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目的：顺铂（CDDP）是治疗卵巢癌活性最强的化疗药物；原发性或获得性耐药均预示预后不良。HIV 蛋白酶抑制剂奈非那韦（NFV）已在多种癌症模型中显示抗肿瘤活性，但其与 CDDP 在卵巢癌中的相互作用尚未得到证实。本研究旨在探讨 CDDP 与 NFV 联用能否为铂类（Pt）耐药卵巢癌细胞带来治疗获益。方法：采用细胞活力测定和 Loewe 加和模型评估 NFV 与 CDDP 的药物协同作用。通过免疫印迹、线粒体膜电位分析、乳酸脱氢酶（LDH）释放检测及半胱天冬酶抑制实验，评估细胞凋亡和细胞焦亡信号。采用整体 mRNA 测序，继而进行差异基因表达分析和基因集富集分析，以评估转录组变化。结果：NFV 与 CDDP 协同降低 Pt 耐药卵巢癌细胞的活力，并促进一种受调控的裂解性细胞死亡表型，该表型兼具细胞凋亡和细胞焦亡特征。联合治疗诱导半胱天冬酶-8 和半胱天冬酶-3 活化，并促使下游 gasdermin E（GSDME）加工。抑制半胱天冬酶-3 可显著减轻细胞死亡；抑制半胱天冬酶-8 则可挽救细胞活力，并阻止 Bid 裂解、半胱天冬酶-3 活化及 GSDME 裂解。这些效应伴随着内质网应激增强、DNA 损伤增加且 DNA 修复减少，以及 Akt 驱动的细胞存活信号受损。结论：我们的研究表明，NFV 可通过促进依赖半胱天冬酶-8 的细胞凋亡向继发性细胞焦亡转变，与 CDDP 协同杀伤 Pt 耐药卵巢癌细胞；这支持进一步研究 NFV 作为一种潜在药物，以……可重新用于提高基于铂类疗法的疗效。
奈非那韦与顺铂联合应用通过caspase-8/caspase-3/GSDME轴驱动铂耐药卵巢癌细胞发生裂解性细胞死亡 | bioRxiv
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奈非那韦与顺铂联合应用通过caspase-8/caspase-3/GSDME轴驱动铂耐药卵巢癌细胞发生裂解性细胞死亡
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Carlos M.
Telleria
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.06.30.735544
Benjamin Forgie
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Rewati Prakash
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Abu Shadat M. Noman
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Alicia A. Goyeneche
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Lucy Gilbert
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Julia V. Burnier
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Carlos M. Telleria
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摘要
目的
顺铂（CDDP）是治疗卵巢癌最有效的化疗药物；原发性或获得性耐药预示着不良预后。奈非那韦（NFV）是一种 HIV 蛋白酶抑制剂，已在多种癌症模型中显示出抗肿瘤活性，但其在卵巢癌中与 CDDP 的相互作用尚未得到证实。本研究探讨了 CDDP 与 NFV 联合应用是否能为铂（Pt）耐药性卵巢癌细胞提供治疗优势。
方法
采用细胞活力测定和 Loewe 相加性模型评估 NFV 与 CDDP 之间的药物协同作用。通过免疫印迹、线粒体膜电位分析、乳酸脱氢酶（LDH）释放检测以及半胱天冬酶抑制实验，评估细胞凋亡和细胞焦亡信号传导。采用群体 mRNA 测序，结合后续差异基因表达分析和基因集富集分析，评估转录组变化。
结果
NFV 与 CDDP 协同降低了铂耐药性卵巢癌细胞的存活率，促进了兼具细胞凋亡和细胞焦亡特征的调控性裂解性细胞死亡表型。联合治疗诱导了半胱天冬酶-8 和半胱天冬酶-3 的激活，以及下游消皮素 E（GSDME）的加工。抑制半胱天冬酶-3 可显著减少细胞死亡，而抑制半胱天冬酶-8 则可恢复细胞存活率，并阻止 Bid 裂解、半胱天冬酶-3 激活和 GSDME 裂解。这些效应发生于以下背景中：
内质网应激增强、DNA损伤增加且DNA修复减少，以及Akt驱动的存活信号传导受损。
结论
我们的研究结果表明，NFV通过促进依赖于caspase-8的细胞凋亡向继发性细胞焦亡转变，与CDDP协同杀伤铂耐药卵巢癌细胞，支持进一步研究将NFV作为潜在的药物再利用候选药物，以提高铂类治疗的疗效。
- 引言
卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，由于确诊时常已处于晚期且疾病复发率高，仍是临床面临的重大挑战[1,2]。标准治疗包括肿瘤细胞减灭术联合铂（Pt）类化疗[3]。尽管卵巢癌患者最初对铂类化疗有反应，但大多数患者最终仍会出现铂耐药性疾病复发，凸显了制定提高治疗疗效策略的必要性[4]。铂耐药源于一系列相互关联的适应性变化，这些变化共同降低治疗敏感性并限制细胞死亡；其机制包括铂内流和外排转运蛋白失调[5]、DNA损伤修复能力增强[6]、应激适应程序激活[7,8]，以及PI3K-Akt等促存活信号通路的激活，同时伴随促死亡信号传导减弱[4,9,10]。因此，铂耐药细胞可能耐受铂诱导的显著损伤，却无法将这种应激有效转化为细胞死亡[11]。因此，寻找能够增强铂类药物细胞毒性作用并克服卵巢癌细胞这些适应性存活反应的药物，受到广泛关注。
奈非那韦（NFV），一种人类
免疫缺陷病毒（HIV）蛋白酶抑制剂[12]，因其在多种癌症类型中表现出抗肿瘤活性[14]，已成为肿瘤学领域药物再利用的候选药物[13]。我们此前已证实，NFV通过激活与未折叠蛋白反应（UPR）、DNA损伤及促凋亡信号传导相关的通路，对高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）细胞产生细胞毒性作用[15]。此外，研究表明，NFV可抑制Akt和Erk介导的促存活信号传导[15]。综上，这些发现提示，NFV可能通过增加细胞应激、抑制促存活信号传导以及降低治疗诱导的调节性细胞死亡阈值，增强铂类药物的细胞毒性。然而，NFV是否可与全球广泛使用的第一代铂类药物顺铂（CDDP）[16,17]相互作用，从而杀死铂耐药卵巢癌细胞，目前仍不清楚。
CDDP等铂类药物主要通过形成有害的DNA链内及链间交联发挥抗癌作用[9,18]，继而激活DNA损伤应答[19]，最终启动内源性凋亡通路并激活执行者半胱天冬酶-3和-7[9,18]。在某些情况下，凋亡信号还可通过激活半胱天冬酶-8等启动者半胱天冬酶而得到增强[20]。半胱天冬酶-8可通过切割Bid，将上游死亡信号与线粒体凋亡信号放大机制相连接；Bid是BCL2基因家族中仅含BH3结构域的促凋亡蛋白成员[21]。此外，半胱天冬酶-8还可通过直接切割执行者半胱天冬酶增强凋亡信号[20,22]。尽管半胱天冬酶-3通常与凋亡执行过程相关，但其也可作为连接细胞凋亡与裂解性细胞……的分子分支点
一种被称为细胞焦亡的死亡程序[23,24]。细胞焦亡的特征是在质膜上形成大小为10–20 nm的gasdermin（GSDM）蛋白孔道，允许离子流动及细胞内小分子泄漏[25,26]。这些细胞内物质释放后，最终的质膜破裂由ninjurin-1（NINJ1）介导[27]；NINJ1在质膜中寡聚化，形成大小为10–100 nm的大型环状开口，使乳酸脱氢酶（LDH）等较大分子得以泄漏，而LDH是裂解性细胞死亡的标志物[28]。在表达足量gasdermin E（GSDME）的细胞中，caspase-3介导的GSDME切割释放出具有成孔活性的GSDME N端片段，导致初始的膜通透化，随后发生NINJ1介导的细胞裂解[23,24,29]。因此，caspase-3活化的结果可能不仅取决于凋亡信号的强度，还取决于GSDME表达等细胞内决定因素，以及caspase-3活化所处的上游信号环境[29]。这提示，能够增强诱导细胞死亡的caspase活性的联合治疗，也可能重塑调控性细胞死亡的方式，其中可能不仅涉及凋亡的分子介质，还涉及焦亡的分子介质。
在本研究中，我们报道，NFV与CDDP联用可协同触发铂耐药卵巢癌细胞死亡，并促进一种涉及caspase-3介导的GSDME活化的调控性裂解性细胞死亡表型。联合治疗伴随凋亡和焦亡的双重特征，提示NFV可能不仅改变CDDP诱导的细胞死亡程度，还可能改变其死亡方式。我们进一步鉴定出
在内质网（ER）应激增强、DNA损伤增加及修复能力降低，以及存活/生长信号传导受损的细胞背景下，caspase-8作为该反应的上游介导因子，在Bid裂解和caspase-3激活之前发挥作用。总体而言，这些发现从机制层面阐明了NFV与CDDP如何相互增效以杀伤铂耐药卵巢癌细胞，并凸显了将NFV重新用于卵巢癌铂类治疗辅助用药的转化应用潜力。
- 材料与方法
2.1 细胞培养与试剂
本研究采用PEO4、IGROV-1/CP和TOV21G细胞系作为铂耐药卵巢癌模型。PEO4细胞分离自一名患者在第二轮铂类化疗结束10个月后的腹水，被认为具有临床铂耐药性[30]。IGROV-1/CP细胞来源于IGROV-1亲本细胞系，通过长期暴露于浓度递增的CDDP而获得铂耐药性[31]。TOV21G细胞分离自一名尚未接受铂类药物治疗的患者[32]，并已被证实具有内在性铂耐药性[33]。PEO4和TOV21G细胞系分别由Taniguchi博士（美国华盛顿州华盛顿大学弗雷德·哈钦森癌症中心）和Mes-Masson博士（加拿大魁北克省蒙特利尔市蒙特利尔大学医院中心〔CHUM〕研究中心）惠赠。IGROV-1/CP细胞由Stephen Howell博士（美国加利福尼亚州圣迭戈市加利福尼亚大学圣迭戈分校）提供。PEO4细胞携带纯合性TP53失活突变[34]，IGROV-1/CP细胞则携带遗传自亲本细胞系的杂合性TP53失活突变[34,35]，而TOV21G细胞的TP53为野生型[34]。所有细胞均在RPMI 1640培养基（Mediatech，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）中培养
补充添加10%胎牛血清（FBS）（Corning Inc，美国纽约州康宁）、0.01 mg/mL人胰岛素（Roche，美国印第安纳州印第安纳波利斯）、10 mM HEPES（Corning）、100 IU青霉素（Mediatech）、100 µg/mL链霉素（Mediatech）、2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（Glutagro™，Corning）及1 mM丙酮酸钠（Corning）。细胞置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养。本研究使用以下药物：甲磺酸奈非那韦水合物（NFV）（Sigma Chemical Co.，美国密苏里州圣路易斯）、顺式二氨二氯合铂（II）（CDDP）（Sigma）、Z-IETD-FMK（Cedarlane Laboratories，加拿大安大略省伯灵顿）、Z-DEVD-FMK（Cedarlane）、坏死性凋亡抑制剂-1（necrostatin-1，NEC-1）（Cedarlane）及铁死亡抑制剂-1（ferrostatin-1，FER-1）（Cedarlane）。CDDP溶解于0.9%氯化钠溶液（生理盐水）（Sigma）中。NFV、Z-IETD-FMK、Z-DEVD-FMK、NEC-1及FER-1均溶解于二甲基亚砜（DMSO）（Sigma）中，细胞培养中DMSO的最高使用浓度为0.1%（v/v）。
2.2 细胞增殖与活力评估
使用Guava Muse细胞分析仪（Cytek Biosciences，美国加利福尼亚州弗里蒙特），通过微毛细管细胞术评估细胞增殖与活力。将细胞接种于6孔板中，以递增浓度的CDDP处理3小时（h）。随后，移除含CDDP的培养基，并在含固定浓度20 µM NFV的培养基或不含药物的培养基中继续培养72 h。之后，用胰蛋白酶消化并收集细胞，按照制造商的操作规程，使用Muse细胞计数与活力检测试剂（Cytek）进行染色。简而言之，同时使用可透过细胞膜的染料对细胞进行染色以获得细胞总数，并使用不可透过细胞膜的染料确定细胞膜完整性降低的细胞数量
（非存活细胞）。根据这些计数，确定质膜完整的存活细胞数量。
2.3 细胞活力测定与药物相互作用评估
使用 SynergyFinder 中的 Loewe 相加模型评估 CDDP 与 NFV 之间的药物相互作用[36,37]。在该模型中，评分低于 −10 表示两种药物之间存在拮抗作用，评分介于 −10 至 10 之间表示相加作用，评分高于 10 则表示协同作用[37]。将细胞接种于 96 孔板，并采用 CDDP 与 NFV 的浓度组合矩阵进行处理。先给予 CDDP 处理 3 h，随后将其去除，再用 NFV 处理细胞 72 h。将浓度为 2.5、5 和 10 µM 的 CDDP 与浓度为 2.5、5、10 和 20 µM 的 NFV 联合使用，并评估所有浓度组合。按照制造商说明，使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Dojindo，日本熊本）测定细胞活力[38]，并记录 450 nm 处的吸光度值。以溶剂处理对照组为基准对细胞活力值进行归一化，将该对照组的细胞活力设为 100%。随后，将归一化后的细胞活力数据输入 SynergyFinder 软件，以分析药物相互作用。
2.4 Annexin V 和 7-AAD 染色
按照制造商操作规程，使用 Muse Annexin V & Dead Cell Kit（Cytek），通过 Muse Cell Analyzer 评估质膜外层磷脂酰丝氨酸的暴露情况。简而言之，处理结束后，收集悬浮细胞和贴壁细胞，离心后重悬于新鲜培养基中，并使用 Annexin V & Dead Cell Reagent 在室温（RT）下染色 20 分钟（min）。对细胞群进行定量分析，将其分为存活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和
死亡细胞。
2.5 线粒体膜去极化
按照制造商的说明，使用 Muse MitoPotential 试剂盒（Cytek）和 Muse 细胞分析仪评估药物处理后线粒体内膜（IMM）的去极化情况。处理后，收集悬浮细胞和贴壁细胞，将样本离心后重悬于 1× 检测缓冲液中，加入 Muse MitoPotential 工作液，于 37 °C 染色 20 min，随后加入 7-AAD 染料，于室温孵育 5 min。根据 IMM 极化状态和细胞存活情况对细胞进行分类，并定量测定 IMM 去极化的死亡或濒死细胞百分比。
2.6 LDH 释放检测
按照制造商的说明，使用细胞毒性检测试剂盒（LDH）（Roche，德国曼海姆）测定培养上清液中的 LDH 释放量，以评估与细胞死亡相关的质膜裂解损伤。简言之，将细胞接种于 96 孔板中，处理后收集上清液，与 LDH 反应混合液于室温避光孵育 30 min。在 490 nm 波长处测定吸光度。
2.7 免疫印迹
处理孵育结束后，在冰冷的 1× PBS 中刮取卵巢癌细胞，并通过离心收集细胞沉淀。细胞沉淀保存于 −80 °C，直至提取蛋白质。使用添加蛋白酶抑制剂的 NP-40 裂解缓冲液裂解细胞。在冰上裂解 30 min 后，将裂解液于 4 °C、12,000 × g 离心 15 min，去除不溶性物质，并使用 Pierce BCA 蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）测定蛋白质浓度。每泳道上样 25 µg 总蛋白，在 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上以 200 V 电泳分离 35 min
使用TGX Stain-Free FastCast丙烯酰胺试剂盒（Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）制备。使用Trans-Blot Turbo转膜系统（Bio-Rad）将蛋白质转移至PVDF膜，转膜时间为7 min。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS-T中，于室温封闭1 h，随后与用含5%脱脂奶粉或5%牛血清白蛋白（BSA，Sigma）的TBS-T按1:1000稀释的一抗于4 °C孵育过夜。免疫印迹分析使用以下一抗：caspase-3（#9622，Cell Signalling Technology，美国马萨诸塞州丹弗斯）、PARP（#9542，Cell Signalling）、gasdermin E（#84005，Cell Signalling）、caspase-8（#9746，Cell Signalling）、Bid（#2002，Cell Signalling）、Bcl-2（#3498，Cell Signalling）、Bax（#5023，Cell Signalling）、CHOP（#2895，Cell Signalling）、PUMA（#12450，Cell Signalling）、磷酸化AKT（Ser473）（#9271，Cell Signalling）、磷酸化GSK-3β（#5558，Cell Signalling）、磷酸化组蛋白H2AX（Ser139）（γH2AX）（#9718，Cell Signalling）、53BP1（#612523，BD Transduction Laboratories，美国新泽西州富兰克林湖）和β-actin（A5441，Sigma）。用TBS-T洗涤后，将膜与相应的辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗，即HRP偶联山羊抗兔IgG（H+L）（1706515，Bio-Rad）或HRP偶联山羊抗小鼠IgG（H+L）（1706516，Bio-Rad），于室温孵育1 h。使用Clarity Western ECL底物（Bio-Rad）显现蛋白条带，并使用ChemiDoc Touch成像系统（Bio-Rad）采集图像。
2.8 RNA测序与分析
IGROV-1/CP细胞接受溶剂对照处理，或以下处理之一：10 µM CDDP处理3 h后，在无药培养基中培养24 h；20 µM NFV处理24 h；或10 µM CDDP处理3 h后，在含20 µM NFV的培养基中培养24 h。随后将细胞沉淀送至Genome Québec（加拿大魁北克省蒙特利尔）进行RNA
提取、文库制备和测序。按照制造商说明，使用 RNeasy Plus Universal Mini Kit（QIAGEN，德国希尔登，货号：73404）提取总 RNA。简而言之，向细胞样本中加入裂解缓冲试剂 QIAzol，并使用连接于无菌 3 mL 注射器的 20 号针头，将裂解液反复抽推 15 次以进行匀浆。使用提取试剂盒提供的 35 µL 缓冲液洗脱 RNA。使用 5K/RNA/Charge Variant Assay LabChip 和 RNA Assay Reagent Kit（PerkinElmer，美国康涅狄格州谢尔顿）对总 RNA 进行定量并评估其完整性。按照制造商建议，使用 Illumina Stranded mRNA Prep Kit（Illumina，美国加利福尼亚州圣迭戈），以 250 ng 总 RNA 为起始材料构建文库，其中包括 mRNA 富集步骤。使用 KAPA Library Quantification Kit（Kapa Biosystems，Roche）对文库进行定量，并使用 Fragment Analyzer 5300（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）测定平均片段长度。将文库归一化、混合，使用 0.02 N NaOH 变性后，以预上样缓冲液中和，再以 170 pM 的浓度上样至 Illumina NovaSeq X Plus 25B 的一个测序泳道，进行 2 × 100 bp 双端测序。按 1% 的比例掺入 PhiX 对照文库。使用 BCL Convert v4.2.4 进行碱基识别和样本拆分，生成 FASTQ 文件。使用 DRAGEN 流程生成的基因水平计数表进行下游分析。在 R 中使用 DESeq2（v1.46.0）进行差异表达分析 [39]。采用主成分分析和样本间相关性分析评估重复样本的聚类情况及一致性。将校正后 p 值 < 0.05 且 |log2 倍数变化| ≥ 1 的基因视为显著差异表达基因
表达。使用R中的fgsea（v1.32.4）[40]进行基因集富集分析，并根据DESeq2差异表达分析所得的Wald统计量对基因进行排序。使用msigdbr（v25.1.1）从分子特征数据库（MSigDB v2025.1.Hs）[41]获取Hallmark和基因本体生物学过程基因集。使用KEGGREST（v1.46.0）获取KEGG[42]通路基因集，并采用相同的基于fgsea的预排序富集分析流程进行分析。
2.9 统计分析
除非另有说明，数据均以三次独立实验的均值 ± 标准差表示。使用GraphPad Prism（Dotmatics，美国马萨诸塞州波士顿）进行统计分析。采用单因素方差分析及随后的Tukey事后多重比较检验确定组间差异的统计学显著性。在适用情况下，采用双因素方差分析及随后的Sidak多重比较检验。p值或经错误发现率（FDR）校正的p值（adj p）< 0.05被认为具有统计学意义。
- 结果
3.1 NFV与CDDP协同增强铂耐药卵巢癌细胞中的细胞毒性
为确定NFV是否增强CDDP对卵巢癌细胞的细胞毒作用，将PEO4、IGROV-1/CP和TOV21G细胞暴露于递增浓度的CDDP（0、10、25、50或100 µM）中3 h，随后在无药培养基或含NFV（20 µM）的培养基中培养72 h。在所有三种细胞系中，加入NFV均增强了CDDP的细胞毒作用；在所测试的各CDDP浓度下，与单独使用CDDP相比，联合处理后的细胞活力均更低（图1A–C）。为量化NFV对CDDP毒性的影响，我们比较了不含或含20 µM NFV条件下的CDDP IC50值，其定义为使细胞活力降低50%所需的CDDP浓度。
加入NFV后，PEO4和IGROV-1/CP细胞中CDDP的半数抑制浓度（IC50）降至原来的约1/4，TOV21G细胞中则降至原来的约1/5.5（图1E）。采用Loewe相加模型[36]进行的协同作用分析进一步支持了这两种药物之间的协同相互作用。Loewe协同作用图显示，在所有三种细胞系的各剂量组合中均存在正向协同作用（图1D），平均Loewe协同评分约为25–30，表明在所测试的各模型中均存在较强的协同作用（图1F）。综上，这些结果表明，NFV可显著增强CDDP对铂耐药卵巢癌细胞的细胞毒性。
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图1.
奈非那韦与顺铂协同降低卵巢癌细胞活力。
（A–C）
剂量–反应曲线分别显示PEO4、IGROV-1/CP和TOV21G细胞在接受递增浓度的顺铂（CDDP）单药或联合20 μM奈非那韦（NFV）处理后的细胞活力。CDDP浓度为0 μM时包含NFV单药处理组。
（D）
使用SynergyFinder分析软件生成的Loewe协同作用热图，显示PEO4、IGROV-1/CP和TOV21G细胞中所有受试CDDP/NFV剂量组合的协同评分。评分低于−10视为拮抗作用，−10至10视为相加作用，高于10视为协同作用。
（E）
各细胞系中CDDP单药及其与20 μM NFV联用时的平均IC50值。
（F）
通过对各细胞系中所有单个剂量组合的评分取平均值，计算得到平均Loewe协同评分。数据以三次独立实验的均值±标准差（SD）表示。
3.2 CDDP/NFV介导的细胞毒性与细胞凋亡分子介质的激活及细胞膜完整性受损有关，并导致细胞裂解
为
为探究CDDP与NFV联合用药诱导的细胞死亡方式，我们在处理后评估了Annexin V/7-AAD染色、细胞形态、LDH释放及关键细胞死亡效应蛋白的裂解情况。在PEO4和IGROV-1/CP两种细胞中，微毛细管流式细胞术分析显示，与溶剂对照和单药处理相比，联合处理提高了Annexin V阳性和7-AAD阳性细胞的比例，提示细胞死亡增加，并伴随细胞膜完整性丧失（图2A、B）。代表性明场图像显示，联合处理后细胞呈现混合性死亡表型；除出现符合凋亡特征的脱落、皱缩细胞外，PEO4细胞还出现体积增大、呈气球样形态的脱落细胞，而IGROV-1/CP细胞则表现出明显的空泡化和细胞肿胀，这些特征与细胞焦亡表型通常伴随的细胞膜气球样膨出和细胞肿胀相一致[43,44]（图2C）。为进一步明确该反应的分子特征，我们检测了caspase-3及其下游靶蛋白PARP[45]以及GSDME的裂解情况。在两种细胞系中，联合用药均增加了裂解型caspase-3、裂解型PARP和裂解型GSDME的水平，提示同时具有凋亡和焦亡分子标志的细胞死亡程序被激活（图2D、E）。与此同时，与任一单药处理相比，联合用药均显著增加了两种细胞系的LDH释放，进一步支持细胞质膜发生破裂（图2F、G）。在接受CDDP/NFV处理的细胞中同时加入甘氨酸后，联合用药引起的LDH释放减少，支持细胞质膜破裂参与了所观察到的死亡表型（图2F、G）。长期以来，甘氨酸因其……而受到认可
细胞保护作用[46]，且近期研究表明，其可通过抑制质膜蛋白NINJ1的寡聚化来防止细胞裂解[47]。综上，这些发现表明，CDDP与NFV联用可在铂耐药卵巢癌细胞中诱导裂解性死亡表型，并伴随细胞凋亡和细胞焦亡分子介导因子的激活。
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图2.
奈非那韦与顺铂联合治疗在卵巢癌细胞中诱导具有细胞凋亡和细胞焦亡特征的裂解性细胞死亡表型。
按图示，PEO4和IGROV-1/CP细胞分别接受溶剂对照处理72 h、顺铂（CDDP）处理3 h后以无药培养基培养72 h、奈非那韦（NFV）处理72 h，或CDDP处理3 h后再以NFV处理72 h。
(A,B)
PEO4（A）和IGROV-1/CP（B）细胞的代表性Annexin V/7-AAD微毛细管流式细胞术图，以及Annexin V阳性/7-AAD阳性细胞的定量结果。
(C)
处理后PEO4和IGROV-1/CP细胞的代表性明场图像。黑色箭头指示联合处理后PEO4中体积增大的气球样细胞，以及IGROV-1/CP中肿胀/空泡化的细胞。比例尺 = 50 μm。
(D,E)
处理后PEO4（D）和IGROV-1/CP（E）细胞中caspase-3、PARP和gasdermin E（GSDME）裂解情况的免疫印迹分析。
(F,G)
在不添加或添加5 mM甘氨酸（GLY）的条件下，CDDP/NFV处理后PEO4（F）和IGROV-1/CP（G）细胞的乳酸脱氢酶（LDH）释放测定。数据以均值 ± 标准差表示，来源于。采用单因素方差分析结合Tukey事后检验确定统计学显著性。***P < 0.001，与溶剂对照组相比；###P < 0.001，与CDDP联合NFV组相比。
3.3 CDDP/NFV联合治疗激活caspase-8及线粒体凋亡信号通路
鉴于CDDP与
鉴于NFV诱导了细胞裂解以及凋亡和焦亡生物标志物的激活，我们接下来探究这些药物是否启动了上游凋亡信号通路。半胱天冬酶-8可通过将Bid加工为促凋亡Bcl-2家族成员——截短型Bid，将上游死亡信号与线粒体凋亡通路相连接[21]。与此一致，相较于溶剂对照和单药处理，CDDP/NFV联合处理增加了PEO4和IGROV-1/CP细胞中半胱天冬酶-8的裂解（图3A）。与此同时，我们观察到全长Bid水平下降，这与半胱天冬酶-8激活后下游Bid被加工的现象一致（图3A）。为评估药物处理后细胞的线粒体完整性，我们检测了促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的相对水平，因为Bax/Bcl-2比值是决定线粒体外膜（OMM）通透化的重要因素[48]。CDDP与NFV联合处理提高了两种细胞系中的Bax/Bcl-2比值，表明线粒体向促凋亡状态转变（图3B）[48]。与这一结论一致，线粒体内膜（IMM）电位分析显示，联合处理后IMM去极化的细胞比例增加（图3C、D）。转录组分析进一步支持了这些凋亡程序的激活。基因本体生物过程富集分析[49,50]表明，相较于溶剂处理对照，CDDP与NFV联合处理的IGROV-1/CP细胞中，外源性凋亡信号传导、内源性凋亡信号传导以及凋亡相关线粒体变化均显著上调（图3E）。综上，这些结果表明，CDDP与NFV联合使用可在铂耐药卵巢癌细胞中启动与半胱天冬酶-8相关的线粒体凋亡信号传导。
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图
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图3.
奈非那韦与顺铂联合治疗激活卵巢癌细胞中与半胱天冬酶-8相关的线粒体凋亡信号传导。
如图所示，PEO4和IGROV-1/CP细胞分别接受溶剂对照处理（72 h）、CDDP处理（3 h）后换用无药培养基培养（72 h）、NFV处理（72 h），或CDDP处理（3 h）后再接受NFV处理（72 h）。
（A）
处理后PEO4和IGROV-1/CP细胞中半胱天冬酶-8和Bid的免疫印迹分析。
（B）
处理后PEO4和IGROV-1/CP细胞中Bcl-2和Bax的免疫印迹分析。β-肌动蛋白用作上样内参。
（C、D）
处理后PEO4（
C
）和IGROV-1/CP（
D
）细胞线粒体膜电位的代表性微毛细管流式细胞术图，以及去极化/死亡细胞的定量分析。
（E）
基因集富集图显示，与溶剂对照组相比，CDDP/NFV处理的IGROV-1/CP细胞中外源性凋亡信号传导、内源性凋亡信号传导及凋亡相关线粒体变化的基因集富集。数据以均值±标准差表示。采用单因素方差分析及Tukey事后检验确定统计学显著性。***P < 0.001，与溶剂对照组相比；###P < 0.001，与CDDP/NFV组相比。
3.4 CDDP/NFV诱导的细胞死亡依赖于半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-3，但不涉及坏死性凋亡或铁死亡
在确认CDDP/NFV处理可激活与半胱天冬酶-8相关的线粒体凋亡信号传导，并伴随半胱天冬酶-3和GSDME裂解后，我们进一步考察了这些半胱天冬酶是否为所观察到的调控性裂解性细胞死亡所必需。在PEO4和IGROV-1/CP细胞中，使用Z-DEVD-fmk抑制半胱天冬酶-3均可显著恢复联合处理后的细胞活力，表明半胱天冬酶-3的激活是驱动细胞死亡所必需的（
图4A
）。同样，抑制
在CDDP与NFV联合处理时，使用Z-IETD-fmk抑制caspase-8可提高两种细胞系的细胞存活率，支持caspase-8在该反应上游发挥功能性作用（图4B）。免疫印迹分析进一步支持了这一信号传导层级关系。使用Z-DEVD-fmk抑制caspase-3可阻止CDDP/NFV处理后的GSDME裂解，表明GSDME的加工发生于caspase-3活化的下游（图4C）。此外，使用Z-IETD-fmk抑制caspase-8可减少caspase-3和GSDME的裂解，表明caspase-8位于该药物组合所启动的凋亡及细胞裂解机制的上游（图4D）。鉴于除细胞焦亡之外的其他调控性细胞死亡途径也可导致裂解性细胞死亡，我们接下来探究了铁死亡和程序性坏死是否参与CDDP/NFV处理后观察到的细胞裂解。为此，在ferrostatin-1或necrostatin-1存在的条件下，采用CDDP与NFV联合处理细胞。Ferrostatin-1是一种自由基捕获型抗氧化剂，可通过抑制脂质过氧化来阻止铁死亡[51]；necrostatin-1则是一种RIPK1依赖性程序性坏死抑制剂[52]。以文献报道可阻断癌细胞铁死亡和程序性坏死的浓度[51,52]使用这两种抑制剂时，二者均未能挽救CDDP/NFV处理后两种细胞系的细胞存活率（图4E、F）。综上，这些结果表明，CDDP/NFV诱导的细胞裂解依赖于caspase-8和caspase-3的活化，与GSDME裂解相关，且不涉及铁死亡或程序性坏死的激活。
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图4.
CDDP/NFV诱导的细胞死亡依赖于caspase-8和caspase-3，且不涉及铁死亡或程序性坏死。
PEO4和IGROV-1/CP细胞接受溶剂对照或CDDP（10
µM，3 h），随后给予 NFV（20 µM，72 h），并按图示在不添加或添加 Z-DEVD-fmk（caspase-3 抑制剂；100 µM）、Z-IETD-fmk（caspase-8 抑制剂；100 µM）、ferrostatin-1（FER-1，铁死亡抑制剂；1 µM）或 necrostatin-1（NEC-1，程序性坏死抑制剂；10 µM）的条件下进行处理。
(A,C)
在不添加或添加 Z-DEVD-fmk（A）或 Z-IETD-fmk（C）的条件下，经 CDDP + NFV 处理后 PEO4 和 IGROV-1/CP 细胞的细胞活力。
(B)
在不添加或添加 Z-IETD-fmk 的条件下，经 CDDP + NFV 处理的 PEO4 和 IGROV-1/CP 细胞中 Bid、caspase-3 和 gasdermin E（GSDME）的免疫印迹分析。
(D)
在不添加或添加 Z-DEVD-fmk 的条件下，经 CDDP/NFV 处理的 PEO4 和 IGROV-1/CP 细胞中 GSDME 裂解的免疫印迹分析。
(E,F)
在不添加或添加 FER-1（E）或 NEC-1（F）的条件下，经 CDDP/NFV 处理后 PEO4 和 IGROV-1/CP 细胞的细胞活力。数据以均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析结合 Tukey 事后检验确定统计学显著性。与溶剂对照组相比，*P < 0.05、P < 0.01、*P < 0.001；与 CDDP/NFV 组相比，###P < 0.001；ns，无统计学显著性。
3.5 CDDP 与 NFV 联合用药诱导内质网应激及 DNA 损伤相关的促凋亡介质，同时抑制 Akt 存活通路和 DNA 修复因子 53BP1
为将图 3 所示的聚焦于细胞凋亡的转录组分析置于更广泛的转录背景下，我们进一步考察了 CDDDP/NFV 处理的 IGROV-1/CP 细胞相对于溶剂对照组的差异基因表达及 Hallmark 通路富集情况。主成分分析和样本间相关性分析表明，重复样本聚类良好，且各样本间总体一致性良好（补充图 S1）。在通路层面，Hallmark 分析显示，应激及
与细胞死亡相关的通路，包括活性氧（ROS）、细胞凋亡、未折叠蛋白反应（UPR）以及TNF/NF-κB信号通路（图5A）。有趣的是，尽管IGROV-1/CP细胞具有TP53突变背景，p53信号通路仍呈富集（图5A）。相比之下，与糖酵解、胆固醇稳态、脂肪酸代谢、有丝分裂纺锤体、G2/M检查点及E2F靶基因相关的通路则呈负向富集（图5A）。与这种广泛的应激相关反应一致，联合处理后，在PEO4和IGROV-1/CP细胞中均观察到ROS的产生（补充图S2）。总体而言，这些数据表明，CDDP/NFV联合处理使卵巢癌细胞的转录程序由代谢和增殖转向协调一致的应激至死亡状态。为在基因水平上考察这些反应，我们针对溶剂对照、CDDP、NFV和CDDP/NFV处理组中的选定转录本绘制了整合热图。联合处理后，与内质网（ER）应激相关的基因，包括DDIT3［53］（编码CHOP）、ATF3［54］和XBP1［55］，其表达水平均升高（图5B）。同样，与DNA损伤相关促凋亡信号传导有关的基因，包括GADD45A/B［56］、BBC3（编码促凋亡蛋白PUMA）［57］和AEN［58］，也出现上调（图5B）。值得注意的是，我们还观察到与外源性凋亡及死亡受体信号传导相关的转录本表达增加，包括TNFRSF10A（编码死亡受体4；DR4）［59］、TNFRSF10B（编码死亡受体5；DR5）［59］、TNFRSF21（编码死亡受体6；DR6）［60］和FADD［59］（图5B）。这些转录变化进一步支持了以下过程的激活：
在蛋白质和功能层面观察到的caspase-8相关死亡程序。鉴于既往研究已表明，NFV与促存活信号传导的抑制有关，尤其是通过抑制PI3K-Akt通路发挥作用[15]，我们接下来考察了这些转录组数据是否支持本模型中细胞存活和DNA修复通路的下调。KEGG基因集富集分析显示，与溶剂对照相比，CDDP/NFV联合处理细胞中的PI3K-Akt信号通路、同源重组（HR）及范可尼贫血DNA修复通路均呈显著负向富集（图5C）。这些发现提示，CDDP/NFV不仅可促进应激及死亡相关信号传导，还可能削弱适应性存活信号传导，并损害参与铂诱导DNA损伤修复的通路。蛋白质水平的分析进一步支持了转录组学结果。免疫印迹分析证实，在PEO4和IGROV-1/CP细胞中，与溶剂对照及单药处理相比，CDDP/NFV处理均提高了内质网应激诱导蛋白CHOP及其下游转录靶标PUMA[61]的表达（图5D）。与此同时，联合用药降低了Akt的Ser473位点磷酸化水平[62]及其下游靶标GSK-3β的磷酸化水平[62]，与PI3K-Akt存活信号传导受到抑制相一致（图5E）。最后，我们还观察到，NFV及联合处理均降低了53BP1的蛋白水平；53BP1是DNA双链断裂修复的关键调控因子，可在DNA损伤后促进非同源末端连接（NHEJ）[63]。与此一致，相较于溶剂对照和单药处理，联合处理提高了组蛋白H2AX的磷酸化水平（γH2AX），后者是DNA双链损伤的标志物[64]
对照组，支持了这样一种可能性：NFV可能通过限制细胞启动有效DNA修复应答的能力，增强CDDP介导的DNA损伤积累（图5F）。总体而言，这些转录组和蛋白质水平的变化支持这样一种模型：CDDP/NFV联合处理使细胞形成一种以内质网应激、DNA损伤增加且DNA修复减弱、凋亡预激以及死亡受体相关信号传导为特征的状态，同时抑制促存活程序。
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图5。
奈非那韦与顺铂联合处理可在卵巢癌细胞中诱导内质网应激、DNA损伤相关的促凋亡信号传导、存活和DNA修复通路的抑制，以及外源性凋亡信号传导程序。
如图所示，PEO4和IGROV-1/CP细胞分别接受溶剂对照处理（72小时）、顺铂处理（CDDP；10 µM，3小时）后更换为无药培养基培养（72小时）、奈非那韦处理（NFV；20 µM，72小时），或CDDP处理（10 µM，3小时）后再接受NFV处理（20 µM，72小时）。
(A)
相对于溶剂对照组，CDDP/NFV处理的IGROV-1/CP细胞的Hallmark基因集富集分析。点的大小表示基因集大小，颜色表示校正后p值的−log10值。
(B)
热图显示IGROV-1/CP细胞各处理组中与内质网应激、死亡受体信号传导及p53/凋亡相关的选定转录本经Z分数标准化后的表达水平。各列代表独立的生物学重复。表达值以按行标准化的Z分数表示，色标范围限定为±1.25。
(C)
相对于溶剂对照组，CDDP联合NFV处理的IGROV-1/CP细胞中选定KEGG通路的基因集富集图。图中标示了标准化富集分数（NES）、校正后p值和基因集大小。
(D)
CHOP和PUMA表达的代表性免疫印迹分析，检测对象为
处理后的PEO4和IGROV-1/CP细胞。
(E)
处理后PEO4和IGROV-1/CP细胞中磷酸化Akt（Ser473）和磷酸化GSK-3β（Ser9）的代表性免疫印迹分析。
(F)
处理后PEO4和IGROV-1/CP细胞中53BP1和γH2AX（Ser149）的代表性免疫印迹分析。β-actin用作免疫印迹分析的上样内参。
- 讨论
本研究表明，HIV蛋白酶抑制剂NFV可显著增强CDDP对铂耐药卵巢癌细胞的细胞毒性，并使由此引发的细胞死亡反应转向与caspase-8/caspase-3/GSDME相关的裂解性表型。在三种铂耐药卵巢癌细胞系中，NFV均降低了CDDP的IC50，并与CDDP表现出强烈的协同作用。在机制上，CDDP/NFV联合处理可诱导细胞凋亡和细胞焦亡的双重特征，包括Annexin V/7-AAD阳性、caspase-3和PARP裂解、GSDME裂解、LDH释放以及质膜破裂的形态学表现。我们进一步确定，caspase-8是促进这一反应的上游因子，其作用先于Bid减少、caspase-3活化和GSDME加工；这一过程发生于以内质网应激、DNA损伤相关促凋亡信号传导、死亡受体相关转录变化、DNA修复信号传导受损以及促存活通路活性降低为特征的细胞背景中。综上，这些发现支持如下模型：NFV通过放大治疗相关的细胞应激，同时促进裂解性细胞死亡反应，从而增强CDDP的毒性（
图6
）。
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图6.
CDDP/NFV在铂耐药卵巢癌细胞中诱导caspase依赖性裂解性细胞死亡的示意模型。
CDDP促进DNA损伤，而NFV则导致内质网应激持续未缓解、DNA修复能力下降，以及
细胞存活信号传导减弱。这些细胞应激反应共同诱导CHOP和促凋亡蛋白PUMA的表达，促使Bax/Bcl-2平衡发生偏移，进而导致线粒体功能障碍。与此同时，联合治疗激活了与caspase-8相关的信号传导，包括Bid的加工，进一步将上游凋亡信号与线粒体凋亡通路联系起来。这些事件最终汇聚于caspase-3的激活，后者切割GSDME，生成GSDME N端片段，导致质膜上形成孔道，并释放离子及其他细胞内小分子。随后，NINJ1发生寡聚化，触发细胞膜破裂，使LDH释放，最终导致细胞完全裂解。
这些发现对卵巢癌尤为重要，因为铂类化疗仍是其治疗的基石，但其疗效常因复发及最终出现铂耐药而受限[11]。在许多情况下，铂耐药不仅反映了诱导损伤的失败，也反映了细胞将应激和损伤信号转化为高效执行细胞死亡程序的能力受损[4,65]。在此背景下，利用临床可用药物增强细胞对铂类衍生物反应的药物再利用策略尤其具有吸引力[66]。NFV已成为一种颇具前景的药物再利用候选药物，因为除其原有的抗病毒作用外，研究还发现，在包括高级别浆液性卵巢癌在内的多种模型系统中，NFV与诱导内质网应激、破坏蛋白质稳态、抑制促存活通路以及增强对抗癌治疗的反应性有关[14,15,67,68]。我们的研究结果在铂耐药卵巢癌细胞中进一步拓展了这一理论依据，其方式是
表明NFV不仅以协同方式增强CDDP的细胞毒性，还改变了随后发生的细胞死亡反应的性质。这对于那些承受铂类药物诱导的毒性损伤、却无法将此类损伤转化为有效细胞死亡程序的肿瘤而言，可能尤为重要。
我们的数据提示，NFV通过增强与CDDP诱导的遗传毒性损伤形成互补的应激通路，同时削弱原本有助于细胞存活和恢复的通路，降低细胞进入不可逆死亡过程的阈值。CDDP是一种强效DNA损伤剂[9,18]，但许多卵巢癌细胞可通过启动适应性反应来抑制凋亡的执行，从而在CDDP暴露后存活[4,69]。我们的数据提示，NFV增加了一层互补性的细胞应激，有助于使这一平衡转向细胞死亡的执行，其中不仅涉及凋亡，还涉及细胞焦亡的分子介导因子。转录组和蛋白质水平的分析显示，未折叠蛋白反应（UPR）被激活，CHOP和GRP78等内质网应激标志物的表达增加，以γH2AX水平升高为标志的DNA损伤相关信号传导增强，以及PUMA等促凋亡介导因子被诱导表达。通路富集分析进一步支持凋亡信号传导、活性氧（ROS）相关信号传导及p53相关转录输出增强，同时增殖、代谢、DNA修复及PI3K-Akt相关的存活程序受到抑制。总体而言，这些发现支持如下模型：在CDDP基础上加入NFV，可使细胞从亚致死性或执行不完全的凋亡反应转向由caspase-8/-3/GSDME驱动的终末性继发细胞焦亡程序。这一点值得关注，因为越来越多的研究表明，GSDME是决定化疗诱导的caspase-3活化最终如何
表达：在GSDME表达充足的细胞中，执行者半胱天冬酶可驱动细胞膜孔形成和终末性裂解，而非使细胞走向非裂解性的凋亡终点[70]。未完成凋亡过程的细胞可能携带严重损伤并处于细胞应激状态，持续存留于肿瘤内；而将caspase-3活性导向GSDME相关的继发性细胞焦亡，则可能降低肿瘤细胞恢复的可能性[70–72]。肺腺癌的相关研究也发现，基于NFV的治疗与caspase-3和GSDME的裂解有关，提示该信号轴的参与可能并不限于卵巢癌，尽管不同肿瘤类型的上游背景可能有所不同[73]。
本研究最重要的发现之一是caspase-8的上游作用。CDDP/NFV联合处理增强了caspase-8的裂解，而药理学抑制caspase-8则提高了细胞存活率，同时减少了caspase-3和GSDME的裂解，表明caspase-8位于凋亡／焦亡执行过程及该反应裂解性分支的上游。鉴于caspase-8处于外源性与内源性细胞死亡信号通路的交汇处，这一发现尤为值得关注。通过对Bid的加工，caspase-8既可放大线粒体凋亡信号，也可直接参与执行者半胱天冬酶的激活[74]。我们在本研究中观察到的全长Bid减少、Bax/Bcl-2比值升高以及线粒体去极化，均与这种信号放大机制一致[48]。与此同时，对经CDDP/NFV处理的铂耐药卵巢癌细胞进行RNA-seq分析显示，包括DR4、DR5、DR6和FADD在内的死亡受体相关转录本表达增加，提示CDDP/NFV联合处理可能使细胞进入有利于死亡受体相关……的状态
或类似死亡受体介导的 caspase-8 激活[75,76]。CHOP 在这一背景下可能尤为重要，因为未能缓解的内质网（ER）应激可通过 CHOP 的活性上调 DR5 表达，并促进死亡诱导信号复合物（DISC）的形成，从而将内质网应激反应与外源性凋亡信号通路联系起来[77,78]。然而，确切的上游触发因素仍未明确。内质网应激、活性氧（ROS）积累、死亡受体预激以及非配体依赖性死亡受体信号传导均可能参与 caspase-8 的激活，值得进一步研究[76,79–81]。尽管如此，将 caspase-8 鉴定为具有功能作用的上游节点，为理解 CDDP 与 NFV 如何协同增强下游 caspase-3/GSDME 信号传导提供了重要的机制框架。
铂耐药卵巢癌细胞对 CDDP/NFV 联合用药反应的另一个值得关注的方面是，尽管这些细胞具有 p53 突变背景，仍出现了与 p53 相关的促凋亡转录程序。这一点在卵巢癌中尤为重要，因为 TP53 突变和 p53 功能丧失是大多数病例的典型特征[1,82,83]。联合药物处理使 p53 通路富集，具体表现为 BBC3、GADD45A/B 和 AEN 等转录本的表达增加，而这些转录本通常均与经典的 p53 介导的细胞应激反应相关[84]。这些发现并不意味着野生型 p53 功能得到恢复，而更可能反映了应激响应性转录调控网络的激活，该网络汇聚于经典 p53 下游效应的部分组分。在这一背景下，CHOP 可能同样发挥作用。除了作为未缓解的内质网应激的标志物外，CHOP 还可促进凋亡相关的
通过诱导PUMA、BIM和NOXA等仅含BH3结构域的蛋白，促进细胞进入凋亡预备状态[53, 61, 81, 85]。与这一观点一致，在所检测的两种p53突变型细胞系中，均在蛋白水平上观察到PUMA表达增加。因此，在CDDP治疗中加入NFV，可能有助于卵巢癌细胞通过替代性应激通路获得一种“p53样”促凋亡状态，从而有望绕过TP53突变型卵巢癌细胞中阻碍CDDP有效诱导细胞死亡的一个重要屏障。
最后，我们的数据还表明，NFV通过抑制适应性存活信号传导并削弱DNA损伤修复能力，促进细胞对联合用药产生应答。在蛋白水平上，NFV降低了Akt及其下游靶标GSK-3β的磷酸化水平，转录组分析则证实，CDDP/NFV联合治疗使PI3K-Akt信号通路呈负向富集。这一作用可能具有重要意义，因为Akt活性可通过促进细胞存活、维持代谢适应及对抗凋亡执行过程，与CDDP耐药相关联[10, 86]。其他卵巢癌研究也支持我们的数据：PI3K-Akt通路的激活与铂类药物敏感性降低，以及受损细胞在持续遗传毒性应激下仍能存活有关，而抑制Akt则已被证明可使耐药细胞重新对CDDP敏感[87, 88]。与此同时，CDDP/NFV治疗升高了γH2AX水平，而NFV单药及其与CDDP联用均降低了53BP1的表达，这与DNA修复能力受阻情况下未修复DNA损伤的积累相一致[89]。除53BP1减少外，我们还观察到同源重组（HR）和范可尼贫血通路呈负向富集，这两条通路对于修复CDDP诱导的DNA损伤均至关重要[90, 91]。
这一点在卵巢癌中尤为重要，因为同源重组（HR）能力的恢复，包括通过恢复野生型功能的BRCA回复突变（如PEO4细胞中报道的此类突变[92]），是公认的获得性铂类耐药机制[93]。在此背景下，NFV介导的对53BP1等修复相关因子的抑制，以及对HR和范可尼贫血信号通路的下调，可能有助于限制铂类耐药细胞从CDDP诱导的DNA损伤中恢复的能力。上述作用共同为NFV如何促进铂类药物诱导的应激转化为更难逆转的死亡反应提供了合理解释。
本研究存在若干局限性。首先，这些发现基于体外铂类耐药卵巢癌模型，NFV是否在体内促进类似的死亡程序，尤其是在肿瘤微环境中，仍有待确定。其次，尽管我们的数据表明caspase-8是一种具有功能作用的上游介导因子，但尚未明确导致其激活的具体分子事件。最后，尽管我们的药理学实验不支持程序性坏死或铁死亡在所测试条件下发挥主要作用，但仍无法完全排除其他调控性细胞死亡途径在特定情境下的参与。这一点对于铁死亡可能尤为重要，因为近期研究表明，单独使用NFV即可在肝癌细胞中诱导内质网应激相关的铁死亡[94]，提示NFV所启动的主要死亡程序可能随细胞背景以及NFV是单药使用还是与化疗联合使用而有所不同[94]。尽管存在上述局限性，我们的研究结果仍为将NFV作为一种
作为铂类药物的增效联合用药，以进一步增强细胞毒性，尤其是在铂耐药卵巢癌中。通过增强细胞应激信号传导并促进与caspase-8/caspase-3/GSDME相关的裂解性细胞死亡，NFV可能提高CDDP对原本能够逃避细胞死亡程序完全执行的肿瘤的疗效，支持进一步评估其作为药物再利用的辅助治疗药物在接受铂类药物治疗的卵巢癌中的应用。
利益冲突声明
作者声明，不存在任何已知的、可能被认为会影响本文所报告工作的财务利益冲突或个人关系。
伦理声明
不适用。
CRediT作者贡献声明
Benjamin Forgie：
概念构思、初稿撰写、方法学、研究实施、正式分析、可视化。
Rewati Prakash：
研究实施、审阅与编辑。
Desiree Marno：
研究实施、审阅与编辑。
Farah H. Abdalbari：
研究实施、审阅与编辑。
Edith Zorychta：
审阅与编辑。
Abu Shadat M. Noman：
经费获取。
Alicia A. Goyeneche：
审阅与编辑、监督指导、方法学。
Lucy Gilbert：
经费获取、资源提供、审阅与编辑。
Julia V. Burnier：
审阅与编辑、监督指导、经费获取、资源提供。
Carlos M. Telleria：
审阅与编辑、监督指导、资源提供、项目管理、经费获取、概念构思。
数据可用性
数据可应要求提供。
致谢
本研究获得了北美DxQuest Inc.、加拿大卵巢癌组织、麦吉尔大学Gerald Bronfman肿瘤学系内部经费（资助对象为LG），以及授予Benjamin Forgie的加拿大研究生奖学金博士研究奖（CGSD，获奖编号：193306）的支持。JVB
获得魁北克健康研究基金（资助编号：312831）的支持。
已声明的资助机构信息
加拿大卫生研究院，
，193306
魁北克健康研究基金，
，312831
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发布于 2026 年 7 月 1 日。
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尼非那韦与顺铂联合用药通过铂类耐药性卵巢癌细胞中的 caspase-8/caspase-3/GSDME 轴诱导裂解性细胞死亡
Benjamin Forgie、Rewati Prakash、Desiree Marno、Farah H. Abdalbari、Edith Zorychta、Abu Shadat M. Noman、Alicia A. Goyeneche、Lucy Gilbert、Julia V. Burnier、Carlos M. Telleria
bioRxiv
2026.06.30.735544
doi: https://doi.org/10.64898/2026.06.30.735544
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尼非那韦与顺铂联合用药通过铂类耐药性卵巢癌细胞中的 caspase-8/caspase-3/GSDME 轴诱导裂解性细胞死亡
Benjamin Forgie、Rewati Prakash、Desiree Marno、Farah H. Abdalbari、Edith Zorychta、Abu Shadat M. Noman、Alicia A. Goyeneche、Lucy Gilbert、Julia V. Burnier、Carlos M. Telleria
bioRxiv
2026.06.30.735544
doi: https://doi.org/10.64898/2026.06.30.735544
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关键词：奈非那韦与顺铂联合治疗 · 铂耐药卵巢癌 · 裂解性细胞死亡 · 细胞焦亡 · caspase-8/caspase-3/GSDME轴
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.30.735544v1?rss=1