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担子菌玉米黑粉菌（*Ustilago maydis*）是研究病原体—宿主相互作用的特征明确的模式生物，并在广泛的生物技术应用中具有重要价值。本研究旨在开发光诱导分子工具，用于动态研究信号网络和真菌—宿主间的通讯，并支持代谢工程策略。具体而言，光控光遗传开关可实现定量及时空控制，具有微创性且可逆。我们构建了两种基于 LOV 结构域的蓝光诱导基因表达开关，分别用于上调（Blue-ON）和下调（Blue-OFF）基因表达，并在玉米黑粉菌的芽孢体和菌丝中对其进行了功能表征。利用这些光开关动态控制范围广、响应动力学快的优势，我们通过调节极性因子 Rac1 及其组成型活性突变体 Q61L 的水平，实现了对细胞形态的控制，诱导单倍体芽孢体形态向丝状形态转变。除展示如何通过精确调控效应因子的表达水平来研究真菌—植物相互作用外，我们还通过两项原理验证应用，展示了对玉米黑粉菌侵入植物组织以及肿瘤形成机制进行靶向控制的能力。为此，我们将玉米黑粉菌的两种效应因子 See1（Seedling efficient effector 1，幼苗高效效应因子 1）和 TIN2（Tumor inducing 2，肿瘤诱导因子 2）置于 Blue-ON 和 Blue-OFF 开关的控制之下，并在玉米叶片上检测肿瘤形成情况。总之，本研究确立了蓝光开关作为调控玉米黑粉菌形态发生和致病性的有效工具。
LUstiGE，光响应型玉米黑粉菌基因表达：利用光遗传学控制玉米病原真菌玉米黑粉菌的形态发生与致病过程 | bioRxiv
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LUstiGE，光响应型玉米黑粉菌基因表达：利用光遗传学控制玉米病原真菌玉米黑粉菌的形态发生与致病过程
玉米黑粉菌
Kun
Tang
，
Micail David
Müller
，
Lisa
Hüsemann
，
Weiliang
Zuo
，
Anna
Rybecky
，
Nicole
Heucken
，
Johannes
Postma
，
Lasse
van Wijlick
，
Gunther
Doehlemann
，
Michael
Feldbrügge
，
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Matias D.
Zurbriggen
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.06.25.734638
Kun Tang
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杜塞尔多夫大学合成生物学研究所
，杜塞尔多夫，
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Micail David Müller
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Lisa Hüsemann
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Weiliang Zuo
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，科隆，
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⁴ 德国杜塞尔多夫大学 CEPLAS 植物科学卓越研究集群，Universitätsstr. 1，40225 Düsseldorf
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担子菌 *Ustilago maydis*
是一种研究病原体—宿主相互作用的特征明确的模式生物，也因其在广泛生物技术应用中的潜力而备受关注。本研究旨在开发光诱导分子工具，用于动态研究信号网络和真菌—宿主通讯，并服务于代谢工程。具体而言，光控光遗传开关具有定量、时空可控的特点，侵入性低且可逆。我们构建了两种基于 LOV 结构域的蓝光诱导基因表达开关，分别用于上调（Blue-ON）和下调（Blue-OFF）基因表达，并在玉米黑粉菌（*U. maydis*）的芽孢和菌丝中进行了功能表征。利用这些光开关动态范围宽、响应迅速的特点，我们通过调控极性因子 Rac1 及其组成型活性突变体 Q61L 的水平，实现了对细胞形态的控制，诱导细胞由单倍体芽孢形态转变为丝状形态。除展示如何通过精确调控效应蛋白的表达水平来研究真菌—植物相互作用外，我们还通过两项概念验证应用，展示了对 *U. maydis* 丝状真菌侵入植物组织及肿瘤形成机制的靶向控制。为此，我们将 *U. maydis* 的两种效应蛋白 See1（Seedling efficient effector 1）和 TIN2（Tumor inducing 2）置于 Blue-ON 和 Blue-OFF 开关的控制之下，并在玉米叶片上检测肿瘤形成。综上，本研究确立了蓝光开关作为控制 *U. maydis* 形态发生和致病性的有效工具。
引言
真核模式微生物 *U. maydis* 具有较小且注释完善的测序基因组，可用于比较基因组学研究】【。
分析以及对信号通路及其组分与其他病原体之间关系的直接研究。借助高效的转化体系以及首批已建立的合成生物学工具^1,2，该生物不仅成为生产高价值化学品的适宜宿主^3,4，还已发展成为一种模式生物，可用于深入理解真核生物营养型植物病原体、感染动态以及长距离RNA运输^5–9。
合成生物学方法的实施已被证明有助于揭示并调控复杂的细胞机制。这些实验策略和分子工具能够推动快速、便捷且迫切需要的生物技术过程的开发。为此，研究人员运用工程学原理设计并构建分子工具，用于复杂天然网络和合成网络及其开关的组装与靶向调控^10–14。与使用化学诱导剂相比，后者通常需要施加具有毒性的分子，而光则能够提供高空间和时间分辨率以及可逆性，同时具有极低的侵入性。多年来，研究人员已在哺乳动物细胞系统、植物、细菌和酵母中建立了大量光诱导型ON/OFF开关，用于调控广泛的细胞过程^15–18。然而，除碳源调控型启动子P_CR G^19等分子操纵方法外，目前尚无光控开关应用于担子菌真菌玉米黑粉菌（*U. maydis*）中。光诱导工具的构建将为以下研究提供关键的实验优势：（i）研究基因调控网络和代谢网络；（ii）改进并精细调控这一模式系统，以用于基础分子、细胞……
以及生理机制和真菌—植物互作；（iii）拓宽生物技术应用的范围。
蓝光感知型光氧电压（LOV）蛋白可能是最常用于真核生物的光响应系统
15
。LOV 蛋白以黄素衍生物为辅因子（主要为黄素单核苷酸，FMN），其可被蓝光激活的吸收带位于约 450 nm 处。受光激活的 LOV 结构域会以恢复动力学返回基态非活性状态，其恢复时间差异很大，从数秒到数小时不等。LOV 蛋白已被广泛改造为光控开关，用于操控原核生物、动物、真菌和植物中的基因表达、蛋白质亚细胞定位、酶活性及代谢通路
16–18,20–22
。
本研究在玉米黑粉菌（
U. maydis
）中设计并应用了光诱导基因表达系统，具体包括 Blue-ON 和 Blue-OFF 光控开关；对其性能进行了定量表征，并通过调控 Rac1
Q61L
基因表达来控制细胞形态。该小 GTP 酶的突变体处于组成型活化状态，持续保持 GTP 结合状态，因而会扰乱肌动蛋白细胞骨架的调控，导致严格极性顶端生长丧失，并引发异常形态
23
。这些工具能够对
U. maydis
进行精确的时空基因调控，从而为未来研究光对动态细胞过程的控制提供了条件。此外，我们还利用光遗传系统操控
U. maydis
–
玉米（
Zea mays
）病原系统中的效应基因表达（例如 See1、TIN2）
7
，
24
，从而能够在生物营养型侵染过程中实时、受光调控地控制基因功能。这一方法有望加深我们对侵染机制的理解，并优化趁
生物基应用的先进方法
25
结果
用于玉米黑粉菌的诱导系统设计
玉米黑粉菌（*U. maydis*）是一个特征研究极为充分的模型系统，广泛应用于基础研究和应用研究。本研究旨在构建、功能表征并应用光诱导光遗传系统，以（i）了解真菌细胞生物学过程，例如极性生长和菌丝发育；（ii）深入认识效应蛋白及其对宿主的重编程作用。为此，我们在玉米黑粉菌细胞中开发并测试了光调控基因表达系统，以提供可用于多种光遗传学应用的工具箱（图1a）。要在玉米黑粉菌中建立光诱导系统，必须具备诱导型启动子、报告基因和转录因子等合成元件。其中一项关键要求是构建含有靶DNA序列和最小巨细胞病毒启动子（P_CMVmin）的启动子，并在目标生物体中实施和测试，以确保其基础表达水平较低。因此，如前所述，相应的DNA结合结构域经过密码子优化，在组成型启动子的控制下表达，并克隆至用于插入 *cco1* 位点的载体中（图1b）^2。
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图1. 玉米黑粉菌细胞工程设计。
（a）玉米黑粉菌（*U. maydis*）的生命周期和细胞形态。示意图参考 Piepenbring^49 和 Lanvel^8 绘制。蓝色矩形标示了本研究中采用光遗传学进行控制的生物学过程：（上）在 AB33 菌株中诱导光控基因表达，以调控细胞形态；（下）利用单倍体自育菌株 SG200，通过光调控玉米黑粉菌与植物的相互作用。
（b）用于诱导目的基因（Goi）表达的构建体分子架构，三分彩
以及相应的驱动质粒，用于组成型表达由 DNA 结合结构域和转录激活因子构成的融合蛋白。
(c)
基于 PIP/(PIR)₃ 系统的 FLuc 报告菌株和驱动子+报告菌株示意图，以及 2 h、4 h 和 8 h 后的表达水平。数据表示四个生物学重复的均值及一个标准差，并与双侧独立 Student’s t 检验结果进行比较。****，p ≤ 1e-4。源数据见本文。
虽然已有多种转录激活系统，但目前仅有 TetR 系统被证明可在玉米黑粉菌（*U. maydis*）中发挥作用²⁶,²⁷。为进一步扩展分子遗传学工具箱，我们对一系列与转录激活因子 VP16 融合的 DNA 结合蛋白，以及由相应 DNA 操纵子序列和最小启动子构成的正交启动子进行了表达定量。通过测定萤火虫荧光素酶（FLuc）报告基因的活性，并与组成型 Pₒₜₑf₂ 启动子进行比较，分析这些启动子的强度（图 S1）。测试了以下报告构建体：(UAS)₅（含有 5 个上游激活 DNA 序列重复，可与 Gal4 高效结合）、(PIR)₃（含有 3 个抗生素 pristinamycin 操纵子重复序列、可与 PIP 结合的 pristinamycin 响应元件），以及 (tetO)₁₃（含有 13 个四环素操纵子重复序列、可与 TetR 结合的四环素响应元件）²²,²⁸,²⁹（图 S1）。随后，我们通过同源重组或 Cas9 介导的插入，在玉米黑粉菌基因组的 *upp3* 位点构建了稳定的报告菌株³⁰。由于在缺乏转录激活因子的情况下背景表达较高，大多数构建体均不适用。我们选定 (PIR)₃ 启动子作为有前景的候选者；该启动子的基础信号较低，且在加入……后能够稳健地驱动基因表达。
组成型转录激活因子（PIP-VP16）（图 1c）。除时间控制外，其中一些系统还可通过化学触发剂调节表达，并以剂量依赖的方式进行微调。当存在相应的小分子配体时，配体应暂时阻止反式激活因子与其操纵子结合，从而降低表达（OFF 系统^31）。为评估这一可能性，我们测定了三种浓度的普利斯汀霉素条件下的报告基因活性：低剂量（20 µg/ml）、高剂量（200 µg/ml）和极高剂量（2,000 µg/ml）。然而，极高剂量对玉米黑粉菌细胞培养的毒性过强。与预期相反，加入普利斯汀霉素反而提高了 FLuc 发光信号（图 S2）^32。这种意料之外的化学毒性及其反常的诱导效应，凸显了在玉米黑粉菌中使用小分子触发剂的严重局限，因此促使我们开发一种更精确的非化学方法，即光诱导光遗传开关。
蓝光诱导玉米黑粉菌培养物中的基因表达（Blue-ON 系统）
建立正交可调控的合成启动子系统（PIP-VP16/(PIR)₃）后，我们在玉米黑粉菌菌株的基因组中引入了光遗传学基因表达控制的能力。为此，我们改造并定制了此前在哺乳动物细胞中开发并测试过的光诱导基因表达系统^22,33–35。我们首先设计了一种基于 TULIPs 的蓝光诱导系统^21,22。基于 PIP 的 TULIP Blue-ON 是一种所谓的双组分系统，或称分体式转录因子；该系统利用燕麦（*Avena sativa*）光敏色素-1 中经工程化改造的 LOV2 结构域与 ePDZb 结构域，在蓝光（λ_max = 455 nm）响应下发生异源二聚化（图 2a）。在……
在菌株构建与表征过程中，对引入的光开关进行了功能测试（图 2b）。在具有 AB33 基因组背景的双核孢子细胞培养物中测定蓝光诱导效果，并按照常规方法定量表征光强、基因表达动力学以及额外辅因子 FMN 的添加效果，以评估其是否会在真菌细胞内成为限制因素（图 2c）。光剂量照射测试显示，在 20 µmol m⁻² s⁻¹ 蓝光下照射 4 h，诱导倍数为 7 倍；照射 8 h 后，诱导倍数为 5 倍（图 2c）。值得注意的是，向培养基中添加黄素辅因子可进一步增强基因表达，表明内源性黄素水平可能构成限制因素。
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图 2.
*U. maydis* 培养物中 Blue-ON 系统的功能表征。
(a) 基于 LOV 结构域的 Blue-ON 光遗传开关在 *U. maydis* 中诱导基因表达的分子机制。
(b) 为实现 Blue-ON 系统而进行基因工程改造的 *U. maydis* 菌株。Blue-ON 系统包含 pOPTO1 构建体，其中 PIP 操纵序列（PIR）₃ 位于 P_CM₍V₎ 最小启动子上游，用于控制萤火虫荧光素酶（FLuc）报告基因的表达；该构建体稳定整合于 *upp3* 位点。在 *cco1* 位点，双向组成型启动子 dP_CM₍V₎ 向上游驱动 ePDZ-VP16-NLS 融合构建体的表达，向下游驱动 PIP-AsLOVpep 融合构建体的表达。仅含 pOPTO1 的菌株用作阴性对照。系统的阳性对照包含整合于 *upp3* 位点的 pOPTO1，以及在组成型 P_O2tef 启动子控制下、整合于 *cco1* 位点的 PIP-VP16-NLS。
(c)
在黑暗中培养 4 h 和 8 h 后，或以 20 μmol m⁻² s⁻¹ 的光子通量密度接受蓝光照射（λ = 455 nm）后测定萤火虫报告基因活性。此外，加入 LOV 结构域辅因子 FMN，使其终浓度为 5 μM。按照“材料与方法”中所述的萤火虫快速筛选法，在 OD₆₀₀ 标准化为 0.5 的培养物中测定所有菌株的报告基因活性。数据为四个生物学重复的均值。
(d) 在诱导后的 AB33 菌丝中培养 16 h 后，对 FLuc 表达量进行定量。在硝酸盐基本培养基中诱导形成菌丝后，分别测定无细胞培养上清液和澄清的全细胞裂解液中的生物发光信号。通过体积换算计算报告基因总活性，并根据 BCA 法测得的细胞内总蛋白含量进行归一化。c、d 中的数据表示四个生物学重复的均值及一个标准差，并与双侧独立样本 Student’s t 检验的结果进行比较。，1e-3 < p ≤ 1e-2；*，1e-4 < p ≤ 1e-3；****，p ≤ 1e-4。本文提供了源数据。
为覆盖玉米黑粉菌（*U. maydis*）的完整生命周期，我们测定了其在双态转变期间及真菌菌丝中的萤火虫荧光素酶基因表达量，分别分析细胞外和细胞内组分，随后根据细胞绝对蛋白质量进行归一化。在诱导菌丝形成、转入硝酸盐基本培养基（NM）后，以光子通量密度为 20 µmol m⁻² s⁻¹ 的单色蓝光（455 nm）照射培养物 16 h，观察到表达量提高了 9.4 倍（图 2d）。
蓝光诱导的玉米黑粉菌培养物表达抑制（Blue-OFF 系统）
来自 *Erythrobacter litoralis* 的 EL222
作为单一分子组分发挥作用，其中蓝光（λ_max = 455 nm）可直接调节其对称为 C120 的序列的 DNA 结合亲和力（图 3a）。受光照后，两种蓝光开关均会触发一个短结构域的释放，该结构域通过 Jα 螺旋与 LOV 结构域相连。在蓝光下，EL222 蛋白会暴露出原本被遮蔽的 HTH（螺旋-转角-螺旋）基序。这使其能够与另一个 EL222 蛋白同源二聚，随后结合靶 DNA 序列 C120³⁶。
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图 3.
在玉米黑粉菌（*U. maydis*）培养物中对 Blue-OFF 系统进行功能表征。
(a) 基于 EL222 的蓝光调控基因表达抑制系统（Blue-OFF）在玉米黑粉菌中的分子作用机制。
(b) Blue-OFF 菌株由两个稳定整合的组分构建而成：i）在 *upp3* 位点，将 5 个 EL222 操纵子序列重复单元（C120）₅置于 P_CMV 最小启动子上游，以驱动萤火虫荧光素酶报告基因（FLuc）的表达（pOPTO2）；ii）在 *cco1* 位点，蓝光光感受器 EL222 与来源于玉米黑粉菌的转录抑制结构域 Sql1 融合，并置于组成型 P_O2tef 启动子的调控之下。对照菌株仅在 *upp3* 位点整合报告构建体 pOPTO2。此外，还测试了由组成型启动子 P_ote f 驱动的 Fluc，作为对照。
(c) 测定 Blue-OFF 培养物及对照菌株的报告活性。培养物接受蓝光照射 2.5 h 或 6 h，光强为 20 μmol m⁻² s⁻¹（λ = 450 nm），或保持黑暗培养。以 5 μM 浓度加入 LOV 结构域的辅因子 FMN。所有菌株的报告活性均在 OD₆₀₀ 归一化至 0.5 的培养物中测定。所示数据为三次生物学重复的均值。
以及三个技术重复。
(d)采用自主搭建的光照板装置（LPA）测试了不同强度的蓝光（0–10 μmol m⁻² s⁻¹）。
(e)诱导16 h后，对AB33菌丝中的FLuc表达水平进行定量。在硝酸盐最小培养基中诱导菌丝形成后，分别测定无细胞培养上清液和澄清的全细胞裂解液中的生物发光信号。通过按体积校正计算报告基因的总体活性，并以细胞内总蛋白含量进行归一化；总蛋白含量采用BCA法测定。d、e中的数据表示四个生物学重复的均值及一个标准差，并与双侧独立样本Student’s t检验结果进行比较。，1 × 10⁻³ < p ≤ 1 × 10⁻²；*，1 × 10⁻⁴ < p ≤ 1 × 10⁻³；****，p ≤ 1 × 10⁻⁴。本文提供了源数据。
我们仅使用含有(C120)₅-PhCMVmin启动子的系统测试了基于EL222的调控系统，并采用了两种EL222变体：一种与VP16转录激活因子融合，另一种与Sql1阻遏蛋白融合（图S3）。前者构成蓝光开启（Blue-ON）系统，后者构成蓝光关闭（Blue-OFF）系统。仅含最小启动子的构建体表现出相对较高的FLuc表达水平（图S1）。为构建蓝光关闭系统⁽³⁴⁾，我们将转录激活因子替换为转录阻遏结构域，即玉米黑粉菌（U. maydis）自身的阻遏蛋白Sql1（图3a、b，氨基酸1–359）。图3c显示，最小启动子具有显著的本底活性：在2.5 h和6 h时，黑暗条件与蓝光照射条件下的FLuc水平相近。光照后，无论是否添加FMN，该阻遏蛋白均能显著抑制报告基因表达。值得注意的是，2.5 h后，FLuc信号降至10%；额外添加FMN时，则降至约5%。这种抑制】【。
这种效应在 6 h 时进一步增强，信号降至 3%，且不受 FMN 补充的影响（图 3c）。
我们通过逐步提高培养物所受单色蓝光的强度，评估了 Blue-OFF 光开关实现有效转录抑制对光强的依赖性。我们使用此前开发的定制光照培养板装置（Light Plate Apparatus，LPA；材料与方法）^33,37，在 0 至 10 µmol/m²s 的光强范围内测试 Blue-OFF 系统。处理 2.5 h 后，担孢子中的 Fluc 生物发光信号降低了 10.4 倍（图 3d）。
在菌丝中评估并按总蛋白含量归一化后，这一效应更加显著。具体而言，在诱导丝状生长的培养物中，严格避光培养 16 h 时的 FLuc 表达量约为蓝光照射条件下的 126 倍（图 3e）。
蓝光调控细胞形态发生的开关
接下来，我们测试了这些光遗传学工具能否调控细胞形态发生，重点考察由担孢子向菌丝的双相转变（图 4）。基于 Mahlert 等人此前的研究^23，我们构建了一个 Blue-OFF 菌株，用于控制组成型活性极性因子突变体 Rac1^Q61L 的表达。由于该突变体可驱动细胞壁各向同性扩张并形成大型极性液泡，因此能够为开关活性提供清晰且具有区分度的形态学读出（图 4a）。
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图 4.
蓝光对 U. maydis 中 Rac1^Q61L 表达的光遗传学调控。
(a)
Blue-OFF 光开关调控 Rac1^Q61L 表达的示意图。在黑暗条件下，(C120)₅ 启动子保持组成型活性，驱动 Rac1^Q61L 突变体表达并诱导……
异常表型。在蓝光（20 µmol m⁻² s⁻¹）照射下，光响应型 EL222 结构域与合成启动子结合，从而招募内源性 *Ustilago* 转录抑制结构域（Sql1）并抑制转录。Rac1^Q61L 突变导致细胞壁各向同性扩张，并在细胞两极形成大型液泡（示意图改编自 Mahlert et al., 2006）
23
。
(b)
用于光遗传学实验的培养平台。培养物置于含有定制 3D 打印挡板插件的六孔板中，在单色蓝光（λ = 455 nm）下培养，光子通量密度为 20 µmol m⁻² s⁻¹。
(c)
对暗处理和光处理培养物在指定时间点的形态表型进行定量。为展示群体表型的可逆性，将暗处理样品的一份等分试样在 T₁（24 h）后转移至蓝光下，并分别在额外照射 24 h（T₂′）和 48 h（T₃）后进行评估。
(d)
暗处理和光处理培养物中主要表型的代表性图像。上图为微分干涉对比（DIC）显微图像；下图为碘化丙啶（PI）染色后的对应荧光图像，用于显示膜完整性受损情况。比例尺 = 20 µm。
为确保液体培养期间光照均匀且通气充分，我们将细胞培养于装有定制 3D 打印挡板插件的标准六孔板中（图 4b）。该装置使培养物在连续单色蓝光（λ = 455 nm）照射下保持充分混匀，光强为 20 µmol m⁻² s⁻¹。
利用这一平台，我们评估了工程化群体在不同光照条件下的形态差异。在初始时间点（T₀），培养物几乎完全由正常的成人视频组成。
孢子（99.0%）。将培养物置于黑暗中孵育以诱导突变等位基因表达后，细胞迅速呈现出预期的异常表型。黑暗孵育24 h（T₁）后，43.2%的细胞表现出突变型形态。此趋势持续发展，48 h（T₂）后，87.9%的细胞出现严重液泡化。相反，持续蓝光照射可有效抑制突变等位基因。在这一条件下，细胞仍以孢子形态为主（24 h时占98.1%）；至48 h，仅有极少数细胞出现形态异常（图4c）。作为阴性对照，我们同时检测了野生型菌株，以及用于Blue-OFF系统的遗传背景菌株（携带Δcco1和Δupp3缺失）。与预期一致，在所有光照条件和时间点下，这些对照菌株均保持孢子形态（图S4）。
为确定这种极端的各向同性扩张是否影响细胞活力，我们进行了碘化丙啶（PI）染色，以评估细胞膜完整性并识别受损细胞。PI染色清楚表明，膨大的Rac1^Q61L突变体细胞膜严重受损，最终导致细胞裂解和死亡（图4d）。
尽管该突变表型在单细胞水平上具有致死性，我们仍测试了Blue-OFF开关的调控能力，以判断培养物能否恢复。我们将一份经黑暗处理、形态异常的培养物（T₁后）重新置于蓝光照射下。值得注意的是，群体形态明显转向以孢子形态为主；重新照光24 h（T₂）和48 h（T₃）后，正常孢子比例均达到约74%（图4c）。对恢复中培养物的显微观察发现，其中存在……
数个细长、濒死的突变细胞中，新的健康孢子正通过出芽不断涌现（图4d）。这表明，即使在诱导出终末表型后，Blue-OFF系统仍能快速、精准地调控玉米黑粉菌的细胞过程。
通过光遗传学调控玉米黑粉菌幼苗高效效应蛋白1，以诱导肿瘤形成
在发育生物学和病理学领域，实现对肿瘤形成的严格、精准调控一直是长期追求的目标，因为自然肿瘤发生往往具有随机性、不可逆性，并受到复杂且尚未充分阐明的宿主-微生物信号或细胞自主信号的影响⁸,³⁸–⁴⁰。能够在时空上限制肿瘤起始的诱导系统，可使研究人员以前所未有的分辨率剖析早期转化事件、检验毒力作用窗口并模拟肿瘤形成。例如，通过光诱导表达或分泌来控制效应蛋白的释放，或有助于研究作用时机和剂量对宿主反应的影响。我们着手实现对叶片特异性效应蛋白See1（幼苗高效效应蛋白1，Seedling Efficient Effector 1）的光遗传学调控⁴¹,⁴²。See1可激活宿主DNA合成，从而直接促进维管束鞘细胞中的肿瘤形成（图5a）。
为实现对玉米黑粉菌核心效应蛋白See1的光诱导调控，我们采用了两种光遗传系统：基于LOVpep/ePDZ的Blue-ON开关（图S5a）和基于EL222的Blue-OFF开关（图5b）。为实现对表达量的非侵入式实时定量，我们将See1编码序列与FLuc融合。对于Blue-ON系统，我们将See1-FLuc置于(PIR)₃启动子的控制之下，构建了报告菌株（s1836）和Blue-ON-See1菌株（s1877）（图S5a、b）。一
还构建了阳性对照菌株（命名为 s333B），其中 PIP-VP16 插入了 cco1 位点（图 S5a）。对于 Blue-OFF 方法，我们采用了 EL222-Sql1 系统：通过将 Potef-EL222-Sql1 整合至 cco1 位点，并将 (C120)5-PCMVmin-See1-FLuc 整合至 upp3 位点，构建了菌株 s1874。还构建了一个不响应光照的对照菌株（s1835），该菌株仅在 upp3 位点携带 (C120)5-PCMVmin-See1-FLuc（图 5c）。所有菌株均来源于单一病原型祖菌株 SG200。
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图 5.
利用 Blue-OFF 调控 U. maydis 中 See1 的表达，对玉米叶片中的肿瘤形成进行光遗传学调控。
(a)
玉米幼苗中肿瘤形成的示意图。See1 与防御反应诱导的磷酸化玉米 SGT1（Skp1 的 G2 等位基因抑制因子）相互作用，以阻止下游免疫反应的激活（上方细胞）。在缺少 See1 的情况下，SGT1 发生磷酸化，从而导致免疫激活（下方细胞）。
(b)
Blue-OFF 介导的 See1 基因抑制的光遗传学调控功能分子描述；以及
(c)
工程化菌株。
(d)
在 OD600 = 0.8 时测定 FLuc 活性（按 OD600 归一化）。对 Blue-OFF-See1 菌株（s1874）和对照菌株（s1835）测试了蓝光强度梯度（0–10 µmol m⁻² s⁻¹）。
(e)
对指数生长期 U. maydis 菌株中的 See1 mRNA 进行 RT-qPCR 定量。
(f)
See1 感染玉米幼苗的实验流程。
(g)
代表性叶片照片，显示感染 SG200 和 Blue-See1 的 GB 玉米品种在感染后 12 天（dpi）的表型差异。
(h)
将暗处理（D）或蓝光处理（B）的 U. maydis Blue-OFF-See1 菌株注射入植物后的致病性表型；分别在感染后 6 天、9 天和 12 天对样品进行评估。
(i)
新鲜
接种后9天采集的叶片圆片。
(j) 在三轮黑暗/蓝光循环条件下，接种后9天的叶片圆片中FLuc在148 h内的动态变化（时间响应）；光照条件如图所示。
(k) 通过RT-qPCR定量感染Blue-OFF-See1的叶片中FLuc和See1的表达量。e、f和k中的数据表示3个生物学重复的均值 ± SD。i中的数据来自一片感染叶上的3个叶片圆片，共采集了4片感染叶。e、i和k中的数据采用t检验进行显著性分析，f中的数据采用ANOVA检验；ns，不显著；*，1e-2 < p ≤ 0.05；，1e-3 < p ≤ 1e-2；*，1e-4 < p ≤ 1e-3；****，p ≤ 1e-4。本文提供源数据。
我们首先检测了不同光照条件下 *U. maydis* 菌株中的表达情况，发现白光（117 µmol m⁻² s⁻¹）和单色蓝光（455 nm，10 µmol m⁻² s⁻¹）诱导的FLuc表达水平相当（图S5c、d）。使用Blue-OFF菌株进行蓝光强度梯度实验（0–10 µmol m⁻² s⁻¹）发现，5 µmol m⁻² s⁻¹已足以抑制大部分FLuc表达，而10 µmol m⁻² s⁻¹可实现更严格的抑制，动态比值为27倍（图5d）。随后，我们在无菌培养条件下通过RT-qPCR进一步定量了光调控的See1表达（图5e）。
随后，我们评估了光遗传学调控对植物感染的影响。如前所述，将经光照处理的无菌培养物注入7至9日龄幼苗的叶片中²˒⁷˒⁴¹。接种点位于植株茎部中央，周围有三片叶，这在一定程度上限制了病原体受到的光照。接种后3至15天采集叶片（图5f）。Blue-ON和Blue-OFF系统均可成功感染叶片。然而，并未观察到明显的……
在Blue-ON系统中观察到严重的肿瘤形成（图S5c）。这与先前的报道一致：异位过表达效应基因See1并未提高玉米叶片中*U. maydis*的毒力⁴¹。相比之下，Blue-OFF系统在受感染的植物叶片中表现出功能性光响应（图5g）。尽管注射了蓝光处理培养物和黑暗培养物的植株均在长日照光周期下生长，但对接种后6至12天（dpi）的肿瘤进行评分后发现，接种了在黑暗中培养的*U. maydis*培养物的叶片，其肿瘤形成率更高（图5h）。因此，我们推测，离体培养物中较高的表达水平足以触发肿瘤形成。
基于我们先前在*U. maydis*感染的玉米叶片中表达Fluc的工作²，本研究尝试直接在受感染叶片中对FLuc表达进行光遗传学调控和定量。在接种后9天（dpi）收集感染了Blue-OFF-See1菌株的叶片，并测定其发光强度（图5i）。随后，将叶圆片置于蓝光/黑暗交替循环下照射，总时长为148小时，并每30分钟测量一次发光强度（图5j）。在黑暗期间（63至89小时），FLuc表达升高。随后，蓝光照射期间（89至113小时）FLuc表达降低。在之后的光暗周期中，这一变化模式再次出现，但强度略低。最后，对接种后9天的叶片进行qPCR分析，证实了FLuc和See1的表达均受光调控。
光遗传学诱导Ustilago效应子TIN2以促进花青素生物合成
除了调控和监测Ustilago效应子的活性外，我们还着手研究宿主植物的响应。为此，我们选择TIN2作为光遗传学调控的目标，因为
其表达可使玉米组织中的花青素显色易于观察。TIN2 是玉米黑粉菌（*U. maydis*）分泌的效应蛋白，可稳定一种玉米激酶；该激酶在促进花青素生物合成的同时，会在感染过程中抑制木质素生物合成⁴³˒⁴⁴。特别值得关注的是，删除 TIN2 会导致玉米黑粉菌诱导的肿瘤体积缩小；更明显的是，受感染玉米组织中的花青素完全不再生成，而花青素生成是野生型感染的典型特征⁴⁵（图 6a）。
我们首先构建了 TIN2 敲除菌株 s798；该菌株在感染后可稳定诱导叶片不产生花青素的表型⁴⁶。为探索对 TIN2 介导的肿瘤表型进行光遗传学调控的可行性，我们随后构建了 Blue-ON 构件，并将其导入 s798 背景菌株。所得菌株 s2575 表明，仅引入光开关（未插入 TIN2 报告构件）不会影响玉米黑粉菌的生物营养生长，也不会干扰植物的花青素生物合成。
接下来，我们构建了菌株 s2583，其中 Blue-ON 开关整合至 *cco1* 位点，光遗传调控型 TIN2（opto-TIN2）整合至 *upp3* 位点（图 6b）。在蓝光照射的玉米黑粉菌无菌培养物中，证实了 TIN2 的表达受光调控（图 6c）；同时，对为期两周的感染进程进行了监测（图 6d）。花青素的提取与定量结果显示，感染了经蓝光处理的 Blue-ON-TIN2 玉米黑粉菌培养物的叶片组呈现明显的红色（图 6e）。在花青素生物合成途径中（图 6f），晚期生物合成基因的表达决定了花青素含量的变化。当果实成熟进入后期时，晚期生物合成基因的转录水平会降低，而此时
出现变色
47
。具体而言，在接种经蓝光照射的
U. maydis
培养物的植株中，F3H 和 DFR 的倍数增幅最高
48
（
图 6g、h
）。
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图 6.
光遗传学调控
U. maydis
中的 TIN2 表达，以调控植物中的花青素生物合成。
(a) 示意图显示，在光遗传学表达调控下，感染后玉米幼苗中表达的
U. maydis
TIN2 的作用方式。删除 TIN2 会导致受感染玉米组织完全丧失花青素生成能力（上方细胞）。感染过程中，TIN2 可稳定一种促进花青素生物合成、同时降低木质素生物合成的玉米激酶（下方细胞）。图中展示了接种经光照或暗处理的 Blue-ON-TIN2
U. maydis
培养物后，12 dpi 叶片的代表性图像。在
U. maydis
培养物中，蓝光照射诱导 Tin2 表达；接种后，该培养物诱导植物组织中的花青素生物合成，从而使叶片呈现红色。
(b) 所用构建体的分子结构；(c)
U. maydis
中携带 Blue-ON 控制的 TIN2 表达系统的宿主菌株说明。
(d) 接种 Blue-ON-TIN2 菌株（s2583）的叶片在 12 dpi 时的肿瘤评分。
(e) 12 dpi 叶片的花青素提取物及其吸收光谱。
(f) 玉米类黄酮生物合成途径示意模型。参与各个生物合成步骤的酶以红色标示。CHS，查尔酮合酶；CHI，查尔酮异构酶；F3H，黄烷酮 3-羟化酶；DFR，二氢黄酮醇 4-还原酶；ANS，花青素合酶。对花青素生物合成及选定基因（F3H 和 DFR）的表达量进行定量比较，比较对象为注射经暗处理或蓝光处理的
U. maydis
培养物的叶片，检测时间分别为 9 dpi（g）和 12 dpi（h）。数值表示平均值。
每组包含3个生物学重复，每个生物学重复包含2个技术重复。误差线表示均值标准误（SEM）。图 c、g 和 h 中数据的统计学显著性通过 t 检验确定。ns，差异不显著；*，1 × 10⁻² < p ≤ 0.05；，1 × 10⁻³ < p ≤ 1 × 10⁻²；*，1 × 10⁻⁴ < p ≤ 1 × 10⁻³；****，p ≤ 1 × 10⁻⁴。本文提供了源数据。
讨论
玉米黑粉菌（*Ustilago maydis*）对玉米具有很强的侵染能力，且其基因组已完成测序，因此已成为研究病原体—宿主相互作用的表征充分的模式真菌。相关的深入分析旨在阐明信号通路、侵入机制及关键侵染效应因子。然而，目前可用于操控信号传导和代谢网络的实验方法为数不多，且存在诸多局限，例如需要侵入性化学处理、因扩散而缺乏时空控制能力，以及可能产生毒性。
本研究建立了一套光遗传学工具，可对 *U. maydis* 基因表达及效应因子活性进行精确、可逆且具时空控制的诱导，从而克服真菌植物病理学中组成型或化学诱导系统的主要局限。研究结果首先表明，我们成功设计了一种适用于 *U. maydis* 的光诱导基因表达开关；该开关在蓝光照射下的液体培养中具有功能，即基于 TULIP 的 Blue-ON 系统¹⁻²²（图 2、3）。此外，我们还开发了基于 EL222 的 Blue-OFF 配置，可实现快速失活并降低背景活性。
除转录调控外，我们还实现了对细胞形态发生的光遗传学调控，具体而言，是对 *U. maydis* 至关重要的由孢子向菌丝的双相态转变进行调控。在 Mahlert 等人²³的奠基性发现基础上，我们
我们构建了一个菌株，其中 Rac1 的组成型活性突变受 Blue-OFF 系统调控。我们对真菌细胞极性的许多基础认识源自经典的出芽酵母模型——酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）。值得注意的是，该物种完全缺乏真正的 Rac1 同源蛋白，并严格依赖 Cdc42 作为调控对称性破缺和极性顶端生长的主调节因子⁵⁰˒⁵¹。相比之下，形态更复杂的二态型真菌会同时利用这两种 GTP 酶。例如，在亲缘关系密切的人类真菌病原体白色念珠菌（*Candida albicans*）中，Rac1 和 Cdc42 在菌丝发育及形态转换过程中发挥不同且不可相互替代的作用⁵²。类似地，玉米黑粉菌（*U. maydis*）需要这两种信号模块共同调控丝状生长²³。此外，这些真菌建立极性的时空动态与哺乳动物系统存在显著差异：真菌中的 Rho 和 Rac 并非通过机械张力在较长距离上相互组织形成“前端”和“后端”，而是在细胞顶端局部协同，驱动单向生长⁵³。通过使用 Rac1^Q61L 突变体，我们破坏了这种精细调控的局部协调，并诱发各向同性的细胞壁扩张及大型极性液泡形成，由此建立了一种易于区分的形态学读出。至关重要的是，我们的数据凸显了 Blue-OFF 系统能够快速、精确地逆转表型。将经黑暗处理且形态异常的培养物重新置于蓝光下照射后，我们观察到群体组成明显转向芽孢细胞占优势。我们推测，尽管 Rac1^Q61L 突变严重损害细胞膜完整性并最终导致细胞死亡（碘化丙啶染色结果支持这一判断），但该表型在群体水平上仍可逆。这种现象可能是由于
通过存活的细长型突变细胞出芽，产生新的非突变子细胞。要充分证实这一机制，还需开展进一步研究，例如利用微流控技术追踪单个异常细胞的命运，或对推定的新生子细胞进行细胞核染色。
因此，本研究建立的光控丝状生长系统不仅再现了与自然感染相关的分化过程，也为未来机制研究中将丝状生长与效应蛋白分泌分离开来提供了条件。最重要的是，在两项经筛选的光遗传工具概念验证应用中，我们旨在实现对效应蛋白的调控。光照抑制 See1 表达降低了玉米叶片中的肿瘤形成（图 5），而激活 TIN2 则驱动了异位花青素生物合成；花青素是一种可视化、非破坏性的效应蛋白活性报告指标（图 6）。尤其是在利用 TIN2 开展的植物病原体实验中，花青素读出极具价值，因为它能够实时监测组织中的效应蛋白功能，而无需进行破坏性取样。光遗传学的一项关键优势，是能够对基因表达进行空间控制。通过精确设定光照时序，我们的工具为实时监测效应蛋白表达水平，以及剖析其对植物防御调控的直接和间接影响，提供了一种前景广阔的方法。在图 5 中，在 Blue-OFF 调控下表达的 FLuc-See1 融合蛋白存在于受感染的玉米叶片中，表明在生物营养型互作过程中，这一光遗传开关在活体植物组织内始终保持动态、可逆且可定量。综上，这些发现确立了一个适用于 *U. maydis* 的多功能光遗传平台，可实现对效应蛋白的可调、可逆及空间分辨式……
研究。与化学诱导剂（如四环素）不同，光能够避免多效性影响、组织渗透梯度以及洗脱延迟，即具有可逆性。在特定时间和位置启动肿瘤形成的能力，为解析早期宿主重编程事件开辟了新的途径；这些事件通常会被持续且不同步的感染过程所掩盖。在本研究中，尽管基于蓝光的光遗传开关使我们能够对效应因子进行诱导性调控，但该系统存在明显局限：蓝光可能引发光毒性、导致植物生长缺陷，并触发非预期的宿主应激反应。此外，蓝光组织穿透能力较弱；由于暗态复原迅速，且玉米幼苗生长很快、会超出局部照明区域，因此难以实现局部照射。展望未来，我们计划为 *U. maydis* 构建双稳态切换开关，例如基于红光的光遗传开关（如 PULSE，即植物适用型光开关元件）
54
。红光具有更强的组织穿透能力、更低的光毒性，并且更适配植物正常的光暗周期和同步成像。
本研究中对 *U. maydis* 的成功光遗传操控，证明了光控技术在多种宿主—微生物系统中实现动态基因调控的实用价值。未来的研究将把这些光遗传模块整合至共培养系统或活细胞成像平台，以单细胞分辨率描绘效应因子递送动态及宿主响应。这样的精确度将使我们能够以接近分子层面的分辨率，解析效应因子的运输、其与局部宿主靶标的结合，以及肿瘤起始的时空动态。最终，该平台有望推动 *U. maydis* 从一种遗传操作便利的病原体转变为……
转化为一种可通过光调控的肿瘤起始模型，可能为阐明真核生物中致癌性生长控制的基本原理提供参考。
方法
质粒构建
本研究中构建的所有质粒均采用标准的限制性内切酶和聚合酶链式反应（PCR）组装克隆方法制备，并使用 GMOCU⁵⁶ 进行记录。TULIP 和 EL222 的 *U. maydis* 密码子优化基因片段由 GeneArt（Thermo Fisher Scientific）合成，制成质粒 DNA 后转化至 *U. maydis* 菌株 AB33 或 SG200，以获得稳定转基因菌株。质粒详情见补充表 S1。
稳定转基因菌株的构建
本研究构建的菌株列于表 S2 并作了说明。我们构建了用于定量报告基因检测⁵⁷和 Rac1^Q61L 实验的 AB33 菌株，以及用于 *U. maydis* 毒力检测⁵⁸的 SG200 菌株。
根据 Bösch 等人（2016）⁵⁹所述，使用线性化质粒，通过与 *cco1* 或 *upp3* 位点的同源重组进行 *U. maydis* 稳定转化。为将序列整合至 *cco1* 位点，使用限制性内切酶 SspI 消化质粒；为整合至 *upp3* 位点，则使用 SwaI 消化质粒。SwaI 消化后的样品在 65 °C 下孵育 20 min，以灭活该酶。对于经 SspI 消化的样品，使用 DNA 纯化试剂盒（NEB）纯化并回收质粒 DNA。
TIN2 相关菌株采用此前所述的 CRISPR-Cas9 介导敲入方法构建⁶⁰。简言之，使用 chopchop⁶¹设计靶向 *upp3* 和 *cco1* 位点的 sgRNA，随后通过 Gibson 组装⁰将其克隆至 pCas9HF1 载体中。将 *U. maydis* 原生质体与 CRISPR-Cas9 质粒及供体质粒（1.5 µg】【。
各突变株均通过 Southern 印迹分析进行验证。sgRNA 寡核苷酸序列如下：sgRNA_K_cco1：
CAAAATTCCATTCTACAACGCGTTGGTACGAAAGCGCGGGTTTTAGAGCTAGAAA TAGC；sgRNA_K_upp3：CAAAATTCCATTCTACAACGATACGGGTACAACGCTCATGTTTTAGAGCTAGAAA TAGC。所有菌株的正确性均通过基因分型 PCR 和/或 Southern 印迹分析确认
62
。
*U. maydis* 培养
将 *U. maydis* 菌株的甘油菌种划线接种于补充了 1% 葡萄糖的完全培养基（CM）琼脂平板上，并于 28°C 培养 2 至 3 天。随后以此为初始材料，在含 1% 葡萄糖的液体 CM 培养基中接种初级培养物。培养物在带挡板的玻璃摇瓶中，或在装有 3D 打印挡板插片的六孔板中，于 28°C、150 至 200 rpm 条件下进行分批培养。通过将 CM 培养基替换为氮源最小培养基（NM），诱导基于 AB33 的菌株形成菌丝。将 NM 培养基中的真菌孢子培养物调整至终浓度 OD
600
为 0.5 至 0.8，随后置于装有 3D 打印挡板插片的六孔板中，在培养箱（KB_E6，Binder GmbH，德国图特林根）内于 28°C、150 rpm 培养约 16 小时。
发光测定
使用 Berthold Technologies Centro XS3 LB960 微孔板发光仪测定发光信号，方法如前所述
2
。对于孢子细胞培养物中的 FLuc 测定，将 80 μL 培养物转移至白色 96 孔检测板中，并按上述方法加入 20 μL 萤火虫荧光素酶底物。使用 Berthold Technologies Centro XS3 LB960 微孔板发光仪测量发光信号。使用 CLARIOstar 微孔板读数仪（BMG LABTECH）测量 OD600，并将所得数值归一化至 OD600 为 0.5。
对于基于 Light-Plate-Apparatus（LPA
37
,
33
）的强度测试，初级培养物……
接种后，将其置于旋转轮上的试管中，在28°C下孵育约24 h。将实验主培养物的OD600调节至0.1–0.2，然后取1 mL转移至整块黑色（透明底）24孔板的每个孔中。随后，将LPA置于培养箱（KB_E6，Binder GmbH，德国图特林根）内设定为150 rpm的轨道摇床上，并在28°C下培养，于指定时间点收集培养物。
生物发光报告基因检测与生物量归一化
为定量分析二态转换期间及菌丝中的基因表达，在U. maydis菌株Blue-ON和Blue-OFF（AB33遗传背景）菌丝培养物的胞外和胞内组分中测定萤火虫荧光素酶（FLuc）活性。将4 mL硝酸盐最小（NM）培养基中的培养物培养16 h，以诱导丝状生长。培养在6孔细胞培养板中进行，孔内放置定制的3D打印挡板式插入件；培养板置于轨道摇床（150 rpm）上，并在配备LED光源的定制培养箱中于28°C下培养。含有暗处理样品的培养板用铝箔严密包裹，而含有光处理样品的培养板则接受单色蓝光（455 nm，20 µmol/m²s）照射。
组分分离与全细胞裂解
将培养物（4 mL）在4°C、10,000 rpm条件下离心5 min。为收集胞外报告信号组分（E），取1 mL无细胞上清液转移至置于冰上的无菌1.5 mL微量离心管中，随后弃去剩余上清液。
用1 mL冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤完整沉淀，并在4°C、10,000 rpm条件下离心10 min。随后，完全去除上清液，并将沉淀
将其重悬于 800 μL 经滤膜除菌的定制 1× Passive Lysis Buffer 中（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1% v/v Triton X-100），并加入 1× cOmplete™ Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物（#11836170001，Roche）。此外，每管加入约 130 mg 玻璃珠以裂解细胞。为保持酶的稳定性和结构完整性，样品立即在液氮中速冻。随后，使用台式涡旋混合器以最高转速进行冷冻机械破碎，持续 5 min，分为若干个连续的 1 min 间隔（涡旋振荡 1 min，随后置于冰上 1 min）。将所得匀浆于 4°C、10,000 rpm 离心 15 min，以去除细胞碎片和玻璃珠。随后，将上清液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中，得到澄清的细胞内裂解液组分（L），并置于冰上保存。
荧光素酶活性测定
使用 Centro XS³ LB 960 微孔板发光仪（Berthold Technologies），在 96 孔白色平底检测板中定量生物发光信号。对于两个组分（E 和 L），分别取 80 μL 样品加入各孔，其中 E 组分设置 4 个技术重复，L 组分设置 5 个技术重复。每孔加入 20 µl D-荧光素萤火虫底物（# L-8200，Biosynth），并立即开始测定（测量间隔为 0.1 秒，共重复 29 次）。
蛋白质定量与比活性计算
为将生物发光信号按细胞总生物量进行归一化，使用 Pierce™ BCA 蛋白质检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测定细胞内裂解液（L）的蛋白质浓度。将四重复样品（25 μL）与 200 µL 二辛可宁酸工作试剂混合，在 37°C 干燥空气培养箱中孵育 40 min，以补偿……
先进行初始热滞后处理，随后在室温下冷却 5 min。使用 CLARIOstar 酶标仪（BMG LABTECH）在 562 nm 处测量经空白校正的吸光度。以相同 1× Passive Lysis Buffer 配制的牛血清白蛋白（BSA）标准品重复样品生成线性校准曲线，并据此计算蛋白质绝对浓度（μg μL⁻¹）。
通过将原始 RLU 值按绝对组分体积进行缩放，并将累积活性归一化至细胞蛋白质绝对质量，计算培养物的总基因表达量，具体如下：
总活性（RLU）=（平均 RLU × 50）+（平均 RLU × 10）
细胞总蛋白质（μg）=裂解液浓度（μg μL⁻¹）× 800 μL
最终报告的比活性为总 RLU 与总蛋白质质量（μg）的比值。
显微镜成像
使用集成 MetaMorph 软件包（7.7.0.0 版，Molecular Devices，美国伊利诺伊州西雅图）的 Zeiss Axio Imager M1 显微镜（德国奥伯科亨）采集图像，曝光时间为 150 ms。使用 Wayne Rasband 及其合作者（美国国立卫生研究院）开发的 FIJI（ImageJ）1.54p 软件进行感兴趣区域选取、比例尺添加，以及 PI 荧光图像的 Fire 查找表（LUT）应用。
玉米侵染试验
所有侵染实验均使用玉米（Zea mays L.）品种 Early Golden Bantam。致病力测试所用的 U. maydis 菌株包括 SG200 野生型、SG200-TIN2 敲除株及光遗传学菌株。所有菌株均在 YEPS 培养基中于 28 °C、160 rpm 振荡培养。除非另有说明，光照处理组的培养瓶以 10 μmol/m²·s 的强度接受蓝光照射；暗处理组则用铝箔包裹。当 600 nm 处的光密度（OD600）达到 0.8 时，细胞】【。
通过 5,000 × g 离心 10 min 收集细胞，用无菌蒸馏水洗涤并重悬，使最终 OD600 为 1.0。使用带针头的 1 mL 注射器，将细胞悬液注入玉米幼苗茎部进行接种，接种位置约在土壤上方 1 cm 处，幼苗为 7 日龄。植株在受控生长条件下培养，光周期为 16 h 光照/8 h 黑暗，温度为 28 °C。于接种后 6–12 d（dpi）评估病害症状。
感染叶片的荧光素酶动力学测定
剪取叶片圆片，浸入 96 孔白色平底板（Costar）中，以测定荧光素酶活性。每孔含 0.2 mL PBS、0.01% Triton X-100 和 5 mM D-荧光素。每项实验设置 3 个生物学重复，每个生物学重复设 4 个技术重复。用光学透明封膜（Sarstedt）封板，并使用 Berthold Centro XS3 LB960 微孔板读数仪每 30 min 记录一次发光信号（积分时间为 0.1 s）。照明由安装在酶标仪顶部的定制 LED 提供。
RNA 提取、cDNA 合成及 RT-qPCR
采集注射点下方 1 cm 处的 2–3 cm 叶片组织，在液氮中快速冷冻，并使用 TissueLyser II（Qiagen）研磨。采用 RNeasy 试剂盒（Qiagen）提取 RNA，使用 RLC 缓冲液和 β-巯基乙醇。为提高 RNA 浓度，将洗脱体积减至 30 μL，并使用流出液再次洗脱一次。随后用 DNase（Invitrogen）处理收集到的 RNA 样品，以消化 DNA 污染。
每个样品取 2 μg RNA，使用 Superscript II（Invitrogen）合成 cDNA。使用 96 孔 qPCR 仪（qTOWER³G，Analytik Jena，德国）进行 qPCR，每个样品设置 3 个技术重复。每孔含 1 μL 10×】【。
稀释后的 cDNA，以及 9 μL PCR 反应混合液，该混合液由 5 μL SYBR Green I Master Mix（Promega）、1 μL 正向引物（储液浓度 10 μM）、1 μL 反向引物（储液浓度 10 μM）和 0.5 μL 无核酸酶水组成。本研究使用的 RT-qPCR 引物列于表 S3。扩增程序如下：95°C 预孵育 5 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 95°C 变性 20 秒、60°C 退火 20 秒、72°C 延伸 20 秒，之后进行熔解曲线分析。我们使用目标基因和参考基因 Oppi 与 zmGAPDH 的 Ct 值几何均值计算比值。
统计分析与重复性
统计分析使用 ExPlot（https://github.com/beyerh/ExPlot）完成。定量数据以均值 ± SEM 表示，每种条件包含 n = 3–4 个生物学重复；必要时，图注中会进一步说明。除非另有说明，生物学重复指在不同孔中进行的独立处理（体外实验），或取自不同植株的叶片。所有显微图像、凝胶和印迹图均为至少 2 次独立重复实验的代表性图像。根据图注所示，采用 t 检验或 ANOVA，并进行 Tukey 事后检验（多重比较校正）计算统计学显著性。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。
经费支持
本研究得到德国研究联合会（DFG）资助，包括资助 M.D.M、M.F. 和 M.D.Z. 的 SFB1535 项目（项目编号 458090666），以及德国卓越战略计划下资助 G.D. 和 M.D.Z. 的 CEPLAS-EXC-2048 项目（项目编号 390686111）。
作者贡献
概念构思：MDZ、MF、GD
方法学：KT、MDM、LH、MDZ
数据获取：KT、MDM、LH、WZ、AR、NH、JP、LW
监督指导：MDZ、MF、GD
写作：KT、MDZ
经费获取：MF、MDZ
致谢
我们谨致谢意。
致 Ute Meyer（德国科隆），感谢其协助开展黑粉菌（Ustilago）毒力注射实验；致 H.M. Beyer（德国杜塞尔多夫），感谢其设计 LPA 照明装置；并感谢杜塞尔多夫微生物学研究所的助教 S. Kuschel 和 R. Schönle 提供宝贵的实验协助。
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发布于 2026 年 6 月 26 日。
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Kun Tang、Micail David Müller、Lisa Hüsemann、Weiliang Zuo、Anna Rybecky、Nicole Heucken、Johannes Postma、Lasse van Wijlick、Gunther Doehlemann、Michael Feldbrügge、Matias D. Zurbriggen
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2026.06.25.734638
doi: https://doi.org/10.64898/2026.06.25.734638
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LUstiGE：光响应型玉米黑粉菌基因表达——对玉米病原真菌玉米黑粉菌形态发生与致病性的光遗传学调控
Kun Tang、Micail David Müller、Lisa Hüsemann、Weiliang Zuo、Anna Rybecky、Nicole Heucken、Johannes Postma、Lasse van Wijlick、Gunther Doehlemann、Michael Feldbrügge、Matias D. Zurbriggen
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关键词：光遗传学 · 蓝光诱导基因表达 · 玉米黑粉菌 · 真菌形态发生 · 植物病原致病性
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