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背景 基于纳米孔的蛋白质读取技术有望应用于单分子蛋白质组学，但对其产生的离子电流信号进行分析面临显著的计算挑战。与核酸不同，肽相关的离子信号呈现复杂模式，氨基酸之间细微的信号变化可能被噪声掩盖。我们开发了一套集成计算策略，用于处理来自合成蛋白质构建体的纳米孔蛋白质离子电流信号；这些构建体包含全部 20 种氨基酸，且序列上下文受到严格控制。我们首先进行去噪以去除伪影，随后采用可变数量和固定数量分段方法进行变点检测。结果 我们采用动态时间规整重心平均生成氨基酸特异性参考模板。同时，我们使用基于片段层级统计特征训练的双向长短期记忆网络，对氨基酸区域进行分类。20 类氨基酸分类的准确率仍然有限，而基于电荷的二分类准确率达到 93.3%。成对分类结果表明，某些氨基酸，尤其是带负电荷的残基，具有鲜明的特征信号。我们使用轮廓隐马尔可夫模型来刻画蛋白质易位过程的序列结构。结论 该方法为纳米孔肽易位离子电流数据的自动分段、分类和建模提供了计算策略。
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摘要
背景
基于纳米孔的蛋白质读取技术有望应用于单分子蛋白质组学，但分析由此产生的离子电流信号面临显著的计算挑战。与核酸不同，肽相关离子信号呈现复杂模式，氨基酸之间细微的信号变化可能被噪声掩盖。我们开发了一种集成计算策略，用于处理来自合成蛋白质构建体的纳米孔蛋白质离子电流信号；这些构建体包含全部20种氨基酸，并具有受控的序列环境。我们首先进行降噪以去除伪影，随后采用可变数量和固定数量的分段方法进行变点检测。
结果
我们采用动态时间规整重心平均法生成氨基酸特异性参考模板。与此同时，我们使用基于片段级统计特征训练的双向长短期记忆网络，对氨基酸区域进行分类。20类氨基酸分类的准确率仍然有限，而基于电荷的二分类准确率达到93.3%。成对分类结果表明，某些氨基酸，尤其是带负电荷的残基，会产生具有辨识度的信号特征。我们使用剖面隐马尔可夫模型来刻画蛋白质易位的序列结构。
结论
该方法为纳米孔肽易位离子电流数据的自动分段、分类和建模提供了计算策略。
背景
蛋白质是重要的生物分子，在人体机能中发挥关键作用。翻译后修饰、可变剪接和序列变异会产生多种不同的蛋白质形态。
这些蛋白质形态赋予蛋白质组动态且高度多样的特征，因此，单分子层面的分析对于识别变体至关重要[
1
,
2
]。仅凭基因组或转录组数据，既无法推断蛋白质组的复杂性，也无法确定其数量，因此必须直接在蛋白质层面进行分析。现有方法尚不能全面捕捉蛋白质组的全部异质性，仍有相当一部分未得到探索。单分子蛋白质测序技术[
3
]，尤其是基于纳米孔的方法[
3
–
5
]，有望通过直接读取单个完整蛋白质分子，为解决这一问题提供途径。
纳米孔已用于单分子 DNA 和 RNA 测序。在这一过程中，在酶马达的辅助下，分子逐步穿过纳米孔[
6
]。分子穿过孔道时，会以每一步都具有分子特异性的方式扰动基线离子电流。这些特征性扰动产生的信号可经解码后揭示分子的序列[
7
–
9
]。将这一概念应用于多肽面临若干根本性挑战。核酸仅含四种碱基，而肽分析则需要区分 20 种氨基酸，每种氨基酸都具有不同的理化性质[
10
]。此外，蛋白质通常处于折叠状态，具有异质且不均一的电荷、复杂的三维结构以及翻译后修饰[
11
–
14
]。
尽管存在这些挑战，纳米孔已显示出对肽中氨基酸区域的敏感性，从而可用于全长蛋白质读取等应用[
15
,
16
]。在基于纳米孔的蛋白质读取中，利用产生的指纹信号识别蛋白质，并检测其与预期信号之间的偏差[
11
]。
然而，实现从头蛋白质测序并重建蛋白质的完整氨基酸序列仍然面临挑战。
纳米孔蛋白质分析的一项根本挑战，是如何准确检测事件并对由此产生的数据进行离子电流建模[
17
]。这通过分段[
18
]实现，即识别阶梯状离子电流变化之间的边界；并通过机器学习方法（例如，使用隐马尔可夫模型（HMM）和深度学习）对离子电流片段进行建模[
19
–
21
]。对于核酸，分段方法已相当成熟，涵盖了多种方法：检测信号突变的滤波器导数法、基于似然函数对边界进行评分的贝叶斯方法，以及目前最先进的 Oxford Nanopore Dorado 移动表[
22
–
24
]。类似地，建模可采用 HMM 和 Transformer。然而，这些方法并非为肽数据设计，无法适应其复杂的离子电流模式和可变的片段长度。
在此，我们提出一种用于纳米孔蛋白质离子电流信号分析的计算策略，涵盖离子电流数据的去噪、分段、模板构建、分类和建模。我们开发了一个多阶段去噪流程，随后采用 PELT 和动态规划算法进行变点检测，并设计了适用于蛋白质信号特征的定制代价函数。完成分段后，我们提取了各片段的统计特征，并应用双向长短期记忆（LSTM）网络对氨基酸进行分类，在若干氨基酸类别上取得了良好的区分效果，并揭示了基于性质的分组规律。我们还实现了基于动态时间规整（DTW）的重心平均方法，以构建氨基酸特异性模板，并评估其判别能力。
此外，我们还探索了基于隐马尔可夫模型（HMM）的建模方法，以捕捉蛋白质转位过程中的序列依赖性。这种集成离子电流信号处理方法为纳米孔蛋白质测序数据的分析奠定了基础。
方法
纳米孔肽数据概述
Motone 等人利用商用 Oxford Nanopore 设备开发了一种用于单分子分析长肽链的策略[25]（图 1）。简而言之，肽链被加载到纳米孔阵列中（图 1A），并在电泳力作用下穿过纳米孔（图 1B）。这些肽构建体含有一个阻断结构域，可防止其完全穿过孔道。随后，利用 ClpX 马达的转位酶和解折叠酶活性，以酶促棘轮机制驱动肽链逐步转位。由 ClpX 介导的转位速度较慢，并可产生具有良好重复性的离子电流信号（图 1C）。他们构建了称为 PASTORS（Proteins for Amino Acid Sequencing Through Optimized Regions，经优化区域进行氨基酸测序的蛋白质）的不同蛋白质构建体，以证明离子电流数据能够达到氨基酸水平的分辨率。每个构建体均由五个重复的序列区块（可变区）组成，每个区块长 59 个氨基酸，其基础序列由甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和谷氨酸构成（图 1D）。每个区块的中心位置引入一个独特的氨基酸，并在各区块之间插入两个酪氨酸（YY），从而为下游分析提供具有区分度的离子电流边界信号。这种策略性设计使得研究人员能够在单条蛋白质链中分析五种独特的氨基酸。研究人员合成了八种 PASTOR 变体，使全部 20 种氨基酸均能以两种序列背景出现在这些构建体中。PASTOR 的命名依据是其中包含的氨基酸组合。这种方法使得】【。
以可控且系统的方式研究氨基酸性质。对 PASTOR 的分析得到具有重复模式的离子电流轨迹。这些模式归因于 7 个 YY 区域，在信号中表现为重复出现的下凹（图 1D）。在这些下凹之间，离子电流信号中可观察到 5 种独特且可重复的变化，分别对应每个可变区（VR）中的特定氨基酸替换。这为研究这些可变区开辟了新的途径，使我们能够分析与单个氨基酸变异相关的离子特征。
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图 1.
利用 ClpX 马达辅助易位和 PASTOR 构建体进行基于纳米孔的蛋白质读取。
A.
纳米孔蛋白质测序流程示意图。构建体包含用于 ClpX 马达识别的 N 端 ssrA 标签、阻断结构域以及 PASTOR 序列。左：开放孔状态，离子电流基线较高。第二幅：非酶促电压驱动的易位，蛋白质快速穿过纳米孔。第三幅：酶促马达驱动的易位，ClpX 马达（橙色六聚体）捕获并解折叠蛋白质，随后以受控的步进方式将其推动穿过纳米孔，从而产生较慢且重复性更高的离子电流。右：完全易位后恢复至开放孔状态。Cis 和 Trans 表示由含有纳米孔的膜分隔的两个腔室。
B.
代表性的离子电流轨迹，显示完整的易位事件。轨迹始于开放孔基线；蛋白质被捕获时，电流迅速下降；酶促易位过程中，电流维持在较低水平；随后恢复至基线。时间以秒为单位，电流以皮安（pA）为单位。
C.
酶促易位阶段的放大视图（图 B 中的橙色方框），显示蛋白质通过纳米孔时特征性的信号波动。
D.
PASTOR 构建体的结构。每个 PASTOR 均包含五个可变区，各可变区之间由酪氨酸-酪氨酸（YY）标记隔开（信号中的 5 个下凹区）。可变区长 59 个氨基酸，以甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和谷氨酸（G、S、D、E）组成的核心序列为基础构建。每个可变区的中心位置均设有一个独特的氨基酸（X，以红色显示）。构建体两侧均含有 29 个残基的连接序列。
计算策略概述
我们开发了一种集成计算策略，用于处理这些合成多肽构建体的纳米孔蛋白质离子电流信号；这些构建体在受控序列背景下包含全部 20 种氨基酸（图 2）。
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图 2.
用于处理纳米孔蛋白质离子电流信号的计算策略概述。
数据预处理、去噪与边界指派
从 FAST5 文件中提取原始离子电流信号，并对每条 PASTOR 轨迹进行三轮连续去噪；每轮均使用 Huber 回归重建信号，并排除被标记的样本。第一轮采用孤立森林算法识别点异常，并替换异常分数超过污染阈值的样本。第二轮采用全变差（TV）去噪抑制高频噪声；其对信号梯度施加的 L1 范数惩罚有助于得到分段常数解，从而保留下游分段所依赖的陡变。最后一轮采用连续小波变换（CWT）分析，标记残余电流“尖峰”中的……
信号，即超过中位数 0.25 倍中位数绝对偏差（MAD）的点。随后，沿两个方向各进行一个样本点的膨胀，以扩展每个已识别的点，再进行重构。三次处理所用的参数见补充表 S1。
通过定位酪氨酸-酪氨酸（YY）标记来确定可变区边界；这些标记会在离子电流轨迹中产生特征性信号低谷。确定每个 YY 低谷中的绝对最小值，并将其指定为相邻可变区之间的新边界点。
分段策略
我们采用离线变点检测算法，识别离子电流信号中对应氨基酸转位事件转换的边界。这些算法通过识别信号特征发生变化的点，将时间序列数据划分为具有不同统计特性的片段。变点检测方法包含两个关键组成部分：用于确定候选变点评估与选择方式的搜索方法，以及用于量化拟议分段质量的代价函数。我们评估了多种分段方法，包括二分分段、基于窗口的分段和自底向上分段，并重点考察了两种能够在不同轨迹中产生可重复分段数量的方法：修剪精确线性时间（PELT）和动态规划（Dynp）。
修剪精确线性时间（PELT）分段
PELT 是一种基于优化的算法，通过最小化整个信号上的代价函数来确定最优变点集合。该算法评估潜在的分段方案，并在搜索过程中及早剪除次优解，因此能够高效处理较长信号。PELT 确定变点的数量。
根据控制检测到的变点数量与分段质量之间权衡的惩罚参数，自动确定变点。该算法通过求解一个优化问题，最小化各段代价之和与变点数量惩罚项之和。数学上，该问题旨在对所有可能的变点数量 \(K\) 及其位置 \(\{t_k\}\) 进行优化，以最小化 \(\sum_{k=1}^{K+1} C(y_{t_{k-1}:t_k})+\beta K\)。其中，\(C(y_{t_{k-1}:t_k})\) 表示相邻变点 \(t_{k-1}\) 与 \(t_k\) 之间数据段的代价，\(\beta\) 为惩罚参数，\(K\) 为变点总数。惩罚项 \(\beta\) 直接控制分段的灵敏度：较高的取值会通过惩罚每个额外变点，产生更少且更长的分段；较低的取值则允许更精细的分段。在本研究中，我们采用了惩罚值 5，最小段长为 30 个数据点。
动态规划（Dynp）分段
动态规划提供了另一种方法，但需要指定变点的确切数量。Dynp 通过穷举评估各分段配置，确定固定数量断点的最优位置。该算法最小化所有分段的总代价。具体而言，它对所有变点位置 \(\{t_k\}\) 进行优化，以最小化 \(\sum_{k=1}^{n+1} C(y_{t_{k-1}:t_k})\)，其中求和范围为 \(k=1\) 到 \(n+1\)，\(n\) 为指定的断点数量。在需要对不同信号保持一致的分段数量以便进行比较分析时，我们采用了此方法。
代价函数设计
变点检测的性能取决于代价函数；代价函数用于量化各段内部的同质性以及各段之间的差异。我们开发了一种
针对我们的蛋白质离子电流数据定制的基于方差的代价函数。该代价函数计算每个片段内的方差，以衡量信号异质性（补充算法 1）。它通过减去信号均值使信号中心化，然后计算中心化信号及其平方值的累积和，以便计算片段代价。尺度参数用于对方差进行乘数调整，从而调节代价相对于惩罚项的大小。最小片段长度（m=30）通过禁止过短片段来防止过度分段。该代价函数倾向于将变点置于信号方差发生变化的位置。
动态时间规整与重心平均
分段后，我们采用具有固定断点数量（n_bkps = 34）的动态规划，将所有轨迹统一处理为恰好 35 个片段。统一片段数量是通过重心平均构建代表性氨基酸模板所必需的。对于每类氨基酸，使用 z 分数标准化对分段后的轨迹进行归一化。随后，采用线性插值将每个片段插值为固定长度的 80 个数据点，以确保对齐时各片段具有相同的维度。
DTW 重心平均（DBA）
为构建各类氨基酸的代表性模板，我们采用 DTW 重心平均（DBA）。DBA 计算一个质心序列，使其到该集合中所有其他数据的 DTW 距离平方和最小。与简单平均不同，DBA 会迭代地优化初始估计：将所有数据与当前质心估计对齐，计算对齐后的均值，并据此更新质心。对于每种氨基酸，我们将所有轨迹堆叠成一个三维数组。DBA 算法计算了该数组的重心。
维度保持一致（35 个片段 × 80 个点），从而生成一条具有代表性的单一轨迹，以捕捉该氨基酸在所有观测到的转运事件中的典型离子电流模式。
动态时间规整距离度量
动态时间规整（DTW）通过寻找最优对齐方式，使匹配点之间的累积距离最小化，从而量化两条时间序列之间的相似性。DTW 允许灵活地进行时间对齐，因此能够将形状相似但速度或相位不同的片段识别为相似。这一特性对于纳米孔信号尤为重要，因为同一种氨基酸的转运速率可能略有不同。对于长度分别为 *m* 和 *n* 的两个片段 *A* 和 *B*，DTW 构建一个代价矩阵 *C*，其中每个元素 *C(i,j)* 表示点 *A(i)* 与 *B(j)* 之间的距离。该算法通过动态规划计算累积代价矩阵，其中每个单元格累积来自三个可能前驱单元格的最小代价。通过回溯从位置 (*m,n*) 到 (*1,1*)，可得到该矩阵中的最优对齐路径，该路径定义了 *A* 中的哪些点与 *B* 中的哪些点相对应。最终的 DTW 距离为该路径上的累积代价，并按路径长度归一化，以消除片段长度差异的影响。我们采用长度归一化 DTW，以便对持续时间不同的片段进行公平比较。原始 DTW 距离除以待比较两个片段长度的平均值：归一化代价 = DTW(*A*, *B*) / [(len(*A*) + len(*B*)) / 2]。
对齐可视化与质量指标
为评估某一类别的重心轨迹与该类别其他轨迹之间的对齐质量，我们实现了一种 DTW 可视化与量化策略。对于每次比较，固定为 35 个片段的重心轨迹与长度可变的测试轨迹被
经 z-score 标准化后，计算片段级代价矩阵，其中元素 (i, j) 表示重心片段 i 与测试片段 j 之间的 DTW 距离。采用动态规划确定最优对齐路径，并从最终累积代价回溯，以确定各重心片段与哪些测试片段对齐。通过三个指标量化对齐质量。DTW 总代价是最优对齐路径上各片段级代价之和，表示序列间的累积差异。每对片段的平均代价通过将总代价除以路径长度进行归一化。对角线平均偏差用于量化时间扭曲程度，计算方法为对路径上所有位置 (i, j) 的绝对差值 |i - j| 取平均，其中 i 为重心片段索引，j 为测试片段索引。偏差值较低表示序列对齐较为顺序化，时间扭曲程度较小；偏差值较高则表示为实现最优对齐，需要对片段进行较大幅度的重排。
成对的类间／类内分离度
为量化每个重心区分其所属类别与其他类别的能力，我们计算了全部 20 个类别之间的成对分离比。对于每一组重心—类别组合，我们计算该重心与该类别所有轨迹对齐时的对角线偏差中位数。类内偏差表示重心与其所属类别轨迹之间的对齐偏差中位数；类间偏差则表示重心与另一类别轨迹之间的对齐偏差中位数。分离比定义为类间偏差除以类内偏差。分离比大于 1.0 表示，其他类别的轨迹需要更大程度的时间扭曲。
与来自质心所属类别的轨迹相比，来自另一类别的轨迹与该质心的对齐程度更高，表明这两个类别具有可区分的对齐特征。比值接近或低于 1.0 表明两个类别与该质心的对齐程度相近，意味着区分能力较弱。该分析生成了一个 20×20 的非对称矩阵，其中条目 (i,j) 表示质心 i 将其所属类别与类别 j 区分开的能力。
氨基酸区域的深度学习分类
完成可变数量分段后，我们从每个片段中提取统计特征，以表征该片段内的离子电流分布。每个片段计算八项特征：偏度、峰度、标准差、最大电流、最小电流、中位数电流、平均电流，以及以数据点计的片段长度。这些特征为每个片段的统计属性提供了数值表示。
LSTM 分类器架构
我们采用双向长短期记忆（LSTM）网络，根据分段后的离子电流轨迹对氨基酸区域进行分类。每条轨迹表示为一个特征向量序列，其中每个向量包含一个片段的统计特征。网络架构由两层双向 LSTM 组成，每个方向包含 64 个隐藏单元，后接全连接分类头。双向设计沿时间正向和反向处理序列，从而捕获轨迹中不同位置片段之间的依赖关系。LSTM 层采用 30% 的 dropout 进行正则化。两个方向的最终隐藏状态拼接后，输入一个两层全连接网络：第一层包含 128 个单元，采用 ReLU 激活函数和 30% 的 dropout；随后接入一个包含 20 个单元的输出层，用于对氨基酸进行分类。
类别。模型通过使用打包序列处理片段数量不等的轨迹，从而支持变长序列输入。
训练方案与模型评估
我们采用分层五折交叉验证评估分类性能。在每一折中，使用训练集计算与类别频率成反比的类别权重，并将其应用于交叉熵损失函数，以避免模型偏向出现频率较高的氨基酸。模型使用 AdamW 优化器训练 100 个周期，学习率设为 0.001，权重衰减设为 0.0001。梯度裁剪的最大范数设为 1.0，以防止梯度爆炸。当验证损失连续三次评估未改善时，学习率降低 50%。序列以批次大小 32 进行处理，并通过填充使每个批次中的轨迹长度保持一致。对于每一折，我们记录验证集预测结果和类别概率。所有折训练完成后，汇总预测结果，计算总体分类指标，包括各类别准确率、混淆矩阵、分类报告，以及采用一对其余二值化方法计算的多分类 ROC-AUC 曲线。
成对分类
为评估模型区分特定氨基酸对的能力，我们针对 20 种氨基酸的所有可能两两组合（共 190 对）训练了二分类器。对于每一对，仅提取属于这两类的轨迹，并将其重新标记为二元目标。每个成对分类器均采用相同的 LSTM 架构，但输出层包含 2 个单元。训练采用分层的 80/20 训练集—测试集划分，以保持类别平衡。模型使用类别平衡的交叉熵损失训练 100 个周期。成对分类准确率为
编译为一个对称的 20×20 矩阵。
隐马尔可夫模型
我们使用 Yet Another Hidden Markov Model（YAHMM）软件包为每个类别构建一个轮廓隐马尔可夫模型。该软件包支持同时包含发射状态和静默状态的轮廓架构，并允许设计线性拓扑。模型由四种状态类型组成：
匹配状态
在每个位置，发射值服从高斯分布，其均值为该位置的 DBA 片段均值，方差为该位置各条轨迹间的叠加方差。
跳过状态
此类状态为静默状态，可使路径前进至下游匹配状态而不产生发射，用于表示查询轨迹相对于轮廓中缺失的事件。
滑移状态
此类状态为静默状态，可使路径返回至上游匹配状态，用于表示重复或缺失的事件；当 ClpX 瞬时释放链并使其经电泳作用重新穿入时，预期会出现这类事件。
插值状态
可插入插值状态（例如插入状态），其发射参数取相邻轮廓状态参数的平均值。此外，匹配状态还允许自循环。将轨迹长度限制在四分位距范围内，然后按 60/40 的比例划分为轮廓构建集和推断集。使用 Viterbi 解码对每条留出轨迹与所有模型进行评分；将片段均值相对于匹配状态高斯分布的得分作为单变量对数优势，并将轨迹归入得分最高的模型。分类性能在成对比较和属性组层面均进行了评估。保留 Viterbi 回溯结果，以便检查候选回滑事件。
结果
准确分段始于有效的信号预处理。原始纳米孔轨迹含有高频噪声，可能掩盖真实的生物学转变。我们开发了一种多阶段去噪策略，可去除这些伪影，同时保留信号边界
这对于检测氨基酸转换至关重要。经过去噪处理后，分段算法可将轨迹划分为对应不同易位状态的区域。我们实现了两种互补的分段方法：可适应易位动力学自然异质性的可变分段方法，以及生成下游建模所需均一输出的固定分段方法。
原始离子电流信号的预处理、去噪与边界判定
从 FAST5 文件中提取原始离子电流信号，共获得 670 条 PASTOR 轨迹（见方法），每条轨迹均包含五个特征性可变区域，区域之间由酪氨酸-酪氨酸（YY）边界标记分隔（图 3A 展示了 PASTOR HDKER 的一条原始轨迹示例）。我们采用多阶段去噪策略清理信号（见方法）。通过确定每个 YY 电流谷值的中点来判定可变区域边界（图 3B），从而确保完整捕获相邻信号区域。由此共获得 3352 个可变区域，中位长度为 2727 个点。为确保数据质量，我们剔除了长度低于第 5 百分位数（1751 个点）和高于第 95 百分位数（4570 个点）的轨迹，最终保留 2987 条轨迹用于后续分段。
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图 3.
纳米孔蛋白质读出中的离子电流信号处理策略。
A.
PASTOR HDKER 通过纳米孔时的原始离子电流轨迹（通道 1）。蛋白质易位过程中，信号呈现特征性波动；可变区域之间的酪氨酸-酪氨酸边界标记对应明显的电流谷值。电流单位为皮安（pA），时间单位为毫秒（ms）。
B.
采用去噪策略处理后的信号。红色虚线标示五个可变区域的边界，腰部
各区域分别以其中心氨基酸（H、D、K、E、R）标记。蓝色方框标出后续分析步骤所用的 D 区域。
C.
使用动态规划分段的固定分段方法。D 区域信号被划分为恰好 35 段（以交替颜色显示）。这样可确保所有轨迹的分段数量一致，这是构建重心所必需的。X 轴表示样本索引；Y 轴表示离子电流，单位为 pA。
D.
使用 PELT 分段的可变分段方法。根据检测到的信号变化点对同一 D 区域进行分段，共得到 38 段。彩色带表示各个分段。X 轴表示样本索引；Y 轴表示离子电流，单位为 pA。
离子电流信号分段
考虑到多肽穿过孔道前庭的过程预期呈现可变的阶梯式推进，我们采用变化点检测算法，识别离子电流信号中对应于氨基酸转运事件转换的边界。我们应用了两种变化点检测方法：用于可变数量分段的 PELT，以及用于固定数量分段的动态规划（Dynp）（见方法部分）。
可变数量分段
采用 PELT 分段，在每条轨迹中识别不同电流水平之间的边界。氨基酸 D 的分段示例见图 3D。
在所有轨迹中，PELT 产生的分段数中位数为 35（补充图 1A 显示了所有可变区域的分段数分布）。正如纳米孔转运过程中固有的时间变异性所预期的，较长的轨迹产生的分段较多，而较短的轨迹产生的分段较少（补充图 1B 显示了分段数与轨迹长度的二维直方图；
Spearman ρ = 0.51，p < 10⁻¹⁹⁵），表明轨迹长度与分段数量之间存在中等程度的正相关。尽管轨迹长度可解释约 30% 的分段数量方差（Pearson r² ∼ 0.31），但这种中等程度的相关性表明，PELT 分段可能捕捉到离子电流信号中超越单纯按比例将较长轨迹划分为更多片段的结构特征。这说明，信号质量、氨基酸组成以及转位动力学中的生物学变异等其他因素，也会影响分段边界的确定。
八种独特 PASTOR 构建体的分段数量分布一致（补充图 1.C），表明分段具有一致性和可重复性。对同一构建体内及不同构建体间轨迹的目视检查也证实了分段的一致性（补充图 2 和图 3 展示了八种 PASTOR 中全部五个氨基酸区域的分段结果，以及同一 PASTOR 类别中的三条示例轨迹）。此外，35 个分段的中位数与已报道的马达蛋白平均每次转位跨越 2 个氨基酸相吻合。
固定数量分段
对于需要固定长度特征向量（参考谱）的下游方法，我们采用动态规划（Dynp）分段，并使用基于 PELT 分析得出的分段数量中位数（35）。使用 34 个断点和自定义的基于方差的代价函数（见方法），Dynp 对所有轨迹均准确生成 35 个分段（图 3C 展示了氨基酸 D 的示例）。
基于 DTW 重心的对齐在氨基酸区域分离中的表现
为每种氨基酸类别构建具有代表性的模板，我们采用 DTW 重心平均法构建重心，基于……
Dynp 分段轨迹。对所有轨迹进行 z-score 标准化，以去除基线差异，同时保留各分段内的电流变化。将每个分段插值至 80 个数据点，以确保对齐时维度一致（见方法）。通过这一流程生成了 20 个重心，每种氨基酸对应一个（图 4A 展示了氨基酸 D 的重心；补充图 4 展示了所有 20 个重心叠加后的结果）。
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图 4.
类内和跨类别比较的 DTW 重心对齐。
A.
氨基酸 D 的重心（上）与一条来自 PASTOR HDKER、通道 1 的 D 单体轨迹（下）之间的 DTW 对齐；两个信号均经过 z-score 标准化。该重心表示根据多条轨迹计算得到的氨基酸 D 的平均信号模式。灰色连线表示根据最优 DTW 路径，两条序列中相互对齐的分段。代价矩阵热图（右）显示分段级 DTW 距离，红线表示最优对齐路径。每段平均 DTW 代价 = 1.20，路径相对于对角线的偏离 = 1.89。
B.
氨基酸 H 的重心（上）与 A 面板中同一条 D 单体轨迹（下）之间的 DTW 对齐。代价矩阵显示分段级 DTW 距离，红线表示最优对齐路径。平均 DTW 代价 = 1.56，路径偏离 = 4.37。氨基酸 H 的重心（上）与一条来自 PASTOR HDKER、通道 1 的 H 单体轨迹（下）之间的 DTW 对齐；两个信号均经过 z-score 标准化。代价矩阵显示分段级 DTW 距离，红线表示最优对齐路径。平均 DTW 代价 = 2.39，路径相对于对角线的偏离 = 0.82。
为评估重心区分氨基酸类别的能力，我们通过比较……计算了成对分离比。
类内距离（重心与同类轨迹之间的距离）与类间距离（重心与异类轨迹之间的距离）。以路径偏差作为度量时，90%的氨基酸对呈现出大于1的分离比，中位数为1.27（补充图5A展示了完整的分离矩阵；补充图5B展示了其分布）。分离效果最佳的氨基酸对的分离比超过2，包括D重心与C轨迹（2.22）、D重心与E轨迹（2.01），以及若干涉及L、P、V和W重心的配对。这些较高的分离比表明，与同类比对相比，跨类别轨迹需要进行显著更多的时间扭曲，才能与错误的重心对齐，从而证明了模板的判别能力。相反，分离效果较差的配对所表现出的分离比接近或低于1.0，尤其涉及性质相近的氨基酸。例如，E重心与D轨迹（0.79）以及C重心与A轨迹（0.91）表明二者在对齐特征上存在重叠。分离分析显示，尽管许多氨基酸对表现出明确的基于重心的判别能力，但理化性质相似的残基之间仍存在系统性的重叠。
对DTW对齐结果的目视检查揭示了重心与轨迹之间的对应关系。类内对齐（重心与来自同一氨基酸类别的轨迹之间的对齐）通常表现为接近对角线的对齐路径，并伴随中等程度的代价。例如，将D重心与D轨迹进行对齐时，平均DTW代价为1.20，路径偏差为1.89（图4A）；而将H重心与H轨迹进行对齐时，平均代价为2.39，偏差为0.82（图4C）。这些指标在不同氨基酸类别之间有所变化，反映了各类别内部的差异。跨类别对齐（将一个氨基酸的重心与另一氨基酸的轨迹进行对齐】【。
（来自不同氨基酸）表现出不同的对齐特征。将 H 重心轨迹与 D 轨迹对齐后，平均代价为 1.56，但路径偏差显著更高，达到 4.37（图 4B）。尽管 DTW 的灵活匹配特性使任意两条序列之间都可以进行对齐，但与类内对齐相比，跨类别比较的代价更高、路径偏差更大，或两者皆有。这表明，不同类别的离子电流信号差异可能足以导致其与其他类别的轨迹对齐时产生更高的代价。然而，类内与跨类别对齐的代价和偏差分布存在重叠，这说明对于某些氨基酸对，仅凭 DTW 指标的类别判别能力有限。
这些观察结果促使我们探索隐马尔可夫模型方法。该方法显式地对序列依赖关系和类别特异性发射特征进行建模，而非仅依赖模板距离指标。
基于 LSTM 的氨基酸区域分类
为评估片段级特征的判别能力，我们基于 PELT 分段后的轨迹提取统计特征，并训练了一个双向 LSTM 分类器。每个片段计算了八项归一化特征：偏度、峰度、标准差、最大值、最小值、中位数、均值和片段长度。随后，将这些特征序列输入一个双层双向 LSTM 网络，每个方向包含 64 个隐藏单元，并接入全连接分类头（见方法）。
20 类多分类
对全部 20 种氨基酸进行五折交叉验证，平均准确率为 20.7% ± 2.9%，高于 5% 的随机水平（补充表 S2 展示了总体及各类别的分类指标，包括精确率、召回率和 F1 分数）。训练动态
在所有数据折中均表现出一致的收敛趋势，验证损失在约 70 个训练轮次后趋于平稳（补充图 6 展示了具有代表性的训练曲线）。在 100 个训练轮次内，验证准确率从约 5% 逐步升至约 25%，并在训练后期趋于稳定。自适应学习率调度器将学习率从 10⁻³ 降至约 10⁻⁶，从而实现精细优化。训练曲线与验证曲线紧密贴合，表明模型性能受限于可区分信息，而非过拟合。
不同氨基酸类别的分类表现差异显著（补充图 7A 展示了全部 20 类的 ROC 曲线；补充图 7B 展示了混淆矩阵）。氨基酸 D 的单类别准确率最高，为 81%，ROC AUC 为 0.97，表明其离子电流特征具有很强的独特性。氨基酸 E（准确率 54.1%，AUC = 0.93）和 R（准确率 47.2%，AUC = 0.88）的分类表现也较好。氨基酸 A 的准确率为 41.4%，AUC 为 0.85，尽管召回率中等，但仍具有良好的可区分性。相比之下，若干氨基酸的单类别准确率明显较低，包括 C（1.5%）、I（4.1%）、V（5.8%）和 N（6.0%）。混淆矩阵显示，误分类并非随机发生，而是集中在理化性质或尺寸特征相似的氨基酸之间。例如，属于相同尺寸类别或极性组的氨基酸更容易相互混淆，这表明这些性质会以相互重叠的方式影响离子电流模式。
两两分类
为进一步评估特定氨基酸对之间的区分能力，我们针对全部 190 种可能的两两组合训练了二分类器。
（图 5 展示了两两分类准确率热图）。两两分类准确率介于 49.0% 至 100% 之间，平均约为 75%，高于 20 类分类的性能。这表明，尽管同时区分全部 20 种氨基酸颇具挑战，但许多氨基酸对仍可轻易区分。
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图 5.
两两 LSTM 分类。
针对 PELT 分段后的轨迹中的每个片段，计算八项统计特征（标准差、均值、中位数、最大值、最小值、持续时间、偏度、峰度）。随后将这些特征序列输入双向 LSTM 网络进行分类。A. 热图显示全部 20 种氨基酸之间的两两分类准确率（共 190 组比较）。深蓝色表示准确率较高，较浅的蓝色表示准确率较低。
氨基酸 D 的两两区分能力尤为突出：与其余 19 种氨基酸中的 15 种相比，分类准确率超过 93%；与 M、T、V 和 Y 的区分准确率则达到 100%。类似地，氨基酸 E 与另外 14 种氨基酸的分类准确率超过 85%，对带电氨基酸和大分子氨基酸的区分能力尤其强（与 D 相比超过 94%，与 R 相比超过 98%）。带电氨基酸 R 的两两分类表现也较为稳健：与另外 11 种氨基酸相比，分类准确率超过 86%。若干氨基酸对的区分准确率接近完美，包括 D 与 M（100%）、D 与 T（100%）、D 与 V（100%）、D 与 Y（100%）以及 E 与 R（98.3%）。这些高准确率表明，某些氨基酸会产生高度独特的转位特征，即使处于不同的序列上下文中，也能被稳定识别。相反，一些氨基酸对的区分能力较弱，尤其是性质相似的氨基酸。例如，C 与 F（49.0%）、C 与 L（52.5%），以及
F 与 L（52.5%）的分类表现接近随机水平，这与二者共有的疏水特性和相似的分子体积一致。成对混淆热图显示，小型非极性氨基酸之间以及中等大小氨基酸之间存在聚集的混淆现象，反映出仅依据离子电流，难以区分生物物理性质相近的氨基酸。
这些结果表明，尽管某些氨基酸会产生高度特征化的信号，从而实现稳健分类，但要提高对相似氨基酸的区分能力，可能需要扩充训练数据集、优化构建体设计以增强信号多样性，并可能整合额外的信号特征或相邻氨基酸的上下文信息。
基于性质的多组分类
为评估基于理化性质对氨基酸进行分组是否比逐一识别氨基酸更有利于实现稳健分类，我们针对按电荷、大小和极性特征定义的氨基酸组训练了 LSTM 分类器。
基于电荷的分类
在所有多组分类任务中，将带正电荷的氨基酸（K、R、H；n=387）与带负电荷的氨基酸（D、E；n=267）进行二分类，取得了最高的性能；五折交叉验证的平均准确率为 93.3% ± 1.3%（详细指标见补充表 S3）。该分类器对两类均表现均衡，正确识别出 93.0% 的带正电荷氨基酸和 93.6% 的带负电荷氨基酸。ROC 分析得到的 AUC 为 0.963，表明依据电荷性质可实现近乎完全的区分（ROC 曲线和混淆矩阵见补充图 8.A）。这表明电荷的存在可能与具有区别性的乐队相关
模型可检测的离子电流特征。
扩展为三分类后，将氨基酸分为带正电（K、R、H）、带负电（D、E）和中性（其余15种氨基酸；n=2,333），准确率达到70.0% ± 1.9%（补充表S4）。带负电氨基酸的召回率仍然较高（88%）；带正电氨基酸的准确率为65.6%，精确率中等（31%）。中性类别尽管占样本的78%，准确率达到68.7%，但经常与带电氨基酸混淆（补充图8.B展示了混淆矩阵）。多分类ROC分析的宏平均AUC为0.852，其中带负电氨基酸的区分能力最强（AUC = 0.950），其次为中性氨基酸（AUC = 0.814）和带正电氨基酸（AUC = 0.793）。补充图8.B展示了一对其余ROC曲线。
基于尺寸的分类
基于分子尺寸进行五分类，将氨基酸分为极小（G、A、S）、小（C、D、N、P、T、V）、中等（E、I、L、Q）、大（H、K、M、F）和极大（R、W、Y），准确率达到36.0% ± 1.6%（补充表S5）。不同尺寸类别的分类表现差异显著：极小氨基酸的准确率最高，为75.7%，且召回率较高（76%）。极大氨基酸的准确率为56.4%，召回率为56%。相比之下，中等尺寸氨基酸的准确率仅为8.2%，大多数误分类分散在相邻尺寸类别中（补充图8.C展示了混淆矩阵）。这一结果表明，尺寸差异极大时会产生可区分的信号，而中等尺寸则会形成相互重叠的电流分布。宏平均ROC AUC为0.715，其中极小（AUC = 0.831）和极大（AUC = 0.832）类别表现出最强的区分能力。
补充一级特黄大片
图8.C展示了基于大小的ROC曲线。
基于极性的分类
按极性进行四分类（非极性〔A、G、I、L、M、F、W、P、V〕、极性〔S、T、N、Q、C、Y〕、正电性〔K、R、H〕和负电性〔D、E〕）的准确率为49.5% ± 1.5%（补充表S6）。负电性氨基酸的分类准确率再次为各类别中最高（88.0%），且精确率与召回率较为均衡（F1 = 0.70）。非极性氨基酸的准确率为60.0%，精确率与召回率均衡（F1 = 0.60）。然而，极性氨基酸的表现明显较差（准确率16.4%，F1 = 0.23），且经常被误分类为非极性氨基酸，这表明这两类氨基酸的信号特征存在重叠。正电性氨基酸的准确率为65.1%，召回率（65%）高于精确率（32%），说明模型倾向于过度预测该类别。宏平均ROC AUC为0.747，其中负电性氨基酸的区分效果最佳（AUC = 0.953）。
补充图8.D展示了基于极性的ROC曲线和混淆矩阵。
这些结果表明，氨基酸电荷所产生的离子电流特征具有最高的区分度，其次是显著的大小差异。在所有分类方案中，带负电荷的氨基酸（D、E）始终表现优异；这与它们在20分类任务中呈现的较高单类分类准确率一致，说明这些氨基酸会产生具有独特可识别性的易位模式。中间类别（中等大小、极性）的表现一般，反映出区分理化性质相近氨基酸的难度；这一点与成对分类结果相符。
隐马尔可夫建模
我们采用轮廓隐马尔可夫模型来捕捉序列的】【。
在假设蛋白质易位具有固定步长的前提下进行建模（补充图 9）。隐马尔可夫模型（HMM）为刻画逐步运动机制提供了自然的建模框架，可显式表示状态转移和氨基酸特异性发射特征。对状态转移进行建模，使 HMM 能够描述马达或链段的易位力学过程，例如马达回滑或孔道中的停滞。这种概率方法将生物学约束的显式建模与深度学习的模式识别优势相结合。为确保模型稳健，我们将数据集限制为所有轨迹长度处于四分位距（IQR）范围内的干净子集。分类在氨基酸两两比较层面（补充图 10）和结构域层面分别进行，以便与 LSTM 直接比较。
在最粗粒度的层面上，对带正电和带负电残基进行二分类，准确率达到 83.9%（图 6A，左）。对维特比路径回溯结果的目视检查显示，两类之间区分明显：某个氨基酸与其自身模型的匹配得分（H，对数概率 = −199.1）显著高于其与相反电荷类别模型的匹配得分（D，对数概率 = −347.4）（图 6A，右）。将分类扩展为按电荷类别进行三分类（正电、负电和中性）后，准确率仍达到 72.7%（图 6B，左）。路径回溯结果显示，将中性氨基酸与带负电模型进行比较会产生较大偏差（D，对数概率 = −73.3）；而与带正电模型比较时，区分度较低（H 和 V 的对数概率分别为 −34.2 和 −25.8）。
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图 6.
隐
Markov 模型推断。
A. 左：
基于电荷的二分类（正电荷 vs. 负电荷）。混淆矩阵展示带正电荷的氨基酸（K、R、H；n=28）与带负电荷的氨基酸（D、E；n=34）的分类结果。数字表示各类别中的样本数和预测数，颜色越深表示数量越多。
右：
氨基酸 H（带正电荷）与其自身模型（绿色）的模型遍历，以及 H 与氨基酸 D（带负电荷，红色）的模型遍历。x 轴为序列谱中的匹配状态索引，y 轴为片段索引。沿对角线移动表示模型在给定状态匹配并向前推进至下一个状态。向左移动表示“回退”（backslip），即模型退回到先前的匹配状态以匹配某个片段。向右移动则相反，表示“跳过”（skip），即模型跳过若干匹配状态，以匹配下游状态。
B. 左：
基于电荷的三分类（正电荷 vs. 负电荷 vs. 中性）。混淆矩阵展示带正电荷的氨基酸（K、R、H；n=28）、带负电荷的氨基酸（D、E；n=34）以及中性氨基酸（其余 15 种氨基酸；n=224）的分类结果。
右：
氨基酸 V（中性）与其自身模型（绿色）的模型遍历，以及 V 与 H（带正电荷，红色）和 D（带负电荷，蓝色）的模型遍历。
C. 左：
基于极性的四分类。混淆矩阵展示按极性进行的分类：非极性（A、G、I、L、M、F、W、P、V；n=139）、极性（S、T、N、Q、C、Y；n=85）、正电荷（K、R、H；n=28）和负电荷（D、E；n=34）。
右：
氨基酸 P（非极性）与其自身模型（绿色）的模型遍历，以及 P 与 H（带正电荷，红色）、D（带负电荷，蓝色）和 T（极性，橙色）的模型遍历。
按极性分类时，准确率为 46.5%（图 6C，左）。非极性氨基酸脯氨酸表现出不同的回溯轨迹，相较于
带负电荷的模型（D，log probability = −75.7）与带正电荷的模型（P，log probability = −29.5）以及极性残基（T，log probability = −29.9）的对数概率几乎相同，说明了非极性类别与极性类别之间产生混淆的原因。
我们注意到，按大小分类会使准确率降至 35.0%（补充图 11，左），这反映出区分主要在大小而非电荷或极性方面不同的残基更加困难。回溯分析也印证了这一难点：一种极大的氨基酸（W，log probability = −37.4）产生的回溯路径与大残基类别（H，log probability = −57.6）相似，但与中等大小（E，log probability = −83.0）、小（D，log probability = −79.2）和极小（S，log probability = −82.6）类别的差异更为明显（补充图 11，右）。
这些结果表明，尽管 profile HMM 的准确率略低于非线性 LSTM，但其在结构域层面的表现相当，同时还能提供一个可解释的转位过程生成模型。
利用 profile HMM 分析可能的回滑事件
除分类外，profile HMM 还提供了一种可解释的线性模型，其维特比路径回溯可直接可视化（如上所示），也可用于进一步分析。我们利用该模型分析转位过程中可能发生的回滑事件。模型的状态架构（补充图 9）既支持跳跃转移（类似于常规多序列比对（MSA）HMM 中的删除事件），也支持回滑转移（类似于插入事件）。此外，该模型允许匹配状态发生自环，并且可以插入
其发射参数由相邻侧翼 profile 状态推导得到的插值状态。该设计旨在捕捉孔道层面的事件，例如 ClpX 酶使肽链瞬时脱离孔道，随后该链在电泳作用下重新穿入孔道。这些行为的示例见图 7。
在 profile 状态 26 和 27 之间（图 7A），回溯路径显示出典型的回滑特征：解码路径先前进至下游状态，随后返回上游状态，从而在离子电流空间中产生明显的反向变化。在图 7B 中也可以观察到相关模式，其中 profile 状态 11 最初被跳过，但在状态 13 之后发生回滑时又被访问。
补充图 12 展示了一条轨迹，其中在状态序列早期反复发生回滑，并持续贯穿整个序列，表现为离子电流水平相近的重复区块；但该结果也表明，这些模型仍容易受到噪声轨迹偏差的影响。
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图 7．
分段离子电流轨迹上的 HMM 推断。
A．
以颜色表示 HMM 推断结果的分段离子电流轨迹（G）。颜色和计数序列表示模型在推断该轨迹时经过的每个唯一匹配状态。红色虚线表示模型选择跳过若干模型匹配状态、直接到达下游匹配状态的位置。蓝色虚线表示模型向后滑移至上游匹配状态的位置。绿色虚线及其后的片段表示模型插入了一个状态，该状态的均值和方差分别取前后状态均值和方差的平均值。纵轴表示经 z-score 标准化的离子电流，单位为皮安。
B．
以颜色表示 HMM 推断结果的分段离子电流轨迹（D）。
在 the
由于缺乏真实标签的回滑注释，我们无法直接验证这些判定。然而，该 профиль HMM 的专门化架构能够在离子电流数据中识别候选回滑事件，从而突出显示值得进一步实验研究的区域。
讨论
我们开发了一种用于分析纳米孔蛋白离子电流信号的计算策略，解决了去噪、分段和氨基酸分类中的部分挑战。PELT 分段产生的中位分段数（每个可变区域约 35 段）与已有报道的 ClpX 马达平均每次转位 2 个氨基酸的步长相一致，并且不同构建体之间的分段分布具有可重复性。我们观察到轨迹长度与分段数之间存在中等程度的相关性，这表明该算法识别的是实际的转位事件，而非对信号进行任意划分。
我们对分段后的氨基酸区域进行了基于 LSTM 的多类别、多组和成对分类。不同氨基酸区域的分类表现差异较大，其中带负电荷的残基在所有任务中均表现出稳定而优异的区分能力。在 20 类分类中（总体准确率约为 21%），D 的准确率达到 81.0%，AUC = 0.97；E 的准确率达到 54.1%，AUC = 0.93。在二元电荷分类中（准确率为 93.3%，AUC = 0.963）、三分类中（负电荷氨基酸的召回率为 88%）以及成对比较中，这一模式均得以保持，表明电荷状态能够产生具有高度区分性的离子电流特征。成对分类（平均准确率约为 75%）显示，许多氨基酸对能够被较为容易地区分，而混淆主要集中在理化性质相似的残基之间。基于性质的
分组结果表明，电荷产生的区分度最强，其次是尺寸差异较大的类别；而中间类别（中等大小、极性）则呈现相互重叠的信号特征。我们发现，相似氨基酸之间的区分度较低，这可能既反映了生物信号的重叠，也反映了所用构建体中的序列上下文多样性有限。从 20 类分类到成对分类的性能提升表明，对于 PTM 检测或突变识别等特定应用，采用有针对性的二元分类器可能比同时区分全部氨基酸更具实用性。
我们使用动态规划分割方法，将轨迹划分为固定的 35 个片段。随后，利用 DTW 重心平均法为每种氨基酸区域生成代表性模板。我们使用这些轮廓进行模板与轨迹匹配，并取得了中等水平的性能。我们检查了重心模板与类内及类间样本的 DTW 对齐结果。类内比较显示出良好的对齐效果。尽管 DTW 灵活的匹配特性允许对齐任意两条序列，但与类内对齐相比，类间比较表现为更高的代价、更大的路径偏离，或二者兼有。这表明，不同类别的离子电流信号可能存在足够大的差异，以致其与其他类别的轨迹对齐时产生更高代价。然而，类内与类间对齐的代价和偏离分布存在重叠，说明仅凭 DTW 距离指标，对某些氨基酸对的类别区分能力有限。
基于这些重心的统计特性以及各片段的平均方差，我们使用轮廓隐马尔可夫模型对线性片段进行建模。
依赖关系以及马达逐步易位的机制。该模型在粗粒度分类中表现良好；随着类别划分变得更精细，其判别能力有所下降，这可能反映了线性链建模的局限，也可能是当前构建体的序列上下文多样性有限所致。轮廓隐马尔可夫模型适用于这一场景，因为即使数据量有限，也能够对其进行训练，同时生成易于解释的易位描述，其中包括候选回滑和停滞事件。随着构建体设计日益多样化、数据量不断增加，这些模型可作为一种可解释的基线，并为深度学习方法提供结构先验。
结论
我们开发了一套用于纳米孔蛋白质信号分析的集成计算策略，结果表明，去噪结合变点检测算法能够对蛋白质易位事件进行分段。分段结果一致，片段数量与 ClpX 马达的步长相符，且在不同构建体上均表现出可重复的性能。对分段区域进行分类后发现，该方法能够有效区分带电残基及基于性质划分的类别；然而，对于本研究测试的构建体，尚未实现对全部 20 种氨基酸的单氨基酸分辨率。这表明，该方法在有针对性的应用场景中可用于粗粒度区分。
要提升对难以区分的氨基酸对的识别性能，可能需要扩大训练数据集，并优化构建体设计，使每种氨基酸都能在多样化的序列上下文中得到采样。未来，若设计包含邻近序列系统性变化的蛋白质构建体，将有助于更好地表征依赖上下文的信号变化，并提升模型在线视频精品
目前显示出重叠特征的氨基酸的泛化。该策略同样非常适用于检测改变电荷状态的翻译后修饰、鉴定涉及高度可区分氨基酸的特定突变，或执行旨在区分氨基酸组别而非单个残基的分类任务。
声明
伦理批准和参与同意
不适用
发表同意
所有作者均已阅读并批准该稿件。
数据和材料的可用性
本研究的全部数据均来自 Motone 等人[25]。本研究所使用的所有脚本、代码和算法均已公开，可在 GitHub 代码仓库中获取：https://github.com/genometechlab/nano-protein-signal。
利益冲突
M.J. 担任 ONT 的顾问，并曾获得参加活动并进行演讲所产生的差旅、住宿和会议费用报销。J.N. 担任 Oxford Nanopore Technologies 的顾问，并持有该公司的股票期权。其他作者声明不存在利益冲突。
基金资助
本项目得到以下基金的支持：NIH HG012545（J.N.、M.J.）。
作者贡献
N.G.E：数据整理、形式分析、方法学、验证、可视化、撰写原始稿件、审阅与编辑。
A.J.S：数据整理、形式分析、方法学、验证、可视化、审阅与编辑。
D.K.-H：数据整理、审阅稿件。
J.N.：监督、编辑稿件。
M.J：概念化、方法学、项目管理、监督、验证、审阅与编辑。
基金机构信息声明
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纳米孔蛋白质读数的离子电流分析策略
Andrew J. Stein、Neda Ghohabi Esfahani、Stuart Akeson、Pooria Daneshvar Kakhaki、Daphne Kontogiorgos-Heintz、Jeff Nivala、Miten Jain
bioRxiv
2026.09.28.755023；
doi：https://doi.org/10.64898/2026.09.28.755023
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纳米孔蛋白质读数的离子电流分析策略
Andrew J. Stein、Neda Ghohabi Esfahani、Stuart Akeson、Pooria Daneshvar Kakhaki、Daphne Kontogiorgos-Heintz、Jeff Nivala、Miten Jain
bioRxiv
2026.09.28.755023；
doi：https://doi.org/10.64898/2026.09.28.755023
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关键词：纳米孔蛋白质测序 · 离子电流信号分析 · 变点检测 · 氨基酸分类 · 隐马尔可夫模型
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