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高温通过广泛重编程激素信号通路削弱植物免疫力，并增加植物对细菌病原体的易感性。尽管自噬参与胁迫适应和病原体防御，但其在温暖条件下激素依赖性免疫调控中的作用仍不明确。本研究探讨了NBR1（BRCA1基因邻近基因1）介导的选择性自噬在高温下拟南芥抵御Pseudomonas cannabina pv. alisalensis侵染的免疫反应中的作用。升温条件下的细菌侵染增强了自噬通量，并促进了NBR1的周转，表明自噬活性升高。对atg5和nbr1突变体以及NBR1过表达株系的分析表明，核心自噬过程和NBR1介导的选择性自噬均有助于温暖条件下的抗细菌免疫。激素和基因表达分析表明，NBR1在侵染过程中负向调控脱落酸（ABA）相关的转录响应，而水杨酸信号传导基本不受影响。在机制上，NBR1与ABA响应性转录因子ABI5（ABA不敏感蛋白5）发生物理相互作用，并促进其在植物体内以自噬依赖的方式周转。温暖条件下，ABI5的周转显著减少，导致其在nbr1和atg5植株中积累。与ABI5在该表型中的功能作用一致，通过遗传手段破坏ABI5的功能，在很大程度上逆转了nbr1突变体在高温下易感性升高的表型，而ABI5过表达则增加了植株对细菌侵染的易感性。综上，我们的研究结果揭示，NBR1介导的选择性自噬是一种通过ABI5的自噬依赖性周转来抑制ABA相关易感性的调控机制。这些发现揭示了选择性自噬与脱落酸（ABA）依赖性免疫调控之间此前未被认识到的联系，并确定NBR1介导的ABI5周转是一种温度依赖性机制，可防止温暖条件下对细菌的感病性进一步增强。
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选择性自噬通过依赖 NBR1 的 ABI5 调控促进升温条件下的抗细菌免疫
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Nicolás Miguel
Cecchini
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Hernán Ramiro
Lascano
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Ignacio
Lescano López I
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735842
Lara Anzardi Ruffino
1
农业研究单位（UDEA），阿根廷国家农业技术研究院（INTA）—国家科学与技术研究委员会（CONICET）
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阿根廷
2
科尔多瓦国立大学（UNC）精确科学、物理与自然科学学院植物生理学教研室
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Verónica Sofía Mary
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科尔多瓦国立大学（UNC）化学科学学院临床生物化学系。临床生物化学与免疫学研究中心（CIBICI，UNC-CONICET）
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Nicolás Miguel Cecchini
4
科尔多瓦国立大学（UNC）化学科学学院 Ranwel Caputto 生物化学系。科尔多瓦生物化学研究中心（CIQUIBIC，UNC-CONICET）
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Hernán Ramiro Lascano
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Ignacio Lescano López I
1
农业研究单位（UDEA），阿根廷国家农业技术研究院－国家科学与技术研究委员会（INTA-CONICET），阿根廷科尔多瓦
4
科尔多瓦国立大学（UNC）化学科学学院 Ranwel Caputto 生物化学系。科尔多瓦生物化学研究中心（CIQUIBIC，UNC-CONICET），阿根廷科尔多瓦
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高温通过广泛重编程激素信号通路，削弱植物免疫力并提高其对细菌病原体的易感性。尽管自噬有助于胁迫适应和病原体防御，但其在温暖条件下依赖激素的免疫调控中的作用仍不明确。本研究探究了 NBR1（NEIGHBOR OF BRCA1 GENE 1）介导的选择性自噬在高温下拟南芥抵御 Pseudomonas cannabina pv. alisalensis 侵染的免疫反应中的作用。升温条件下的细菌侵染增强了自噬通量，并促进了 NBR1 的周转，表明自噬活性增强。对 atg5 和 nbr1 突变体以及 NBR1 过表达株系的分析表明，核心自噬过程和 NBR1 介导的选择性自噬均有助于温暖条件下的抗细菌免疫。激素和基因表达分析表明，在侵染过程中，NBR1 负向调控与脱落酸（ABA）相关的转录响应，而水杨酸信号转导基本不受影响。在机制上，NBR1 与 ABA 响应性转录因子 ABI5（脱落酸不敏感
5），并促进其在植物体内通过自噬依赖途径周转。在温暖条件下，ABI5的周转显著减少，导致其在nbr1和atg5植株中积累。与ABI5在该表型中的功能作用一致，通过遗传手段破坏ABI5的功能，在很大程度上逆转了nbr1突变体在较高温度下易感性增强的表型，而ABI5过表达则增强了植株对细菌侵染的易感性。综上，我们的研究结果表明，NBR1介导的选择性自噬是一种调控机制，可通过ABI5的自噬依赖性周转抑制与ABA相关的易感性。这些发现揭示了选择性自噬与ABA依赖性免疫调控之间此前未知的联系，并表明NBR1介导的ABI5周转是一种温度依赖性机制，可防止温暖条件下对细菌的易感性进一步增强。
引言
植物病害是造成全球作物损失的主要原因之一，预计其影响将随着气候变化而加剧（Savary et al. 2019，Velásquez et al., 2018）。植物依赖多层次的免疫应答：定位于质膜的模式识别受体（PRRs）通过检测保守的微生物模式来激活模式触发的免疫（PTI）；细胞内免疫受体则通过识别病原体效应子来激活效应子触发的免疫（ETI），其中许多效应子通过专门的分泌系统（如细菌III型分泌系统，T3SS）被递送至宿主细胞内。环境因素对植物与病原体相互作用的结果具有关键影响，病害往往在非最适生长条件下暴发。由于生物胁迫与非生物胁迫应答往往涉及相互竞争的生理程序，植物必须维持一种
生长、胁迫适应与免疫之间的动态平衡（Huot et al., 2014；Karasov et al., 2017）。
高温使生长与防御之间的平衡向生长倾斜，从而削弱免疫反应（Kim et al., 2022）。在拟南芥中，适度升高的温度（28–30 °C）会触发热形态建成，其特征是出现生长相关反应，而这些反应往往以牺牲防御为代价（Casal and Balasubramanian, 2019）。对拟南芥及其他植物物种的研究表明，温度升高通过多种机制削弱免疫反应，包括抑制水杨酸（SA）依赖性防御，以及转录和激素层面的重编程（Zhu et al., 2010；Alcázar and Parker, 2011；Huot et al., 2017；Velásquez et al., 2018）。在拟南芥中，涉及光敏色素B（phyB）和光敏色素互作因子4（PIF4）的温度感知通路已被确认为温度升高条件下生长—防御平衡的重要调控因子，将热形态建成性生长反应与免疫信号传导的变化联系起来（Gangappa and Kumar, 2017；Casal and Balasubramanian, 2019）。因此，暴露于较高温度的植物往往表现出对细菌病原体更高的易感性，这凸显了深入理解协调温度感知、生长反应与免疫的分子机制的必要性。
温暖条件会重编程植物激素信号传导，促进生长素和赤霉素等与生长相关的信号通路，同时重塑防御相关的激素网络（Quint et al., 2016；Casal and Balasubramanian, 2019）。在拟南芥中，对丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato，Pst）感染植株的转录组分析表明，温度升高会改变
众多激素响应基因的表达，包括水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）信号通路的组成组分（Huot et al., 2017）。值得注意的是，在温暖条件下，ABA生物合成基因NCED3在感染过程中受到更强烈的诱导，同时伴随着ABA积累量的增加。这些变化尤为重要，因为ABA调控多种防御相关过程，包括气孔关闭、水分胁迫响应以及与免疫信号通路的交互作用（Cutler et al., 2010；Yoshida et al., 2019）。此外，ABA信号传导可拮抗SA依赖性防御，从而提高植物对活体营养型和半活体营养型病原体的感病性（De Torres-Zabala et al., 2007；Cao et al., 2011；Mine et al., 2017）。综上，这些观察结果表明，在病原体感染过程中，ABA可能是连接温度感知与免疫响应的重要调控节点。然而，将温度依赖性激素重编程与免疫调控相整合的机制仍不明确。
自噬已被认为是植物维持细胞稳态并适应环境条件变化的核心机制。在此过程中，细胞质物质被包裹进称为自噬体的双膜囊泡中，并被递送至液泡进行降解和回收利用。自噬体的生物发生依赖于一组保守的自噬相关（AUTOPHAGY-RELATED，ATG）蛋白，这些蛋白介导货物包裹、囊泡形成及向液泡的递送（Marshall and Vierstra, 2026）。尽管自噬能够介导细胞质组分的批量降解，但越来越多的证据表明，许多底物通过由货物受体介导的选择性自噬途径被靶向降解（
Stephani 和 Dagdas，2020）。植物选择性自噬的一个主要介导因子是 BRCA1 基因邻近基因 1（NEIGHBOR OF BRCA1 GENE 1，NBR1）。NBR1 是一种多功能货物受体，含有泛素结合结构域和 ATG8 相互作用结构域，能够识别泛素化底物并将其递送至自噬体，随后在液泡中降解（Svenning 等，2011）。NBR1 依赖的选择性自噬参与清除蛋白质聚集体（聚集体自噬）、参与胁迫适应和发育的调控蛋白的周转，以及病原体来源组分的清除（异物自噬）（Svenning 等，2011；Stephani 和 Dagdas，2020；Marshall 和 Vierstra，2026）。与其作为货物受体的功能一致，NBR1 在 atg5 等自噬缺陷突变体中积累，表明其周转依赖于功能正常的自噬途径（Üstün 等，2018）。除维持蛋白质稳态外，NBR1 还参与植物对非生物胁迫的响应，包括从高温诱导的蛋白质毒性胁迫中恢复，并已被确认为植物抵御多种病原体的免疫反应的重要调控因子（Zhou 等，2013；Hafrén 等，2017；Üstün 等，2018）。例如，在丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）侵染期间，NBR1 抑制依赖 HopM1 的水渍状病斑的形成，并限制病害进展，表明选择性自噬能够抵消细菌的毒力策略（Üstün 等，2018）。类似地，NBR1/Joka2 靶向黄单胞菌属效应蛋白 XopL，从而限制细菌毒力，揭示了自噬能够直接对抗效应蛋白介导的感病性（Leong 等，2022）。此外，在丁香假单胞菌侵染期间，核心自噬组分被认为兼具促细菌和抗细菌作用
感染，凸显了自噬在植物免疫中的作用具有情境依赖性（Hofius et al., 2009；Lenz et al., 2011；Üstün et al., 2018）。综上，这些研究结果表明，包括NBR1介导的选择性自噬在内的不同自噬途径参与了植物对细菌病原体的防御。
除参与细胞稳态维持外，自噬还通过直接靶向特定调控蛋白来调节激素信号转导。已有多种激素相关组分被鉴定为自噬底物或互作因子，凸显了选择性自噬是精细调控激素响应的重要机制。例如，ARF7通过依赖NBR1的选择性自噬进行周转，从而参与生长素稳态维持和根发育（Ebstrup et al., 2024）。此外，拟南芥NBR1在植物体内与ABI3、ABI4和ABI5（脱落酸不敏感蛋白）发生物理相互作用（Tarnowski et al., 2020）；这些碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子可激活参与胁迫适应、发育及气孔调控的脱落酸（ABA）响应基因（Skubacz et al., 2016；Chandrasekaran et al., 2020；Cheng et al., 2026）。这一联系在丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）感染过程中尤为重要：ABA促进依赖HopM1的水渍状病斑形成，而增强NBR1活性则可减轻这些病害症状（De Torres-Zabala et al., 2007；Üstün et al., 2018）。综上，这些观察结果表明，NBR1介导的选择性自噬可能通过调控ABI5等关键信号组分来调节ABA依赖性响应。
在本研究中，我们探究了依赖NBR1的选择性自噬在升温条件下对植物免疫的贡献。我们发现，温暖条件下的细菌感染增强了自噬通量，并且
促进NBR1的周转，且NBR1和核心自噬机制均有助于限制细菌增殖。我们进一步证明，NBR1负向调控ABA信号传导，在植物体内与ABI5发生物理相互作用，并在感染期间促进其依赖自噬的周转。最后，遗传分析表明，ABI5参与了升温条件下nbr1植株易感性增强的过程。综上，我们的研究发现，NBR1介导的选择性自噬通过调控ABI5稳态，将温度响应性免疫与ABA信号传导联系起来，构成了一种调控机制。
材料与方法
植物材料与生长条件
本研究采用拟南芥（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.）Columbia-0（Col-0）生态型作为野生型（WT）背景。T-DNA插入突变体nbr1（GABI_246H08；Zhou et al.，2013）、atg5（SAIL_129B07；Inoue et al.，2006）和abi5-8（SALK_013163；Zou et al.，2013），以及35S:GFP-ATG8a报告株系（N39996；Thompson et al.，2005）均购自拟南芥生物资源中心（ABRC，美国俄亥俄州立大学）。mCherry–YFP–NBR1报告株系（Svenning et al.，2011）的种子由Germán Robert（UDEA-CONICET）惠赠。abi5-8株系（Zou et al.，2013）的种子由Elina Welchen（阿根廷滨海农业生物技术研究所〔CONICET-UNL〕）惠赠。种子在水中吸胀后，于4 °C层积处理2–3天，随后播种于土壤与蛭石的混合基质中（1:2，v/v）。除非另有说明，植株均在22 °C、12 h光照/12 h黑暗的光周期及120–130 μmol m⁻² s⁻¹的光照强度下培养。
细菌感染测定与温度处理
有毒力的Pseudomonas cannabina pv. alisalensis（Pma DG3；原称P. syringae pv.
maculicola；Baltrus 等（2011）、丁香假单胞菌番茄致病变种 DC3000（P. syringae pv. tomato DC3000，Pst；Ritter 和 Dangl，1996）、III 型分泌系统缺陷突变株 Pst-ΔhrcC（Hauck 等，2003），以及表达 AvrRpt2 的 Pst（Pst-AvrRpt2）均在添加适当抗生素的 King’s B 琼脂平板上于 28 °C 培养 2–3 天。用 10 mM MgCl₂ 配制细菌悬液，并根据 OD₆₀₀ 测定值将其调整至所需浓度。
为评估升温对细菌侵染的影响，采用注射器渗透法对 4–5 周龄野生型（WT）或转基因植株的叶片进行接种（5 × 10 CFU ml⁻¹）。模拟处理植株仅接种 10 mM MgCl₂。接种后，根据具体实验，将植株置于 22 °C 或 29 °C 条件下培养至接种后第 1 或第 2 天（dpi）。所有侵染试验均使用完全展开的叶片（第 7–9 片叶）。
参照 Miranda de la Torre 等（2023）的方法并加以修改，于接种后第 2 天定量测定细菌生长量。简而言之，每个处理从 6–8 株独立植株中采集至少 3 片受侵染叶片。从每片叶片上切取两个叶圆片（每个面积为 12.56 mm²），在 10 mM MgCl₂ 中匀浆，进行系列稀释后涂布于添加适当抗生素的 LB 琼脂平板上。于 28 °C 培养 2–3 天后计数菌落，细菌生长量以每平方厘米叶片组织的菌落形成单位（CFU）表示。为评估感病性随温度的变化，计算感病指数（SI），即相应基因型在 29 °C 下的细菌滴度与其在 22 °C 下平均细菌滴度的比值。
基因表达分析
使用塑料研杵在液态空气中将叶片组织研磨匀浆，并使用 1 ml 的
按照制造商的说明使用 BIO-ZOL 试剂（PB-L，阿根廷）。根据制造商的说明，使用 oligo(dT) 引物和 M-MLV 逆转录酶（K1600，Inbio Highway）对总 RNA（500 ng）进行逆转录。
参照先前报道的方法（Lescano Lopez et al., 2024），经适当修改后，采用逆转录定量 PCR（RT-qPCR）分析转录本水平。反应在 Bioer qPCR 仪上进行，终体积为 15 μl，使用按 1:20 稀释的 cDNA、DreamTaq DNA 聚合酶（EP0702，Thermo Fisher Scientific）和 EvaGreen 染料（Biotium）。扩增程序为：94 °C 预变性 2 min；随后进行 45 个循环，每个循环包括 94 °C 30 s、60 °C 20 s 和 72 °C 20 s；最后以 0.2 °C s⁻¹ 的升温速率从 60 °C 升至 95 °C，进行熔解曲线分析。引物序列见补充表 1。对使用 Gene 9660 V1.0.13 软件（Bioer，2011）获得的原始荧光数据进行基线校正，并使用 LinRegPCR 2021.1 估算初始靶标量（N₀）（Ruijter et al., 2009）。将 N₀ 值以内参基因 PP2A-A3（蛋白磷酸酶 2A A3 亚基；AT1G13320）的 N₀ 值进行归一化，计算相对转录本丰度。
为评估升温对基因表达的影响，针对每种基因型和处理，计算 29 °C 下的转录本水平与 22 °C 下平均转录本水平的比值。
激素定量
参照先前报道的方法（Pettinari et al., 2022），采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行植物激素定量。简而言之，将 50–100 mg 冷冻组织在液氮中研磨成细粉，并在 500 μl 1-丙醇/H₂O/HCl（2:1:0.002，v/v/v）中匀浆。样品于 4 °C 孵育 30 min
在振荡条件下进行，随后加入1 ml二氯甲烷（CH₂Cl₂），并于4 °C下再次振荡孵育30 min。
样品以13,000 × g离心5 min，收集约1 ml下层有机相并蒸干。将干燥后的提取物重悬于200 μl含0.1%甲酸的甲醇（HPLC级）-水溶液（50:50，v/v）中，过滤后进行分析。
植物激素分析采用Waters Xevo TQ-S Micro LC-MS/MS系统（Waters，美国马萨诸塞州米尔福德）进行，该系统配备四元泵（Acquity UPLC H-Class，Waters）、自动进样器（Acquity UPLC H-Class，Waters）和反相色谱柱（Waters BEH C18，1.7 μm，2.1 × 50 mm）。流动相由含0.1%甲酸的水（A）和含0.1% CH₂O₂的甲醇（B）组成，流速为0.25 ml min⁻¹。溶剂B的初始浓度为40%，保持0.5 min，随后线性升高，至3 min时达到100%。
为鉴定和定量代谢物，将UPLC系统与配备电喷雾电离（ESI）源的Xevo TQ-S micro三重四极杆质谱仪（Waters）联用。使用MassLynx 4.1版软件进行数据采集和处理。分别在正、负离子模式下记录质谱。各代谢物采用的离子跃迁（m/z）值如下：SA：137.0 > 93.0和137.0 > 65.0；IAA：176.0 > 130.0和176.0 > 103.0；ABA：263.0 > 153.0和263.0 > 219.0。利用线性校准曲线计算植物激素浓度，并以每克组织鲜重所含植物激素的纳克数表示。
表达ABI5融合蛋白的转基因株系的构建
为构建表达ABI5融合蛋白的转基因株系，
采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株及基于Clough and Bent（1998）改良的花序浸染法，将pSuper:ABI5–3×Flag或pSuper:ABI5–GFP构建体（Qi et al., 2020）转入野生型（WT）、nbr1和atg5植株。这些构建体由中国农业大学李继刚教授惠赠。在添加潮霉素B（15 μg ml⁻¹）的0.5× MS琼脂平板上筛选T1至T3代转基因植株，并鉴定纯合株系用于后续分析。按照下文所述方法，分别使用抗Flag或抗GFP抗体进行免疫印迹分析，以验证ABI5–Flag和ABI5–GFP融合蛋白的表达。选取具有代表性的T3代纯合株系进行后续分析。
免疫印迹分析
采集6片叶圆片（每片12.56 mm²），用塑料研磨杵在液氮中研磨。按照先前描述的方法（Svenning et al., 2011），直接用100 μl 1× SDS-PAGE上样缓冲液提取蛋白质。样品于95 °C加热5 min，以12,000 rpm离心后，每个泳道取20 μl上清液上样至SDS-PAGE凝胶。蛋白质分离、转膜和免疫检测基本按照Robert et al.（2025）所述方法进行，并稍作修改。
电泳结束后，将蛋白质转移至PVDF膜，并通过丽春红S染色验证上样量一致。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.1% Tween-20）中封闭1 h，随后与按1:1000稀释的一抗于4 °C孵育过夜。所用一抗如下：兔抗GFP抗体（AS20，Agrisera）、兔抗mCherry抗体（AS15 4085，Agrisera）、兔抗NBR1抗体（AS14 2805A，Agrisera）和小鼠抗Flag抗体（A00187，GenScript）。膜随后被
用TBS-T洗涤三次后，与按1:1000稀释的碱性磷酸酶偶联抗兔（A-3687，Sigma）或抗小鼠（M-9637，Sigma）二抗在室温下孵育1 h。使用NBT/BCIP底物溶液检测信号，并采用GelDoc Go凝胶成像系统（Bio-Rad）采集图像。
使用ImageJ软件（Schindelin et al., 2012）对条带强度进行定量。首先使用“Subtract Background”功能处理图像，滚球半径设为50像素。使用覆盖各泳道中央三分之一区域的矩形选区选择泳道，以尽量减少边缘效应。使用“Plot Lanes”功能生成灰度曲线，并以高于局部背景的积分面积计算条带强度。
按照Robert et al.（2025）所述方法，通过免疫印迹灰度分析估算自噬通量和蛋白质周转。对于基于GFP的报告系统（35S:GFP–ATG8和Super:ABI5–GFP），计算游离GFP与相应GFP融合蛋白的比值。对于mCherry–YFP–NBR1报告系统，计算加工产生的mCherry–YFP与全长mCherry–YFP–NBR1的信号比值。
免疫共沉淀实验
使用表达ABI5–GFP或ABI5–Flag的转基因植物进行免疫共沉淀实验。用于GFP和Flag实验的阴性对照株系分别为GRX1–roGFP2（Meyer et al., 2007）和BIM1–Flag（Liang et al., 2018），分别由Andreas Meyer（波恩大学农业学院）和Georgina Fabro（CIQUIBIC，FCQ-CONICET）惠赠。在ABI5–GFP实验中，于接种后1天（dpi）采集受Pma感染植株的叶片组织。在ABI5–Flag实验中，使用在0.5× MS琼脂培养基上培养的14日龄幼苗。
将植物组织在提取缓冲液中匀浆，缓冲液含有50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、10%甘油、1 mM EDTA、0.1% NP-40、10 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）、蛋白酶抑制剂混合物（Roche）和1 mM PMSF。提取液于4 °C、13,500 rpm离心20 min，上清液经Miracloth过滤。
每个样品取10%的提取液留作输入样品（input），其余提取液于4 °C与偶联抗NBR1抗体（AS14 2805A，Agrisera）的Dynabeads Protein A磁珠（1001D，Thermo Fischer Scientific）孵育。ABI5–GFP提取液孵育过夜，ABI5–Flag提取液则孵育4 h。用提取缓冲液洗涤磁珠三次，随后加入1× SDS-PAGE上样缓冲液，于70 °C孵育10 min以洗脱结合的蛋白质。按照上述方法，使用抗GFP或抗Flag抗体，通过免疫印迹分析免疫沉淀所得的蛋白质。
nbr1 abi5双突变体的构建与基因分型
通过杂交纯合nbr1与abi5-8植株，构建nbr1 abi5双突变体。将杂交获得的F1代及F1植株自交获得的F2代置于添加磺胺嘧啶（200 μg ml⁻¹）的0.5× MS琼脂平板上进行筛选，以富集携带nbr1等位基因的个体。由于abi5-8品系已丧失卡那霉素抗性，因此无法通过抗生素筛选abi5-8等位基因。
将筛选出的F2代个体移栽至土壤后，从其叶片组织中提取基因组DNA，用于PCR基因分型。使用基因特异性引物和T-DNA左边界引物LBb1.3（补充表1），通过两组独立的PCR反应鉴定纯合T-DNA插入突变体。当使用
使用基因特异性引物未获得扩增产物，而使用基因特异性引物与LBb1.3配对进行PCR扩增时，获得了预期大小的T-DNA特异性片段。按照制造商的说明，使用Pegasus Taq DNA Polymerase（PB-L）或T-Plus DNA Polymerase（Inbio Highway），在补充表2所述条件下进行PCR扩增。
数据分析与统计
使用GraphPad Prism 8（GraphPad Software）进行统计分析和绘图。采用Shapiro–Wilk检验评估数据的正态性，采用Levene检验评估方差齐性。根据数据分布情况，酌情采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）或Kruskal–Wallis检验进行统计分析。采用Benjamini、Krieger和Yekutieli的两阶段线性递进法进行多重比较校正。统计显著性表示如下：P < 0.05（*）、P < 0.01（）和P < 0.001（*）。
结果
- 升温条件下，感染激活自噬和NBR1
为探究升温条件下细菌感染过程中自噬是否受到调控，我们采用GFP–ATG8a裂解测定法对自噬通量进行定量分析（Thompson et al., 2005）。在该体系中，GFP–ATG8a在自噬过程中被递送至液泡，ATG8a在液泡内被降解，而游离GFP因相对稳定而积累。因此，可通过游离GFP与GFP–ATG8a的比值估算自噬通量。对表达GFP–ATG8a的5周龄拟南芥植株进行模拟浸润处理，或以5 × 10 CFU ml⁻¹的浓度浸润接种Pseudomonas cannabina pv. alisalensis（Pma，原称P. syringae pv. maculicola ES4326；Baltrus et al., (2011)；Sarris et al., (2013)），随后置于22 °C或29 °C条件下培养，后者用作一种
升温条件下。在经模拟处理液浸润的植株中，温度未显著改变自噬通量（图1a）。相比之下，在接种后2天（dpi），与22 °C相比，29 °C条件下Pma感染导致自噬通量增加。与此一致，接种Pma后转移至29 °C的幼苗表现出更高的自噬通量和更多的GFP–ATG8a标记点状结构，尤其是在地上部组织中（补充图1），表明升温可增强成株和幼苗中由感染诱导的自噬。为确定这一响应在另一种常用细菌菌株感染时是否同样存在，以及其是否依赖效应蛋白的递送，我们分析了感染丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（P. syringae pv. tomato DC3000，Pst）及其III型分泌缺陷突变株Pst-ΔhrcC的植株。两种菌株均在29 °C条件下诱导自噬通量显著增加（补充图2）。这表明，温度升高所增强的自噬不需要III型效应蛋白的递送，且与由病原体相关分子模式（PAMP）识别和模式触发免疫（PTI）相关信号传导所介导的激活相一致。
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图1. 升温条件下Pma感染激活拟南芥自噬通量并促进NBR1周转。
用模拟处理液或浓度为5 × 10⁵ CFU ml⁻¹的Pma浸润植株，随后置于22 °C或29 °C条件下培养。
（a）在接种后2天（dpi），以游离GFP与GFP–ATG8a的比值监测GFP–ATG8a植株的自噬通量。
（b）在接种后1天，通过免疫印迹分析野生型（WT）和atg5植株中内源NBR1蛋白的水平。
（c）在接种后1天，使用抗mCherry抗体对mCherry–YFP和mCherry–YFP–NBR1融合蛋白进行免疫印迹分析，以评估NBR1周转。以Rubisco大亚基（RbcL）作为上样对照。条带强度通过灰度密度分析进行定量
分析，并在各免疫印迹图下方列出了以融合蛋白（(a)、(c)）或 RbcL（(b)）归一化的相对值。在 (a) 中，数值以 22 °C 下的模拟处理条件为参照表示。每个圆点代表一株独立植株。箱体表示中位数和四分位距，须线表示最小值和最大值。星号表示差异具有统计学显著性（*P < 0.033；(a) 和 (c) 采用双因素方差分析，(b) 采用 Kruskal–Wallis 检验，随后使用 Benjamini、Krieger 和 Yekutieli 两阶段线性递增法进行假发现率校正）。
接下来，我们检测了选择性自噬受体 NBR1 的水平。NBR1 是一种已得到充分研究的自噬受体，在自噬降解受损时会发生积累（Üstün et al., 2018）。免疫印迹分析显示，感染后 NBR1 蛋白水平升高，在升温条件下尤为明显（图 1b）。值得注意的是，在自噬体形成存在缺陷的 atg5 突变体中（Thompson et al., 2005），NBR1 的积累显著增强，表明 NBR1 的周转依赖于功能正常的自噬途径。
为直接监测 NBR1 的周转，我们使用了表达串联荧光报告蛋白 mCherry–YFP–NBR1 的植株（Svenning et al., 2011）。在自噬降解过程中，该融合蛋白被加工，释放出游离的 mCherry–YFP，后者可通过免疫印迹检测。因此，我们以游离 mCherry–YFP 与 mCherry–YFP–NBR1 的比值估算 NBR1 的周转水平。在感染与升温共同处理条件下，我们观察到，游离 mCherry–YFP/mCherry–YFP–NBR1 的比值高于模拟处理或单一处理条件，这与 NBR1 周转增强相一致（图 1c）。综上，这些结果强烈提示，自噬在细菌
升温条件下的感染。此外，感染期间，NBR1依赖自噬的周转增加，并在温度升高时进一步增强。
- NBR1介导的自噬有助于升温条件下的抗病性
为评估NBR1介导的自噬在升温条件下的功能意义，我们在22 °C或29 °C下，定量测定了野生型（WT）、nbr1和atg5植株以及NBR1过表达植株（35S:mCherry–YFP–NBR1）对Pma细菌感染的感病性（图2）。在22 °C下，各基因型之间的细菌生长量无显著差异（图2a）。相比之下，在29 °C下，所有基因型中的细菌增殖均有所增加，表明温度升高普遍增强了植株对感染的感病性，这与Huot等（2017）的报道一致。值得注意的是，这一增幅在不同基因型之间存在明显差异。在升温条件下，自噬突变体nbr1和atg5中的细菌滴度高于WT（图2a，补充图3a）。为比较不同基因型感病性随温度升高而增加的程度，我们将各基因型在29 °C下的细菌生长量相对于其在22 °C下的生长量进行归一化，计算得到感病性指数（SI）（图2b）。WT植株的SI约为5，而nbr1和atg5突变体的SI值为100–130，表明其细菌生长量随温度升高而增加的程度明显更大（图2b，补充图3b）。值得注意的是，atg5突变体中观察到的感病性增加与自噬通量受损及NBR1周转缺陷相一致（图1b），支持依赖自噬的过程在这一响应中发挥作用。相比之下，NBR1过表达植株在29 °C下的细菌生长量相较于22 °C并未显著增加
°C，且其感病指数（SI）为0.82，低于野生型（WT）（图2a、b），表明其在升温条件下的耐受性增强。此外，在感染丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（*P. syringae* pv. *tomato* DC3000，简称*Pst*）后，也观察到了类似的感病性模式（补充图4），表明*nbr1*增强的温度依赖性感病性并不局限于*Pma*。除细菌生长量外，还测定了叶绿素含量，作为衡量病害影响的生理指标（补充图3c）。尽管叶绿素水平的差异相对较小，但*nbr1*植株的叶绿素含量始终高于WT植株，支持了该突变体中叶绿素分解代谢可能发生改变的推测。
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图2.
NBR1介导的选择性自噬限制升温条件下的细菌生长。
将浓度为5 × 10⁵ CFU ml⁻¹的*Pma*浸润接种至WT植株、NBR1功能受损突变体（*nbr1*）、核心自噬功能受损突变体（*atg5*）以及NBR1过表达植株（35S:mCherry–YFP–NBR1），随后置于22 °C或29 °C条件下培养。接种后第2天定量测定细菌生长量。
（a）
细菌滴度，以每平方厘米叶片组织中的菌落形成单位（CFU）表示。
（b）
感病指数（SI），计算方法为29 °C条件下的细菌滴度与同一基因型在22 °C条件下的平均细菌滴度之比。这些结果在三次独立实验中均可重复（补充图3）。每个圆点代表一株独立植株。箱体表示中位数和四分位距，须线表示最小值和最大值。星号表示差异具有统计学显著性（*P < 0.033；采用Kruskal–Wallis检验，随后使用Benjamini、Krieger和Yekutieli两阶段线性递增法进行假发现率校正
程序）。在（b）中，统计比较均以WT为参照。
为确定NBR1在升温条件下对防御的贡献是否依赖于III型分泌或效应子触发的免疫（ETI），我们比较了感染强毒力Pst、III型分泌系统（T3SS）缺陷突变株Pst-ΔhrcC及表达AvrRpt2的菌株（Pst-AvrRpt2）的植株中的细菌生长和SI。尽管nbr1植株对Pst的感病性增强，但在感染Pst-ΔhrcC或Pst-AvrRpt2后，WT与nbr1植株之间未观察到显著差异（补充图4）。这些结果表明，升温条件下NBR1依赖性机制对抗性的贡献，在具有功能性T3SS的强毒力菌株感染过程中最为明显，而非在对分泌缺陷菌株的响应过程中。这与先前的证据一致，即Pst以T3SS依赖的方式激活自噬，且NBR1介导的选择性自噬能够抵抗效应子相关的病程进展（Üstün et al., 2018）。因此，在升温条件下，NBR1或其依赖的下游过程可能限制一种或多种假单胞菌效应子所促进的感病性。相比之下，在AvrRpt2触发的免疫过程中未检测到nbr1表型，可能反映了该ETI反应的强度，其可能压过或掩盖了在强毒力菌株感染过程中观察到的NBR1依赖性贡献。综上，这些发现表明，NBR1介导的选择性自噬有助于限制升温条件下的细菌增殖，尤其是在效应子介导的感病背景下。
- NBR1在升温条件下负调控ABA信号传导
由于植物激素信号传导在植物中发挥核心作用
鉴于免疫受到温度的强烈影响，我们接下来考察了升温条件下NBR1是否影响与细菌感染相关的激素通路。已有研究表明，升温会增强拟南芥的感病性，部分原因是水杨酸（SA）介导的防御受到抑制，以及其他激素通路发生调节（Huot et al., 2017）。其中，生长素信号传导与对细菌病原体感病性的增强及对SA依赖性防御的拮抗作用有关（Kazan and Manners, 2009）。因此，我们定量测定了SA和吲哚-3-乙酸（IAA）的含量，以探究激素响应的改变是否导致nbr1植株在温暖条件下感病性增强。与22 °C相比，29 °C下的IAA含量略有升高，但不同基因型或感染条件之间均未观察到显著差异（图3a）。相比之下，Pma感染强烈诱导了SA积累以及PR1和ICS1等SA响应基因的表达（图3b、S5a–b）。然而，升温条件下SA含量和PR1表达量均有所降低，这与此前的报道一致。重要的是，野生型（WT）与nbr1植株的这些响应相近，表明在这些条件下，NBR1缺失不会显著改变SA积累或SA响应基因的表达。我们还定量测定了茉莉酸（JA）的含量，因为该激素可能参与针对半活体营养型细菌病原体的免疫响应（Ellis et al., 2002；Zhang et al., 2017）。尽管在22 °C下，Pma感染诱导了WT植株中JA的积累，但这一响应在nbr1植株中受损，且在两种基因型中均受到升温的显著抑制（图3c）。因此，尽管NBR1似乎有助于
在对照温度下感染诱导的JA积累，这一效应在升温条件下并未维持，此时JA水平仍然较低。因此，SA或JA响应似乎均无法充分解释nbr1植株特异性地在升温条件下表现出的易感性增强。
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图3.
NBR1负向调控升温条件下细菌感染期间的ABA积累及ABA相关信号传导。
用模拟接种液或浓度为5 × 10⁵ CFU ml⁻¹的Pma对野生型（WT）和nbr1植株进行渗透接种，随后置于22 °C或29 °C条件下培养。
(a–d)
接种后第2天测定的吲哚-3-乙酸（IAA）、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）浓度。
(e–h)
ABA生物合成及信号传导相关基因NCED3、ABI5、SGR1和NYC1的温度敏感性指数，计算方法为同一基因型和处理下29 °C时的转录本水平与22 °C时平均转录本水平的比值。y = 1处的水平虚线表示转录本丰度未发生温度依赖性变化。数据表示3–4个生物学重复的均值 ± 均值标准误（SEM）；圆圈表示各个重复。星号表示差异具有统计学显著性（*P < 0.05，**P < 0.002；采用双因素方差分析或Kruskal–Wallis检验，随后使用Benjamini、Krieger和Yekutieli两阶段线性递增程序进行错误发现率校正）。
相比之下，ABA积累及信号传导呈现出基因型特异性响应，这种响应在升温条件下的感染过程中最为明显。在WT植株中，Pma感染在两种温度下均诱导ABA水平适度升高（图3d）。然而，在nbr1植株中，感染在22 °C下并未显著改变ABA水平，而在升温条件下则导致显著的
在温暖条件下增加。这些结果表明，NBR1 缺失特异性地增强了高温下细菌感染期间的 ABA 积累，促使我们重点关注这一通路。为进一步表征这一响应，我们分析了 ABA 相关基因的表达。编码 ABA 生物合成关键酶的 NCED3 在野生型（WT）植株中的表达未受到温度的显著影响，但在 29 °C 下的 nbr1 植株中表达升高（补充图 5c）。类似地，在温暖条件下受到感染时，ABA 响应性转录因子 ABI5 及其下游靶基因 SGR1 在 nbr1 植株中的表达均高于 WT 植株（补充图 5d–e）。相比之下，ABI5 靶基因 NYC1 在 29 °C 下的 nbr1 植株中表达降低（补充图 5f），表明 ABA 响应性下游基因受到差异性调控。
为量化升温对 ABA 相关转录响应的影响，我们计算了温度敏感性指数，将其定义为 29 °C 下的转录本水平与 22 °C 下的转录本水平之比（图 3d–f）。尽管感染后 WT 植株中的这一比值未发生显著变化，但在受感染的 nbr1 植株中，NCED3、ABI5 和 SGR1（而非 NYC1）表现出明显更高的温度响应性，表明升温条件下 ABA 相关转录响应加剧。综上所述，这些结果表明，在本研究条件下，高温强烈抑制 SA 积累及其信号传导，而 NBR1 缺失对二者均无实质性影响。22 °C 下 JA 的诱导依赖于 NBR1，但在升温条件下无法维持。相比之下，高温下受感染 nbr1 植株中的 ABA 积累及 ABA 相关基因表达均特异性增强，从而支持了这样一种
ABA在nbr1升温依赖性的易感性中发挥重要作用。
- NBR1与ABI5相互作用并调控其周转
鉴于ABI5在ABA信号传导中的核心作用，以及温暖条件下nbr1植株表现出增强的ABA响应，我们研究了NBR1是否直接调控ABI5。先前的研究表明，NBR1能够与包括ABI5在内的ABA相关转录因子相互作用，提示ABI5可能是选择性自噬的靶标（Tarnowski et al., 2020）。首先，为评估温度和侵染如何影响ABI5蛋白积累，以及这一过程是否受NBR1调控，我们构建了在组成型pSuper启动子控制下表达C端带有Flag标签的ABI5的WT、nbr1和atg5植株（Qi et al., 2020）。免疫印迹分析证实，nbr1背景中缺失NBR1（图4a）。在WT植株中，侵染和升温条件均导致NBR1蛋白水平升高，与先前观察到的积累模式一致（图1b）。在模拟处理条件下，可检测到低水平的ABI5–Flag蛋白，且nbr1中的积累量略高于WT。Pma侵染后，两种基因型中ABI5–Flag的水平均升高，但nbr1植株中的诱导幅度显著更大。有趣的是，尽管升温也促进了ABI5的积累，但受侵染植株在29 °C下的ABI5–Flag水平低于22 °C下的水平，提示ABI5稳定性受到温度依赖性调节（图4a）。
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图4.
NBR1与ABI5相互作用，并在细菌侵染过程中调控其依赖自噬的周转。
对WT、nbr1或atg5背景下表达pSuper:ABI5-Flag或pSuper:ABI5-GFP的植株，用模拟处理溶液或浓度为5 × 10⁵ CFU ml⁻¹的Pma进行渗透接种，并在22条件下培养
°C或29 °C下处理1天。
(a)
图中展示了代表性免疫印迹结果，印迹图下方为NBR1和ABI5-Flag蛋白水平相对于Rubisco大亚基（RbcL）的灰度定量结果。
(b)
在22 °C下，使用抗NBR1磁珠对感染Pma的pSuper:ABI5-GFP/WT和pSuper:ABI5-GFP/atg5植株中的ABI5-GFP进行免疫共沉淀。图中展示了输入样品和免疫沉淀组分。以GRX–roGFP2植株作为阴性对照。在(a)和(b)中，红色箭头指示带标签蛋白的位置。在输入样品中检测到一条迁移位置介于约70至100 kDa之间的非特异性条带。RbcL的丽春红染色结果作为上样对照。
(c)
对感染Pma的WT、nbr1和atg5背景下的pSuper:ABI5-GFP植株中ABI5-GFP的周转进行免疫印迹分析。通过灰度分析，以游离GFP与ABI5-GFP的比值定量评估自噬依赖性周转。图中展示了代表性免疫印迹结果及相应的定量分析。每个圆点代表一株独立植株。箱体表示中位数和四分位距，须线表示最小值和最大值。对经log2转换的比值进行双因素方差分析，随后采用Benjamini、Krieger和Yekutieli两阶段线性递增程序进行错误发现率校正。如图所示，星号表示相对于WT或处理之间存在统计学显著差异（*P < 0.05）。
为检验NBR1是否在植物体内与ABI5发生物理相互作用，我们使用表达融合GFP或Flag标签的ABI5的转基因株系进行了免疫共沉淀试验（Qi et al., 2020）。与Tarnowski et al.（2020）的报道一致，使用抗NBR1磁珠进行免疫沉淀后，ABI5-GFP和ABI5-Flag，
而带标签的对照蛋白则未被检出，表明NBR1与ABI5在植物体内相互结合（图4b，补充图6）。为确定ABI5是否通过自噬途径降解，我们利用在野生型（WT）、nbr1和atg5遗传背景下表达ABI5–GFP的转基因株系，分析了ABI5的周转。与已建立的基于GFP的自噬报告系统类似（Thompson et al., 2005），融合蛋白裂解后释放游离GFP，因此可通过免疫印迹检测游离GFP与全长ABI5–GFP的比值，以估算蛋白质周转水平。在模拟处理条件下，与WT相比，nbr1和atg5植株中的ABI5周转均降低，其中29 °C下的效应最为显著，两种突变体均表现出相近的低周转速率（补充图7）。这些结果表明，ABI5的基础降解依赖于自噬，并提示在温暖条件下，NBR1介导的选择性自噬成为ABI5周转的主要途径。感染后，WT植株在29 °C下的ABI5周转较22 °C略有降低（图4c）。相比之下，nbr1和atg5遗传背景下的ABI5周转均受损，GFP/ABI5–GFP比值持续显著低于WT。尽管nbr1植株在22 °C下的ABI5周转仅部分降低，但在29 °C下，其周转缺陷程度与atg5突变体相当，表明在温暖条件下，NBR1介导的选择性自噬成为决定ABI5周转的主要因素。综上，这些结果确定ABI5是一种受自噬调控的蛋白质，其周转在升温条件下的感染过程中得到促进。这些发现进一步提示，NBR1对ABI5降解的贡献随温度升高而增加，揭示了一个
NBR1介导的选择性自噬在ABA信号调控中具有温度依赖性作用。
- ABI5参与升温条件下NBR1依赖的感病性
为确定NBR1介导的ABI5降解缺失是否导致nbr1植株在温暖条件下感病性增强，我们构建了nbr1 abi5双突变体（补充图8）。将WT、nbr1、abi5和nbr1 abi5植株在22 °C下培养，接种Pma后，分别在22 °C或29 °C下孵育2天，再进行细菌定量（图5）。与先前结果一致，WT植株在温暖条件下的细菌增殖增加，而nbr1植株的细菌增殖和感病指数（SI）增幅更为显著（图5）。相比之下，abi5突变体在29 °C下的细菌增殖仅略有增加，且差异不显著。重要的是，ABI5缺失不仅抑制了nbr1植株感病性增强的表型，还使细菌增殖和SI值降至低于WT植株的水平（图5）。这些结果表明，ABI5的存在是nbr1植株在升温条件下感病性增强所必需的。
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图5.
ABI5参与升温条件下NBR1依赖的感病性。
以5 × 10⁵ CFU ml⁻¹的浓度将Pma浸润接种至WT、nbr1、abi5、nbr1 abi5、pSuper:ABI5–3×Flag/WT和pSuper:ABI5–3×Flag/nbr1植株，随后将其置于22 °C或29 °C下孵育。
(a)
在接种后2天（dpi）对细菌增殖进行定量，并以22 °C下培养的WT植株为参照，将其数值设为1，以相对值表示。水平虚线表示该参照值。
(b)
感病指数（SI），以细菌滴度之间的比值计算
在29 °C下的细菌滴度与同一基因型在22 °C下的平均细菌滴度之比。y = 1处的水平虚线表示细菌在22 °C和29 °C下的生长水平相同（即温度对感病性无影响）。每个圆点代表一株植物。箱体表示中位数和四分位距，须线表示最小值和最大值。星号表示经Kruskal–Wallis检验，并采用Benjamini、Krieger和Yekutieli两阶段线性递增程序进行假发现率校正后确定的统计学显著差异（*P < 0.05）。在（b）中，统计比较均以野生型（WT）为参照。
为进一步评估ABI5的作用，我们分析了由组成型pSuper启动子驱动表达ABI5-Flag的转基因株系，这些株系此前已用于蛋白质免疫印迹实验（图4a，补充图6）。尽管pSuper:ABI5–3×Flag/WT植株在22 °C下的细菌生长水平与WT相近，但在升温条件下，其细菌增殖幅度更大，导致SI值升高（图5）。这些结果与ABI5活性增强可促进高温条件下感染过程中的感病性这一观点一致。相比之下，pSuper:ABI5–3×Flag/nbr1植株在22 °C下即表现出较高的细菌生长水平，而在29 °C下几乎未进一步增加。因此，其SI值仍低于pSuper:ABI5–3×Flag/WT植株（图5）。这表明，NBR1的缺失使植物对ABI5依赖性响应更为敏感，导致其处于组成型感病状态，从而使高温下病害进一步加重的空间十分有限。
综上所述，这些结果表明，ABI5参与温度升高所增强的
细菌感染期间的易感性，并支持以下结论：NBR1 至少部分通过负调控 ABI5，在升温条件下限制植物的易感性。
讨论
在本研究中，我们表明，NBR1 介导的选择性自噬有助于限制拟南芥对细菌的易感性，尤其是在升高温度条件下，其作用机制涉及对 ABA 信号传导的负调控。这种温度依赖性是本研究发现的核心特征之一，因为 NBR1 对抗性的贡献在升温条件下最为明显，而升温已知有利于细菌病害的发展，并会重塑植物的免疫反应和激素反应（Huot et al., 2017）。已有研究表明，细菌感染期间升高的温度与 ABA 反应增强相关，并且通常伴随着病害易感性增加（De Torres-Zabala et al., 2007；Cao et al., 2011；Mine et al., 2017）。与这一观点一致的是，升温条件下 *nbr1* 植株易感性增强，并伴随着 ABA 相关反应更强烈的激活；尽管 *nbr1* 植株中 SA 积累减少，SA 信号传导的转录标志物总体上仍未受到明显影响（补充图 5a-b，图 3b）。这些观察结果表明，在升高温度条件下，*nbr1* 植株易感性增加与 ABA 信号传导改变的关联更为密切，而不是主要源于 SA 依赖性防御的严重受损。NBR1 还影响感染期间 JA 的积累。在 22 °C 下感染后，野生型（WT）植株会积累 JA，而这一反应在 *nbr1* 植株中基本消失，并且在两种基因型中均受到升温的抑制（图 3c）。因此，升高温度似乎通过增强……来改变感染期间的激素平衡。
ABA 相关响应增强，同时抑制 JA 的积累，从而形成一种可能有利于细菌易感性增加、并提升 NBR1 介导调控重要性的生理环境。
在增温条件下，细菌侵染增强了自噬通量并促进了 NBR1 的周转（图 1，补充图 1、S2），表明在 ABA 信号传导对疾病结局尤为重要的条件下，选择性自噬被激活。总体而言，我们的结果表明，自噬有助于限制增温条件下的细菌易感性，因为 atg5 和 nbr1 突变体均表现出增强的病害表型（图 2）。近期研究开始揭示，自噬可通过选择性周转多种通路组分来调控 ABA 信号传导。例如，ABA 受体 PYR1、PYL3 和 PYL4 会在自噬缺陷突变体中积累，而 ABA 响应性转录因子 bZIP67 和 ABI5 则在 atg 背景下得到稳定（Contreras et al., 2025；Zhu et al., 2026）。此外，已有研究报道 NBR1 可在植物体内（in planta）与 ABI3、ABI4 和 ABI5 发生关联（Tarnowski et al., 2020），但这些转录因子是否通过 NBR1 介导的自噬被选择性降解，仍未得到明确解答。值得注意的是，ABI5 与 NBR1 的互作需要全长 NBR1，而 ABI3 和 ABI4 则能够与缺失 UBA 结构域的 NBR1 变体发生关联，这表明不同 ABA 响应性转录因子可能采用不同的识别机制（Tarnowski et al., 2020）。我们的研究结果为这一观点提供了直接支持，表明 ABI5 在 nbr1 和 atg5 突变体中均发生积累，且其周转部分依赖于 NBR1 介导的自噬（图 4）。ABI5 周转受损程度更为显著的翻译尚未完成。
与nbr1植物相比，atg5植物在22 °C下表现出相应的缺陷，同时两个突变体在29 °C下均观察到类似缺陷（图4c，补充图7），这表明在温暖条件下，NBR1成为ABI5降解的主要促成因子，而在对照温度下，其他依赖自噬的机制可能也参与其中。近期研究表明，AtATG8H可特异性地与ABI3和ABI5相互作用，进一步支持了ABA响应性转录因子能够被自噬机制直接识别这一观点（Contreras et al., 2025）。结合我们的研究结果，这些观察表明，自噬可在多个层面调控ABA信号传导，包括激素感知和转录输出。这种多层次调控可能为植物在不同环境和发育条件下精细调节ABA依赖性响应提供所需的可塑性。值得注意的是，我们的结果显示，在较高温度下，NBR1对ABI5周转的贡献增加（图4b，S7），表明升温增强了ABA信号传导对选择性自噬介导调控的依赖。
abi5突变对nbr1易感表型的遗传抑制，确定了ABI5是温暖条件下NBR1介导防御的关键下游组分（图5）。ABI5是ABA信号传导的核心转录调控因子，控制众多胁迫响应基因的表达（Skubacz et al., 2016）。尽管ABI5在种子成熟和非生物胁迫响应中的作用已得到广泛研究，但其在植物—病原体互作中的作用相对而言仍缺乏深入探索。值得注意的是，abi5突变体对表达III型效应因子HopAM1的P. syringae表现出增强的抗性（Goel et al., 2008）。由于HopAM1促进了……的激活。
ABA应答通路方面，这些发现确立了细菌效应因子活性、ABA信号传导、ABI5功能与细菌易感性之间的早期关联。效应因子介导的ABA信号操纵还得到AvrPtoB的进一步支持。AvrPtoB是一种Pst效应因子，据报道可靶向ABA 8′-羟化酶CYP707A1和CYP707A3，从而减少ABA分解代谢，促进ABA积累并增强毒力（Liu et al., 2022）。因此，尽管据我们所知，尚无直接靶向ABI5的假单胞菌效应因子见诸报道，但效应因子介导的ABA信号激活可能会提高植物对NBR1依赖性ABI5稳态调控的依赖程度。我们的结果进一步揭示了这一关联：在温度升高条件下，ABI5对细菌易感性的影响尤为明显（图5）。
ABI5在升温条件下促进细菌易感性的下游机制仍不清楚。我们的数据提示，叶绿体相关过程的改变可能促成这一表型。在受感染的nbr1植株中，SGR1表达升高并未伴随NYC1诱导；此外，与WT植株相比，nbr1植株保留了更高的叶绿素含量（图3g–h、补充图5e–f、补充图3c）。由于叶绿素分解产物能够影响假单胞菌感染期间的免疫反应和超敏细胞死亡（Mur et al., 2010），叶绿素代谢改变可能是增强的ABA/ABI5信号影响病害结局的一种途径。此外，鉴于ABA生物合成始于质体，且NBR1被认为参与胁迫条件下的叶绿体质量控制（Lee et al., 2023），质体稳态可能构成选择性自噬、ABA信号传导与 .
在升温条件下的感病性。然而，仍需开展进一步研究，以确定这些变化是否直接促成了在
nbr1
植株中观察到的感病表型。
与“NBR1在细菌毒力策略于升高温度下发挥作用时变得尤为重要”这一观点一致的是：在升温条件下，使用具有毒力的
Pseudomonas
菌株进行感染时观察到了
nbr1
的增强感病性；但在使用T3SS突变体
Pst-
Δ
hrcC
或能够诱导ETI的菌株
Pst-AvrRpt2
进行感染后，这种增强感病性基本消失（
Figure 2
，Supplemental Figure 4）。这一模式表明，在与具有功能性T3SS的病原菌进行相容互作时，NBR1依赖的抗性贡献在升高温度下变得尤为重要；而在应对分泌缺陷型菌株或由AvrRpt2强烈触发的ETI反应时，其作用则不那么显著。因此，升温可能使宿主处于一种生理状态，在该状态下，效应子介导的感病性，包括效应子驱动的ABA通路操纵，对疾病结局的影响更为有效或更为严重。在这方面，值得注意的是，已有研究报道升高温度能够增强细菌效应蛋白向植物细胞内的转运（
Huot et al., 2017
），并且
Pst
能够以依赖T3SS效应子的方式激活自噬（
Üstün et al., 2018
）。此外，已有研究表明，NBR1依赖的选择性自噬能够抵消HopM1介导的病害发展以及
Pseudomonas
侵染期间水渍状病斑的形成。因此，NBR1介导的ABA/ABI5信号调控可能充当一层保护机制，专门在有利于病原菌毒力发挥的环境条件下限制与效应子相关的感病性。在
AvrRpt2 触发的免疫反应可能反映了该 ETI 反应的强度；这种反应可能会掩盖或抵消在升温条件下、毒力感染过程中观察到的 NBR1 依赖性选择性自噬的作用（补充图 3、图 1、补充图 2）。
综上，我们的研究结果表明，NBR1 介导的选择性自噬是一种在高温条件下细菌感染期间限制 ABA/ABI5 依赖性易感性的机制。通过促进 ABI5 周转，NBR1 介导的选择性自噬可能发挥温度依赖性的缓冲作用，在温暖环境有利于细菌毒力时防止 ABA 信号过度增强（图 6）。本研究将选择性自噬与高温条件下植物免疫的激素重编程联系起来，并提示 NBR1 依赖性 ABA 信号调控可能是变暖环境中抗病性的重要组成部分。
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图 6.
NBR1 介导的选择性自噬在升温条件下限制 ABA 依赖性易感性的作用模型。
在高温条件下发生细菌感染时，细菌效应子会促进 ABA 积累和 ABA 信号传导，从而引发与易感性相关的反应。在野生型植物中，NBR1 介导的选择性自噬靶向 ABA 响应性转录因子 ABI5，并促进其自噬降解，从而限制 ABA 信号传导并抑制细菌增殖。在 nbr1 突变体中，选择性自噬受损会降低 ABI5 周转，导致 ABI5 积累、ABA 响应基因表达增强以及对细菌感染的易感性升高。因此，NBR1 介导的 ABI5 周转发挥调节作用，可缓冲 ABA 相关的易感性反应。
在增温条件下。
经费资助
本研究获得了阿根廷国家科学与技术促进局（授予ILL的PICT-2020-SerieA-01852和授予HRL的PICT-2019-0533）、阿根廷国家农业技术研究所（授予ILL的2023-PDI083）以及阿根廷国家科学与技术研究委员会（CONICET；授予ILL的PIP-GR 11220220100351CO和授予HRL的PIP-GI 11220200102984CO）的项目资助。LAR和JS分别为阿根廷国家大学校际委员会（CIN）和CONICET的奖学金获得者；AMYS和VLL为CONICET（阿根廷）科研辅助人员序列成员；ILL、VSM、MGT、NMC和HRL为CONICET（阿根廷）研究人员序列成员。
作者贡献
LAR、JS和ILL设计了研究并完成了大部分实验。AMYS参与了细菌生长测定和核酸提取。LAR和VLL构建了转基因株系和突变体株系，并进行了基因分型。MGT和VSF采用LC-MS/MS进行植物激素定量分析。LAR和ILL分析了数据。HRL和ILL构思并指导了本研究。ILL、NMC和HRL撰写了稿件，LAR、AMYS和VLL参与了撰写。所有作者均修订了稿件，批准了最终版本，并同意对本研究工作负责。
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。
补充图
补充图1. Pma感染和增温诱导7日龄拟南芥幼苗的自噬通量。
将7日龄35S:GFP–ATG8a幼苗浸没于模拟处理溶液（10 mM MgCl₂）或浓度为1 × 10□ CFU ml⁻¹的Pma菌液中，随后于22 °C或29 °C下培养1天。
(a)
通过免疫印迹检测GFP和GFP–ATG8a以评估自噬通量，并通过灰度分析，以游离GFP与GFP–ATG8a的比值进行定量。每个生物学重复由每个
处理。
(b)
显示根和地上部组织中 GFP–ATG8a 标记的自噬结构的代表性共聚焦图像，以及每个图像视野中自噬斑点数量的相应定量结果。每种处理分析了三个独立的生物学重复，每个重复采集三张图像。每个圆点代表一株植物。箱体表示中位数和四分位距，须线表示最小值和最大值。箭头标示用于定量的代表性 GFP–ATG8a 斑点。
补充图 2. 升温以不依赖于 III 型效应蛋白递送的方式增强感染诱导的自噬。
将模拟处理溶液、丁香假单胞菌番茄致病变种 DC3000（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，Pst）或 III 型分泌缺陷突变株 Pst-ΔhrcC 以 5 × 10□ CFU ml⁻¹ 的浓度浸润接种至 35S:GFGP-ATG8a 植株，随后在 22 °C 或 29 °C 下培养。接种后第 2 天，通过免疫印迹检测游离 GFP 和 GFP–ATG8a，并采用灰度分析定量条带强度，计算游离 GFP/GFP–ATG8a 比值，以评估自噬通量。图中展示了代表性免疫印迹及相应的定量结果。每个圆点代表一株植物。箱体表示中位数和四分位距，须线表示最小值和最大值。星号表示与模拟处理相比差异具有统计学显著性（*P < 0.05；双因素方差分析，随后采用 Benjamini、Krieger 和 Yekutieli 两阶段线性递增法进行假发现率校正）。
补充图 2. 升温以不依赖于 III 型效应蛋白递送的方式增强感染诱导的自噬。
将模拟处理溶液、丁香假单胞菌番茄致病变种 DC3000（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，Pst）或 III 型分泌缺陷型
突变株 Pst-ΔhrcC，浓度为 5 × 10□ CFU ml⁻¹，随后于 22 °C 或 29 °C 下培养。接种后第 2 天（dpi），通过免疫印迹检测游离 GFP 和 GFP–ATG8a，以评估自噬通量，并以游离 GFP/GFP–ATG8a 比值进行定量。图中展示了具有代表性的免疫印迹及相应的灰度定量结果。每个圆点代表一株植物。箱体表示中位数和四分位距，须线表示最小值和最大值。星号表示与模拟处理相比差异具有统计学显著性（*P < 0.05；采用双因素方差分析，随后使用 Benjamini、Krieger 和 Yekutieli 两阶段线性递进程序进行错误发现率校正）。
补充图 3. NBR1 是植物在升温条件下耐受 Pseudomonas cannabina pv. alisalensis 所必需的。
用浓度为 5 × 10□ CFU ml⁻¹ 的 Pma 对 WT 和 nbr1 植株进行渗透接种，随后于 22 °C 或 29 °C 下培养。接种后第 2 天对细菌生长进行定量。
(a)
细菌滴度，以每平方厘米叶片组织中的 CFU 数表示。
(b)
感病指数（SI），计算方法为 29 °C 下的细菌滴度与同一基因型在 22 °C 下的平均细菌滴度之比。
(c)
叶绿素 a 和 b 的浓度。每个圆点代表一次独立实验所得的平均值。在 (a) 和 (b) 中，箱体表示中位数和四分位距，须线表示最小值和最大值。在 (c) 中，柱形表示平均值 ± 标准误（SE）。星号表示差异具有统计学显著性（*P < 0.05，P < 0.01，*P < 0.001）；统计分析采用线性混合效应模型，将基因型和温度作为固定因子，将实验作为随机因子，随后对估计边际均值进行预先设定的两两比较。
补充图 4.
NBR1依赖的细菌感染耐受性在基础免疫中发挥作用，但在AvrRpt2介导的效应子触发免疫（ETI）中并非必需。
以5 × 10□ CFU ml⁻¹的浓度，将丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（Pst）、III型分泌系统缺陷突变体Pst-ΔhrcC或表达AvrRpt2的丁香假单胞菌番茄致病变种（Pst-AvrRpt2）浸润接种于野生型（WT）和nbr1植株，随后置于22 °C或29 °C下培养。接种后2天测定细菌增殖量。
(a)
22 °C和29 °C下的细菌滴度，以每平方厘米叶片组织中的菌落形成单位（CFU）表示。
(b)
感病指数（SI），计算为同一基因型、同一菌株在29 °C下的细菌滴度与其在22 °C下的平均细菌滴度之比。每个圆点代表一株独立植株。箱体表示中位数和四分位距，须线表示最小值和最大值。星号表示差异具有统计学显著性（*P < 0.05，***P < 0.001；(a)采用Kruskal–Wallis检验，(b)采用双因素方差分析，随后使用Benjamini、Krieger和Yekutieli两阶段线性递增程序进行假发现率校正）。
补充图5。
升温条件下细菌感染期间WT和nbr1植株中水杨酸及脱落酸相关基因的表达。以模拟接种溶液或浓度为5 × 10□ CFU ml⁻¹的Pma浸润接种WT和nbr1植株，随后置于22 °C或29 °C下培养。在接种后1天（1 dpi）测定水杨酸（SA）相关基因(a) PR1和(b) ICS1，以及脱落酸（ABA）相关基因(c) NCED3、(d) ABI5、(e) SGR1和(f) NYC1的相对转录水平，并以PP2A-A3进行归一化。每个圆点代表一株独立植株。箱体表示中位数和四分位距，须线表示最小值和最大值。星号表示统计学上
显著差异（*P < 0.05；采用双因素方差分析或 Kruskal–Wallis 检验，随后使用 Benjamini、Krieger 和 Yekutieli 两阶段线性递增程序进行错误发现率校正）。
补充图6. 拟南芥幼苗中 ABI5–Flag 与 NBR1 发生共免疫沉淀。
将野生型（WT）和 atg5 背景下表达 pSuper:ABI5–Flag 的幼苗，以及表达 BIM1–Flag（Liang 等，2018）的阴性对照幼苗，在 22 °C 下培养14天。使用抗 NBR1 磁珠对蛋白质提取物进行免疫沉淀。图中显示了（a）免疫沉淀前的输入样品和（b）免疫沉淀组分。红色箭头指示 ABI5–Flag 和 BIM1–Flag 蛋白。
补充图7. 模拟处理植株中 ABI5–GFP 的基础周转。
将 WT、nbr1 和 atg5 背景下的 pSuper:ABI5–GFP 植株在 22 °C 或 29 °C 下孵育1天。使用抗 GFP 抗体通过免疫印迹检测 GFP 和 ABI5–GFP，以评估 ABI5 的周转，并通过灰度分析计算游离 GFP/ABI5–GFP 比值进行定量。图中展示了代表性免疫印迹及相应的定量结果。每个圆点代表一株独立植株。箱体表示中位数和四分位距，须线表示最小值和最大值。对经 log₂ 转换的比值进行方差分析，随后使用 Benjamini、Krieger 和 Yekutieli 两阶段线性递增程序进行错误发现率校正，以评估统计学显著性。星号表示与 WT 相比存在统计学显著差异（***P < 0.001）。
补充图8. nbr1 abi5 双突变体的 PCR 基因分型。
使用基因特异性引物（RP+LP）和 T-DNA 边界引物（LB），对 WT、nbr1 abi5 和 nbr1 abi5 植株的基因组 DNA 进行 PCR 分析，以确认相应突变等位基因的存在。代表性扩增产物为
所示。
致谢
感谢中国农业大学生物学院李继刚教授提供 pSuper:ABI5–3×Flag 和 pSuper:ABI5–GFP 构建体。感谢 Germán Robert 博士（阿根廷 UDEA，CONICET-INTA）、Georgina Fabro 博士（阿根廷 CIQUIBIC，CONICET-UNC）和 Elina Welchen 博士（阿根廷滨海农业生物技术研究所，CONICET–UNL）提供本研究所用的植物材料。
已声明的资助方信息
阿根廷国家科学技术促进署
，PICT-2020-SerieA-01852
，PICT-2019-0533
阿根廷国家农业技术研究所
，2023-PDI083
阿根廷国家科学与技术研究理事会
，PIP-GR 11220220100351CO
，PIP-GI 11220200102984CO
阿根廷全国大学校际理事会
脚注
根据《作者须知》（
https://academic.oup.com/plphys/pages/General-Instructions
）中所述政策，负责分发与本文所报告研究结果密切相关材料的作者为 Ignacio Lescano López。
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发布于2026年7月2日。
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选择性自噬通过依赖 NBR1 的 ABI5 调控，在升温条件下促进抗细菌免疫
Lara
Anzardi Ruffino
,
Joaquín
Suárez
,
Anahí Mara
Yáñez Santos
,
Virginia Laura
Lobatto
,
Verónica Sofía
Mary
,
Martín Gustavo
Theumer
,
María Clara
Mesquida Nardini
,
Nicolás Miguel
Cecchini
,
Hernán Ramiro
Lascano
,
Ignacio
Lescano López I
bioRxiv
2026.07.01.735842;
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735842
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选择性自噬通过依赖 NBR1 的 ABI5 调控，在升温条件下促进抗细菌免疫
Lara
Anzardi Ruffino
,
Joaquín
Suárez
,
Anahí Mara
Yáñez Santos
,
Virginia Laura
Lobatto
,
Verónica Sofía
Mary
,
Martín Gustavo
Theumer
,
María Clara
Mesquida Nardini
,
Nicolás Miguel
Cecchini
,
Hernán Ramiro
Lascano
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Ignacio
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关键词：选择性自噬 · NBR1依赖性调控 · ABI5蛋白周转 · 脱落酸信号 · 植物抗细菌免疫 · 高温胁迫
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.01.735842v1?rss=1