一过程不依赖催化活性，也不直接降解造成堵塞的底物，揭示了它们在 TQC 中的非酶促功能。我们推测，过量的 TQC 因子可充当捕获库，隔离从易位子侧向释放的堵塞蛋白。Hrd1 和 Ste24 均为多跨膜蛋白，能够在嵌于膜内的腔穴中结合底物（Pryor 等，2013；Neal 等，2020；Wu 等，2020；Spear 等，2026），提示其丰度增加可能缓冲堵塞蛋白的毒性作用。
dfm1Δ 酵母的自发表型抑制
在诱导 Clogger 表达的条件下培养筛选所得的 dfm1Δ 菌株时，我们分离出了生长迅速的抑制子菌落（图 5A）。三个独立的抑制子分离株表现出与野生型相当的堵塞应激抗性（图 5B）。恢复的
适应性的恢复与预先插入的 Clogger 分子的清除同步发生（图 5C），表明抑制效应通过不同于 Hrd1 或 Ste24 过量表达的机制恢复转位子质量控制（TQC）。堵塞应激条件下抑制子的出现，与先前研究中观察到的 dfm1Δ 对错误折叠膜蛋白的敏感性可被自发抑制的现象相呼应（Neal 等，2018）。为确定抑制效应是否伴随大规模基因组变化，我们检测了抑制子菌株的倍性。基于流式细胞术对这些抑制子菌株及亲本 dfm1Δ 菌株进行的倍性分析表明，其中一个抑制子菌株发生了二倍体化（图 S1C）。抑制效应的分子基础及其与 TQC 调控的关系将在未来研究中进一步探讨。
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图 5.
dfm1Δ 酵母对 Clogger 敏感性的自发抑制。
（A）将表达 Clogger 的 dfm1Δ 酵母划线接种于含半乳糖的培养基上。箭头表示抑制子。（B）将酵母按 6 倍梯度稀释后，点样于含葡萄糖或半乳糖的培养基上。实验重复 3 次。（C）左图，稳态提取物中 Clogger 的蛋白质印迹。右图，对 4 次生物学重复中预先插入的 Clogger 百分比的均值进行单因素方差分析，并采用 Tukey 多重比较检验。*，p < 0.05。**，p < 0.01。Pgk1 为上样内参。
总体而言，这些结果确立了 Dfm1 作为 TQC 中 Ste24 依赖性分支关键组分的地位，并支持这样一种模型：Dfm1 促进堵塞转位子的多肽从 Sec61 通道中抽提出来。我们推测，这一过程通过 Cdc48 依赖性逆向转位实现。该模型与 cdc48 突变体中 IAPP 毒性增强（Kayatekin 等，2018）以及 Cdc48 被募集至堵塞的
转位子（Ast et al., 2016）。尽管堵塞转位子的底物仍然存在，提高Hrd1或Ste24的水平可减轻转位子堵塞相关的毒性，这表明，增强转位质量控制（TQC）因子的缓冲能力可在不依赖底物降解的情况下维持内质网（ER）功能。在糖尿病相关的IAPP诱导的转位应激过程中，提高这些因子的同源蛋白的丰度或缓冲能力，可能是维持内质网功能和胰腺β细胞存活的一种策略。
材料与方法
酵母与质粒方法
除非另有说明，酵母均在30°C下培养，使用富营养酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基或合成限定基本（SD）培养基（Guthrie and Fink, 2004），两者均以2%葡萄糖作为碳源。为诱导受GAL1启动子控制的基因（Clogger和6xIAPP）表达，将葡萄糖替换为2%半乳糖。采用醋酸锂转化法将质粒导入酵母。酵母菌株和质粒见表S1和S2。
为敲除DFM1，使用引物VJR515（AGTGAATTCCGCATTTCCAAGTCAAATCAAAAACTATTTTCGAGGAAATACGGATCCCCGGGTTAATTAA）和VJR516（TCTTGATGTATATAATGAATGGCAAAGTACATAGAAATAGATAAAAGTTGGAATTCGAGCTCGTTTAAAC），以pFA6a-His3MX6（Wach et al., 1997）为模板，通过PCR扩增获得含有HIS3MX6的基因盒，其两侧分别带有与DFM1上游和下游序列同源的49 bp DNA。通过同源重组将该基因盒靶向整合至酵母DFM1位点。对5′端和3′端整合接头进行PCR检测，以确认该基因盒已整合至DFM1位点。通过插入分别来自pRH642（Sato et al., 2009）和pRH1245（的EcoRI/SacI片段，构建了pRS316-Hrd1-3HA（pVJ476）和pRS316-hrd1-C399S-3HA（pVJ498）；这些片段含有HRD1启动子以及HRD1-3HA或hrd1-C399S-3HA。
（Gardner 等，2000），分别插入 pRS316 的 EcoRI 和 SacI 位点。p416-P_GAL1-Kar2SS-6xIAPP-3HA（pVJ636）通过定制质粒合成（GenScript）构建。将来自 pSN113（相当于 Nejatfard 等（2021）中的 pSN90）、含有 DFM1 启动子、DFM1 和 3HA 标签的 SacI/XhoI 片段插入 pRS316 的 SacI 和 XhoI 位点，构建 p316-DFM1-3HA（pVJ691）。为构建 p316-DFM1（pVJ704），将来自 pSN164（Bhaduri 等，2023a）、含有部分 DFM1 序列但不含 3HA 标签的 SpeI/XhoI 片段插入 pVJ691 的 SpeI 和 XhoI 位点。本研究使用或构建的所有质粒均由 Plasmidsaurus 采用 Oxford Nanopore 技术进行全质粒测序确认（文件 S1）。
环己酰亚胺追踪、细胞裂解、蛋白质免疫印迹及数据分析
环己酰亚胺追踪实验按既述方法进行（Buchanan 等，2016）。简言之，将酵母培养至指数生长期，随后用 250 µg/ml 环己酰亚胺处理，并在指定时间点收集细胞。采用碱裂解法提取蛋白质（Kushnirov，2000；Watts 等，2015）。SDS-PAGE 后，在 4°C、20 V 条件下湿转 1 h，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜。使用以 Tris 缓冲盐水（TBS）配制的 5%（w/v）脱脂奶粉于室温封闭膜 1 h，或于 4°C 封闭过夜。使用稀释比例为 1:1,000 至 1:10,000 的小鼠抗 HA.11 抗体（克隆号 16B12；BioLegend）检测 Clogger、Hrd1-3HA 变体、3HA-Ste24 变体及 6xIAPP-3HA。使用稀释比例为 1:1,000 的小鼠抗 GFP 抗体（克隆号 JL-8；Clontech）检测 GFP。使用小鼠抗 PDI 抗体（克隆号 38H8；Invitrogen）检测 Pdi1。使用小鼠抗 Pgk1 抗体（克隆号 22C5D8；Life Technologies）检测 Pgk1，稀释比例为
稀释比例为1:20,000至1:40,000。小鼠一抗孵育后，使用稀释比例为1:20,000至1:40,000的AlexaFluor-680偶联兔抗小鼠二抗进行孵育。Deg1*-Sec62和CPY变体带有串联的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）蛋白A标签（Hjelm et al., 1972），可直接使用稀释比例为1:20,000至1:40,000的AlexaFluor-680偶联兔抗小鼠二抗进行检测。使用Odyssey CLx和DLx红外成像系统（LI-COR）对膜进行成像。使用ImageStudio软件（LI-COR）测定蛋白质的相对丰度。对目标蛋白的条带强度进行背景校正，随后以经背景校正的Pgk1（上样对照）进行归一化。使用GraphPad Prism 10进行单因素方差分析，并采用Tukey多重比较检验分析数据。误差线表示均值标准误。所有观测结果均相互独立。
DNA含量分析
进行DNA含量分析时，将酵母培养过夜至饱和。次日早晨，将培养物稀释至OD₆₀₀ = 0.1，并在30°C下振荡培养至OD₆₀₀ = 0.6。随后，取相当于4个OD₆₀₀单位的细胞，在室温下以10,000 × g离心收集，用1 mL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 8.0）洗涤一次，再次离心后吸去上清液。随后，将细胞沉淀重悬于3 mL TE缓冲液中，并在涡旋振荡的同时逐滴加入7 mL用TE缓冲液配制的70%乙醇中，以尽量减少细胞聚集。将样品置于4°C下以三维旋转混匀方式孵育过夜。次日早晨，将细胞在室温下以5000 × g离心，并去除上清液。随后，用1 mL TE缓冲液洗涤沉淀三次，以去除残留乙醇，再将其重悬于含0.25 µg/mL RNase（Qiagen）的1 mL TE缓冲液中，处理2
在37°C下孵育数小时以去除RNA。随后按上述方法将样品离心，并用1 mL TE缓冲液洗涤，再重悬于含0.25 µg/mL蛋白酶K的1 mL TE缓冲液中，于50°C孵育1小时。孵育结束后，按上述方法离心收集细胞，用1 mL TE缓冲液洗涤，然后加入1 mL以TE缓冲液配制的10 µg/mL碘化丙啶溶液，于4°C染色过夜。随后使用Cytek Aurora流式细胞仪分析样品，通过前向散射和侧向散射设门排除碎片和细胞聚集体。使用已知的单倍体和二倍体对照菌株校准1n、2n和4n DNA峰。每个样品至少纳入20,000个碘化丙啶（PI）阳性细胞进行分析。
经费支持
本研究获得以下资助：美国国立卫生研究院（NIH）项目R15GM111713（EMR）、NIH项目R01GM118600（RJT, Jr.）、鲍尔州立大学研究生Aspire研究资助（JAA、CGB、SLO）、鲍尔州立大学研究生院毕业综合项目完成奖学金（SLO）、鲍尔州立大学教师学者计划（SB）、鲍尔州立大学百事资助（KL），以及鲍尔州立大学生物系的资助。
致谢
感谢Randy Hampton、Toshifumi Inada、Can Kayatekin、Stefan Kreft、Susan Michaelis、Sonya Neal和Maya Schuldiner慷慨分享质粒、菌株并提供建议。感谢Lindy Caffo和Kieran Claypool协助制备或验证试剂。感谢Douglas Bernstein、Philip Smaldino、Douglas Roossien、Ashley Kalinski、Paul Venturelli以及Rubenstein实验室成员开展的有益讨论。感谢酿酒酵母基因组数据库对酵母遗传信息的整理与维护（Wong等，2023）。
已声明的资助方信息
美国国立卫生研究院
，R15GM111713
，R01GM118600
鲍尔州立大学，
缩略语
ER
内质网
IAPP
胰岛淀粉样多肽
PQC
蛋白质质量控制
TQC
转位子质量控制
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