直接 RNA 纳米孔测序能够直接分析天然 RNA，并可根据 RNA 通过孔道时电流信号的变化检测多种表转录组修饰。化学体系、硬件和生物信息学工具的创新提升了测序通量和准确性，因而推动了在单次测序运行中对多个样本进行测序的需求。近期有两种方案可实现样本条形码标记和拆分，但针对其性能的独立比较仍然有限。本研究利用基于物种身份和配对体外转录（IVT）加标样本的正交真值集，在四张 RNA004 流动槽上对 WarpDemuX 和 SeqTagger 进行基准评估。两种工具的拆分精确率均较高，但在精确率与读段保留率之间存在不同的权衡。SeqTagger 在其推荐设置下表现稳定；WarpDemuX 的表现则随模型、条形码和读段质量而变化。基于 IVT 得出的评分阈值可针对具体数据集进行校准，并提高 WarpDemuX 的分配产出；然而，在 IVT 样本中达到的精确率并不总能在物种读段中重现。这些结果表明，配对 IVT 可作为内部对照，辅助选择拆分设置；同时也凸显了在生物 RNA 群体中验证拆分精确率的必要性。
直接 RNA 纳米孔测序能够直接分析天然 RNA，从而根据 RNA 通过孔道时引起的电流变化检测多种表观转录组修饰。化学、硬件和生物信息学工具的创新提升了测序通量和准确性，也因此促使研究者希望在单次测序运行中处理多个样本。近期有两种方案可用于样本条形码标记和拆分，但对其性能进行独立比较的研究仍然有限。本研究利用基于物种身份和匹配的体外转录（IVT）加标样本所建立的正交真值集，在四个 RNA004 流动槽上对 WarpDemuX 和 SeqTagger 进行了基准评估。两种工具均具有较高的拆分精确率，但在精确率和数据保留率之间的权衡有所不同。SeqTagger 在其推荐设置下表现稳定，而 WarpDemuX 的表现则随模型、条形码和读段质量而变化。基于 IVT 得出的评分阈值可用于针对特定数据集进行校准，并提高 WarpDemuX 的分配读段产出；然而，在 IVT 样本中达到的精确率并未稳定地复现在物种来源读段中。这些结果表明，匹配的 IVT 样本可作为内部对照，用于指导拆分设置的选择；同时也显示，仍需在生物 RNA 群体中验证拆分精确率。
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关键词：直接RNA测序 · 纳米孔测序 · 样本去复用 · 条形码拆分 · 生物信息学基准评估
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.10.03.756430v1?rss=1