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在原肠胚形成过程中，胚胎上皮发生大规模重塑，使中胚层内化。不同物种中组织形变背后的细胞机制是否保守，目前尚不明确。我们采用定量细胞形态嵌入方法，比较两种昆虫原肠胚形成过程中细胞的行为。结果显示，尽管果蝇中胚层细胞在原肠胚形成过程中遵循协调的形态变化序列，甲虫赤拟谷盗的中胚层细胞却呈现异质性形态，且不存在明显的变化轨迹。这种异质性源于两种不同的内化模式：典型的、由顶端收缩驱动的组织内陷，以及通过面外细胞分裂实现的早期内化。可解释机器学习结合体内扰动实验表明，细胞核拥挤是预测面外分裂的关键因素；同时还发现，在这两个物种中，细胞增殖会减缓组织折叠，却促进单个细胞内化。本研究展示了形态空间分析作为剖析组织形态发生细胞基础的有力工具，并揭示了原肠胚形成过程中细胞分裂与组织折叠之间一种保守的拮抗关系。
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形态空间分析揭示了驱动昆虫原肠胚形成过程中组织内化的不同细胞行为
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Margherita
Battistara
，
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Wolfram
Pönisch
，
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Matthew A.
Benton
，
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Ewa K.
Paluch
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.06.30.735526
Margherita Battistara
1
剑桥大学生理学、发育与神经科学系
，剑桥 CB2 3DY，
英国
3
剑桥大学遗传学系
，剑桥 CB2 3EH，
英国
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Wolfram Pönisch
1
剑桥大学生理学、发育与神经科学系
，剑桥 CB2 3DY，
英国
4
Human Technopole，Viale Rita Levi-Montalcini 1
，20157，米兰，
意大利
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Matthew A. Benton
2
剑桥大学动物学系
，剑桥 CB2 3EJ，
英国
5
欧洲分子生物学实验室（EMBL）发育生物学研究部
，海德堡 69117，
德国
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Ewa K. Paluch
1
剑桥大学生理学、发育与神经科学系
，剑桥 CB2 3DY，
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摘要
在原肠胚形成过程中，胚胎上皮发生大规模重塑，使中胚层内移。这些组织形变背后的细胞机制在不同物种间是否保守，目前仍不清楚。我们利用定量细胞形状嵌入方法，比较了两种昆虫原肠胚形成过程中的细胞行为。我们发现，果蝇（Drosophila）的中胚层细胞在原肠胚形成过程中遵循协调的形状变化序列，而赤拟谷盗（Tribolium）的中胚层细胞则呈现异质性形状，且没有明确的变化轨迹。这种异质性源于两种不同的内移模式：经典的由顶端收缩驱动的组织内陷，以及通过离面细胞分裂实现的早期内移。可解释机器学习与活体扰动实验相结合，确定了细胞核拥挤是离面分裂的关键预测因素，并表明在这两个物种中，细胞增殖均会减缓组织折叠，同时促进单个细胞内移。本研究展示了形态空间分析作为解析组织形态发生之细胞基础的有力工具，并揭示了原肠胚形成过程中细胞分裂与组织折叠之间保守的拮抗关系。
引言
胚胎发育通过一系列精确有序且相互协调的细胞行为推进¹˒²。理解单个细胞的行为如何驱动整体组织形态发生，以及这些行为如何演化并造就地球上生命的多样性，仍然是生物学的核心挑战。
原肠胚形成是动物胚胎发生过程中首次大规模、协调的组织重排，在此期间
在这一过程中，中胚层和内胚层前体细胞从简单且通常为单层的胚盘上皮向内部迁入³。尽管原肠胚形成具有深远的演化起源，但驱动组织内化的细胞机制在不同物种间表现出极大的多样性³,⁴。事实上，尽管原肠胚形成通常涉及顶端收缩，以及与中胚层和内胚层细胞上皮—间质转化（EMT）相关的上皮极性丧失和黏着连接解体⁵，但这些细胞行为发生的时序及其协调方式在不同物种间差异显著⁶。由此产生的组织内化方式构成了一个连续谱，从整体协调的组织弯曲或折叠，到通过单个细胞内移实现内化。
例如，在鸡和小鼠胚胎中，集体性顶端收缩首先形成浅表内陷，即原条；随后，中胚层细胞在此处逐渐解体其顶端连接，并以单细胞形式向内迁入⁷–⁹。单细胞内移也驱动许多无脊椎动物物种的中胚层和／或内胚层内化，包括某些刺胞动物¹⁰和海胆¹¹。相比之下，其他刺胞动物¹²以及昆虫（如黑腹果蝇 Drosophila melanogaster，以下简称果蝇）则通过协调的上皮片层弯曲和内陷实现组织内化。最后，许多动物胚胎，尤其是爬行动物、鱼类和两栖动物的胚胎，采用混合型内化方式，将细胞内移和上皮内陷的特征与组织内卷相结合¹⁶–¹⁹。
驱动中胚层内化的细胞机制在果蝇中得到了尤为详尽的描述²⁰,²¹，使其成为上皮内陷的经典范例²²。从一个
在单层上皮中，柱状胚盘细胞同步伸长并发生顶端收缩，从而形成腹沟。这使中胚层组织以连续完整的单层形式向内折叠。其他昆虫的原肠胚形成方式高度多样，从单细胞内移²³到刚性上皮片层不经弯曲而内化²⁴，均有存在，但对其背后细胞行为的详细分析大多仍然缺乏。赤拟谷盗（Tribolium castaneum）是除果蝇（Drosophila）之外研究最为充分的昆虫模型²⁵–²⁷。赤拟谷盗中胚层的原肠胚形成涉及与果蝇相同的关键调控因子的同源物，包括 Tc-twist（Tc-twi）、Tc-snail（Tc-sna）以及 Fog 信号通路，并且同样由组织弯曲和腹沟内陷所驱动²⁸–³¹。然而，这种折叠在胚胎不同区域之间的变异更大²⁹，而且有研究提出，除顶端收缩外的其他细胞行为，包括中胚层细胞分裂及单个细胞通过上皮—间充质转化（EMT）发生内移，也可能有助于中胚层内化²⁹。在赤拟谷盗中胚层内化过程中，此类单个细胞行为与协调的腹沟内陷各自的相对重要性仍不明确。
在此，我们将定量细胞形态映射、基于机器学习的组织动态分析与扰动实验相结合，以解析果蝇和赤拟谷盗中胚层原肠胚形成背后的细胞行为。我们的研究揭示了保守的原肠胚形成结果背后出乎意料的机制多样性，并提示细胞增殖与顶端收缩之间平衡的进化性调节，可能塑造了昆虫中胚层内陷的不同模式。
结果
形态空间分析揭示不同的细胞形态变化轨迹
在果蝇（Drosophila）和拟谷盗（Tribolium）中胚层原肠胚形成过程中
我们采用形态空间分析³²，定量表征果蝇和拟谷盗中胚层原肠胚形成过程中的细胞形状变化（图1）。我们在原肠胚形成期间按固定时间间隔收集并固定果蝇和拟谷盗胚胎。随后，使用DAPI对细胞核进行荧光染色，并使用鬼笔环肽对细胞轮廓进行荧光染色（图1A），同时结合杂交链式反应（HCR）染色，检测中胚层模式形成基因twi和sna（拟谷盗中的Tc-twi和Tc-sna）的表达，以识别预定中胚层细胞（图S1A）。已有报道指出，拟谷盗的原肠胚形成沿前后轴存在差异²⁹，因此，我们利用分节基因Tc-even-skipped³³的表达，在不同胚胎之间比较相对应的前部区域。随后，我们对果蝇和拟谷盗胚胎中的中胚层细胞进行三维分割（图1A，见方法）。我们分析了中胚层原肠胚形成期间6个时间点的12枚固定果蝇胚胎（图1C、C′）和7个时间点的14枚固定拟谷盗胚胎（图1D、D′）的细胞形状；从胚盘期至中胚层铺展阶段，每个时间点均取两枚胚胎。通过分析，我们共获得了3,794个果蝇细胞和4,075个拟谷盗细胞的三维轮廓。
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图1.
果蝇和拟谷盗中胚层原肠胚形成过程中细胞形状变化轨迹的形态空间分析
（A）中胚层细胞的三维分割。上：分割流程。细胞核（DAPI）的共聚焦图像上叠加了粉色掩膜，表示使用Cellpose分割获得的细胞核轮廓。提取细胞核质心坐标，并将其用作种子点，基于鬼笔环肽标记的
使用 LimeSeg 重建细胞轮廓。对于每个细胞核，初始化一个球形种子，并通过迭代扩张重建完整的三维细胞轮廓。下图：分割后的中胚层细胞的全组织三维渲染图。比例尺：10 µm。
(B) 形态空间分析流程概述。将分割后的细胞轮廓分解为球谐函数（SPHARMS）系数（左）。使用主成分分析（PCA）对大型 SPHARMS 系数数据集进行降维，以生成细胞形状的形态空间（右）。
(C 和 D) 中胚层发育期间经鬼笔环肽染色的果蝇（Drosophila）(C) 和赤拟谷盗（Tribolium）(D) 胚胎腹侧横截面；根据组织整体形态将胚胎按时间顺序排列。比例尺：20 µm。(C’ 和 D’) 与 (C) 和 (D) 中胚胎发育阶段对应的中胚层细胞平均三维轮廓。通过对每个发育阶段的两个胚胎中所有分割后的中胚层细胞的球谐函数系数取平均值，重建平均形状。
(E 和 F) 正在进行原肠胚形成的果蝇（Drosophila）(E) 和赤拟谷盗（Tribolium）(F) 胚胎中中胚层细胞的三维形状，绘制于 PC1–PC2 形态空间中。该形态空间使用所有已分析的赤拟谷盗和果蝇胚胎中所有分割后的中胚层细胞轮廓构建。背景灰度形状：根据形态空间中 PC1 和 PC2 的不同组合重建的理论细胞形状。数据点：单个细胞的形状；在 (E) 中，不同深浅的蓝色对应来自不同果蝇胚胎的细胞；在 (F) 中，不同深浅的橙色对应来自不同赤拟谷盗胚胎的细胞。较深的色调表示较晚的时间点，与 (C’) 和 (D’) 中一致。大圆点：每个胚胎对应分布的质心；数字对应 (C) 和 (D) 中的胚胎编号。黑色线条
突出显示形态空间中中胚层细胞的平均形状变化轨迹。
随后，我们改进了近期开发的形态空间分析流程³²，以对细胞轮廓数据集进行定量分析（图1B）。首先，我们利用球谐函数（SPHARMs）分解对每个三维细胞轮廓进行参数化，得到一组可定量描述细胞轮廓的系数。我们发现，40阶SPHARMs（对应每个细胞5043个SPHARM系数）足以高精度地描述数据集中的细胞形状（见方法和图S1B）。随后，我们采用主成分分析（PCA）对该SPHARMs系数数据集进行降维分析。我们发现，形状变异的前两个主成分（PC）合计解释了整个细胞轮廓数据集中66.7%的形状变异，而此后每个主成分所解释的形状变异均不足5%（图S1C）。因此，我们将后续分析重点放在形状变异的PC1和PC2上。PC1增大表示细胞由细长、体积较大且呈楔形的形态向紧凑、体积较小的形态转变，而PC2增大则反映细胞由细长形态向更圆的形态转变（图S1D）。随后，我们将PC1和PC2作为形态空间的坐标轴，分析果蝇和赤拟谷盗原肠胚形成过程中与中胚层内陷相关的细胞形状变化。
对果蝇细胞形状的形态空间分析揭示了一条清晰的整体形状变化轨迹（图1E和图S1E，实线突出显示形状变化轨迹）。最初，细胞呈柱状，随后逐渐伸长、体积增大，并且楔形特征日益明显，这体现为PC1急剧下降（图1E，比较胚胎1、2与胚胎3、4）。组织内陷后（图1E，从胚胎5开始），
细胞呈现出更短、更圆的形态，对应于PC1和PC2均升高。最后，中胚层细胞逐渐呈现出更小且更铺展的形态，表现为PC2降低、PC1进一步升高（图1E，胚胎9–12）。综上，我们的形态空间分析定量描述了果蝇原肠胚形成过程中中胚层细胞的三维形态变化。
与果蝇不同，对赤拟谷盗中胚层细胞的形态空间分析未揭示原肠胚形成过程中明确的形态变化轨迹（图1F和S1F）。相反，细胞在两种总体形态之间发生了急剧转变。在早期阶段，赤拟谷盗中胚层细胞主要呈立方体形态（图1F，胚胎1–4），其PC2值高于早期果蝇中胚层的柱状细胞（图1F，胚胎1和2）。在胚胎4和5之间，赤拟谷盗中胚层细胞转变为更小且总体上更细长的形态，表现为PC2降低（图1F）。然而，在考察平均细胞形态时，组织内化过程中相邻阶段之间的细胞形态差异无法得到清晰区分（图1F，胚胎5及之后）。为进一步探索该数据集，我们采用了另一种非线性降维算法——t分布随机邻域嵌入（t-SNE）。该算法根据形态的局部相似性重新排列数据点，将高维数据嵌入二维空间，从而有助于在视觉上将形态相似的细胞归为一组。然而，我们发现，与PCA一样，t-SNE分析也未能揭示赤拟谷盗原肠胚形成过程中明确的中胚层细胞形态变化轨迹（图S1G、H）。
综上，我们的细胞轮廓数据集和形态空间分析共同构成了一个
为表征昆虫原肠胚形成过程中细胞三维形态的变化提供了丰富的定量资源。这一定量分析表明，尽管中胚层基因表达模式相似（图 S1A），且组织整体形态变化相似（图 1C、D），果蝇（Drosophila）与赤拟谷盗（Tribolium）在原肠胚形成过程中的中胚层细胞形态动态仍存在显著差异。在果蝇中，中胚层细胞在原肠胚形成的各个阶段均呈现一致的形态，从而形成明确的平均形态变化轨迹；而在赤拟谷盗中，细胞形态并未呈现清晰的变化轨迹。
赤拟谷盗的原肠胚形成伴随着部分细胞的早期内移
随后，我们进一步研究了赤拟谷盗中胚层原肠胚形成过程中的细胞形态动态。我们首先考察，单个胚胎内细胞形态的变异在多大程度上可能掩盖赤拟谷盗中胚层形态空间中的定向形态变化。为评估形态变异，我们首先确认，形态空间中各点之间的距离能够定量反映实际细胞形态之间的差异（图 S2A）。随后，我们利用形态空间距离（基于所有主成分，见方法）量化细胞形态差异，并计算了每个胚胎中中胚层细胞形态的总方差（图 S2B）。我们发现，胚胎 3 和胚胎 4 在我们的数据集中表现出最高的细胞形态方差。果蝇从细胞化开始直至原肠胚形成结束后，细胞分裂均受到抑制³⁴–³⁶；与之不同，赤拟谷盗的中胚层细胞在原肠胚形成过程中会经历一轮分裂³⁷。由于早期胚胎中的细胞分裂通常伴随着子细胞相较于母细胞的体积骤减，我们因此思考，与分裂相关的体积变化是否可能解释赤拟谷盗在……过程中细胞形态变异的增加。
原肠胚形成。因此，我们通过构建新的形态空间，在按体积对每个细胞进行归一化后，重新分析了拟谷盗中胚层细胞的形状轨迹。该分析并未揭示更清晰的细胞形状轨迹（图2A和图S2C）。然而，经体积归一化后的细胞形状方差在腹沟形成时达到峰值（图2B中的胚胎7和8，以及图S2C），表明在原肠胚形成的这一阶段，中胚层细胞的形状变异性增大，且这种变化独立于细胞分裂相关的体积变化。
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图2.
拟谷盗原肠胚形成伴随着部分细胞的早期内化。
(A) 正在进行原肠胚形成的拟谷盗胚胎中，中胚层细胞三维形状的袋形图表示，绘制于体积归一化后构建的PC1–PC2形态空间中。多边形表示袋形图：内层多边形（袋）包含50%的数据点，外层多边形（围栏）对应于所有数据的凸包。黑线：按图1E、F所述方式定义的细胞形状轨迹。
(B) 细胞体积归一化后，各阶段所有球谐函数的总方差（见公式2和方法部分）。
(C) 经鬼笔环肽染色的拟谷盗胚胎腹侧横截面，展示中胚层内陷的三个连续阶段（囊胚期、腹沟期和管状期）。右侧以不同颜色标示分割后的中胚层细胞，突出显示腹沟期的两个细胞群体：发生顶端收缩的细胞（浅橙色）和发生早期内化的细胞（深橙色）。比例尺，20 µm。
(D) 将处于(C)所示阶段的胚胎中胚层细胞形状绘制于聚焦的PC1–PC2形态空间中，显示早期内化细胞的独特细胞形状轨迹，以及
顶端收缩的细胞。形态空间利用赤拟谷盗（Tribolium）和果蝇（Drosophila）胚胎在胚盘、腹沟和管状发育阶段的所有已分割中胚层细胞轮廓构建（每个阶段2个胚胎）。背景灰度形状：根据PC1和PC2的不同组合重建的理论细胞形状。数据点：单个细胞的形状；橙色深浅对应于（C）中标示的发育阶段。多边形表示袋状图：内层多边形（袋）包含≤50%的数据点，外层多边形（围栏）对应于所有数据的凸包。大圆点：每个胚胎对应分布的质心。黑线标示形态空间中平均细胞形状的变化轨迹。
（E）在中胚层内陷的三个连续步骤（胚盘期、腹沟期和管状期）中，经鬼笔环肽染色的果蝇胚胎腹侧横截面，分割出的中胚层细胞以蓝色标示（右）。比例尺，20 µm。
（F）将（E）所示阶段胚胎的中胚层细胞形状绘制于与（D）相同的、聚焦于PC1–PC2的形态空间中。数据点和轨迹的含义：同（D）。
（G）左：处于原肠胚形成期的赤拟谷盗胚胎腹侧的延时成像，该胚胎瞬时表达squash-GFP以标记肌球蛋白。比例尺，20 µm。右：顶端肌球蛋白强度的定量分析。图中显示了两个胚胎沿腹侧横截面的肌球蛋白分布曲线（灰度线），以及对其平均值进行的高斯拟合（黑线）。
有趣的是，我们还观察到，在赤拟谷盗腹沟形成阶段，一部分中胚层细胞似乎已内化，而其他细胞则呈楔形（图2C），这与既往研究一致，后者表明赤拟谷盗的中胚层似乎
在原肠胚形成过程中呈多层结构²⁹。因此，我们探究了这两个细胞群体是否在形态空间中占据不同的位置，从而解释该阶段细胞形状总体变异性的增加。为此，我们构建了一个最小形态空间，重点分析在腹沟形成前、形成期间及形成后固定的胚胎（图2C和补充图S3A、B）。这些阶段分别对应胚盘期、腹沟形成本身以及管状期。当我们将发生早期内化的中胚层细胞（图2C和2D中的深橙色）与其他中胚层细胞（图2C和2D中的浅橙色）区分开来时，发现这两个细胞群体呈现出不同的形态空间轨迹（图2D和补充图S3C）。具体而言，早期内化细胞在腹沟形成阶段表现出缩短和变圆，其特征为PC2显著降低，而在管状期形态未发生显著变化（图2D左）。相比之下，晚期内化细胞在腹沟形成时表现出PC1和PC2同时降低，反映出细胞伸长和顶端收缩；随后在管形成时发生缩短和变圆，表现为PC1和PC2均略有升高（图2D右）。晚期内化细胞的形状变化轨迹与果蝇（Drosophila）中胚层细胞在组织内陷相似阶段的形状变化行为相似（图2E、F和补充图S3D），但起始点不同，因为赤拟谷盗（Tribolium）的胚盘细胞呈立方状，而非果蝇胚盘细胞的柱状（比较图2C和2E中的胚盘期细胞）。在果蝇中，驱动腹沟形成的顶端收缩由肌球蛋白介导的收缩提供动力³⁸˒³⁹。因此，我们分析了赤拟谷盗中的肌球蛋白分布
通过对瞬时表达与 GFP 融合的非肌肉肌球蛋白 II 调节轻链（下文简称为肌球蛋白；squash-GFP）的胚胎进行活体成像，观察中胚层，并发现肌球蛋白在腹沟形成之前便已在细胞顶端积聚（图 2G，视频 S1）。这一结果有力地表明，赤拟谷盗中较晚内化的中胚层细胞所呈现的顶端收缩形态，源于肌球蛋白驱动的顶端收缩，与果蝇中已描述的情况一致。
综上，我们的定量形态分析表明，在赤拟谷盗原肠胚形成过程中，除细胞分裂引起的体积变化外，腹沟形成时细胞形态的变异程度最高。对细胞形态动态的针对性分析显示，在赤拟谷盗组织内陷过程中，存在两种不同的细胞形态空间轨迹：较晚内化的细胞与果蝇中的对应细胞相似，表现出肌球蛋白驱动的顶端收缩；而一部分中胚层细胞则较早内化，且在内化后不再表现出进一步的形态变化。
平面外分裂和细胞挤出驱动赤拟谷盗中胚层细胞的早期内化
随后，我们探究了哪些细胞行为驱动赤拟谷盗原肠胚形成过程中观察到的早期细胞内化。我们首先假设，早期内化可能由细胞向基底侧挤出所驱动，这是上皮细胞脱层的一种常见机制⁴⁰–⁴²。这与此前提出的观点一致，即早期内化可能源于后部中胚层细胞早期发生的上皮—间充质转化（EMT）²⁹。因此，我们对正在进行原肠胚形成、瞬时表达荧光标记的组蛋白 H2A（用于标记 DNA）和细胞膜标记物（Gap43-mNeongreen）的赤拟谷盗胚胎进行活体成像，以评估单个细胞的动态变化（图 3A 和视频 S2）。尽管我们确实
观察到基底侧细胞挤出（图3B），但仅有5%的中胚层细胞表现出这一现象，因此，这不太可能解释我们观察到的相对较多的早期内化细胞（图2D）。然而，我们注意到，正在分裂的中胚层细胞的分裂轴并非总是像上皮单层细胞分裂时通常那样位于上皮平面内⁴³，而是有时垂直于上皮平面（图3C和S4A）。我们的活体成像分析显示，当中胚层细胞沿垂直于上皮平面的方向分裂时，位于基底侧的子细胞会离开上皮并提前内化（视频S2）。总体而言，我们发现，在赤拟谷盗（Tribolium）原肠胚形成过程中，25%的中胚层细胞分裂发生于上皮平面外，并导致其中一个子细胞提前内化（图3C）。综上，这些结果表明，赤拟谷盗中胚层细胞的早期内化主要由平面外分裂驱动，细胞挤出仅起较小作用。
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图3.
赤拟谷盗中胚层中的单个细胞内化由平面外分裂和细胞挤出介导。
（A）赤拟谷盗中胚层的共聚焦显微延时成像。胚胎中瞬时表达H2Av-mScarlet以标记细胞核（蓝色），并表达G43-mNG以标记质膜（灰度）。上：顶端视图（约4 µm厚的切向切片的平均投影）。下：穿过上方图像中部的横截面，通过对约4 µm范围内的图像取平均获得。比例尺，20 µm。
（B）赤拟谷盗中胚层的代表性延时图像，分别从顶端（上）和横截面（侧面）视角显示一个正在挤出的细胞。顶端视图突出显示了该细胞的变化
表面积，而截面视图则展示了细胞在关键时间点随时间变化的动态位置。零时刻对应于细胞挤出的时刻。比例尺，10 µm。
(C) 左：赤拟谷盗（Tribolium）中胚层的代表性延时图像，分别展示顶端视图（上）和截面视图（侧）。可见细胞发生平面内分裂（品红色）和平面外分裂（绿色）。零时刻对应于细胞分裂的时刻。比例尺，10 µm。右：堆叠图，量化了三个胚胎中的分裂类别。图中标出了平面外分裂占总分裂事件的百分比。
(D) 核密度（黑色）和细胞顶端面积（灰度）随时间的变化。曲线表示根据在 N = 3 个胚胎中追踪的细胞计算的平均值（追踪了 n = 170 个母细胞和 n = 235 个子细胞）；阴影区域表示标准差。
(E) 散点图，展示细胞化后100分钟内发生的平面内分裂（粉红色，n = 189 次事件）、平面外分裂（绿色，n = 61）及细胞挤出（橙色，n = 22）的发生时间。共分析了 N = 3 个胚胎。图中标出了 Mann–Whitney 检验的 p 值。
(F) 散点图，展示中胚层和外胚层中相对于胚胎表面的分裂角度随细胞化后时间的变化。数据点：胞质分裂后第一帧中，顶端表面与连接两个子细胞核的直线之间的夹角（θ）。在 N = 3 个胚胎中，外胚层有 N = 162 次分裂，中胚层有169次分裂。实线：平均分裂方向；阴影区域：均值标准误。
(G,H) 前部（紫色，n = 119 个母细胞，171
子细胞）以及胚胎后部区域（青绿色，n = 131 个母细胞，n = 197 个细胞）。共分析了 N = 3 个胚胎。线条：平均值；阴影区域：标准差。
(I) 平面内分裂（粉色，n = 189 次）、平面外分裂（绿色，n = 61 次）和细胞挤出（橙色，n = 22 次）沿前后轴定位的散点图，单位为 µm。共分析了 N = 3 个胚胎。图中标出了 Mann–Whitney 检验的 p 值。
赤拟谷盗原肠胚形成过程中的早期细胞内化事件主要发生在组织最拥挤的区域
随后，我们探究了赤拟谷盗中胚层发生平面外分裂的原因。其他系统中的既往研究表明，上皮组织拥挤是驱动细胞挤出和细胞分裂偏离上皮平面的主要因素⁴⁴–⁴⁶。赤拟谷盗中胚层正在发生顶端收缩和细胞增殖，这可能使组织逐渐变得更加拥挤。事实上，我们发现，在原肠胚形成过程中，中胚层的细胞核密度随时间增加，而细胞顶端面积减小，表明组织拥挤程度不断增加（图 3D）。平面外分裂和细胞挤出的平均发生时间均晚于平面内分裂（图 3E），与组织拥挤程度的增加相关。此外，在原肠胚形成过程中，中胚层纺锤体取向的变异性逐渐增大，并逐渐偏离平面内取向（图 3F）。总体而言，这些发现表明，中胚层组织拥挤程度的增加与平面外分裂和细胞挤出的逐渐增多相关。
赤拟谷盗胚胎后部的折叠发生得比前部更早，且程度更深²⁹（图 S4B 和 C），这促使我们比较这两个区域的组织拥挤程度和细胞内化频率。我们发现，
在整个原肠胚形成过程中，中胚层后半部的平均细胞顶端面积小于前半部，而细胞核密度则高于前半部（图3G、H）。有趣的是，平面外分裂和细胞挤出主要发生在中胚层后部区域（图3I）。
综上，这一组织层面的分析表明，在赤拟谷盗（Tribolium）原肠胚形成过程中，早期细胞内移事件的发生时间及其位于后部的空间位置，与细胞增殖过程中伴随顶端收缩而加剧的组织拥挤程度相关。
可解释机器学习分析表明，局部顶端面积减小和细胞核拥挤程度增加与平面外分裂相关
为进一步研究可能影响分裂方向的组织特性，我们采用机器学习方法，探究单细胞水平上局部组织环境与分裂方向之间的关系（图4A）。我们聚焦于顶端表面，在原肠胚形成期赤拟谷盗胚胎的活体成像视频中，量化了反映局部组织拥挤程度和整体细胞形状的多种特征（表S1）。为便于比较在不同时间分裂的细胞，我们对每个细胞的数据进行了时间对齐，将细胞胞质分裂前的最后一个时间点设为该细胞的t = 0（图4A）。由于视频的时间分辨率为4分钟，归一化后t = 0对应的图像帧可能捕捉到处于有丝分裂中期末至后期之间略有不同阶段的细胞。为减少这种不同步现象对分析的影响，我们在涵盖两个采集时间点的时间区间内对特征值取平均。由此生成了一个特征数据集，反映每个分裂细胞在分裂前30分钟内7个时间点的顶端几何形态和局部环境。
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图
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图4.
机器学习分析揭示赤拟谷盗（Tribolium）中胚层中细胞分裂方向的几何预测因子。
(A) 用于确定最能预测分裂方向的特征的可解释机器学习流程概述。在细胞分裂前的28分钟内对分裂细胞进行追踪。对于每个细胞，将细胞胞质分裂前的最后一个时间点定义为 t = 0。随时间提取描述每个分裂细胞顶端几何形态及局部组织环境的特征。采用按时间分箱的随机森林分类器，并利用SHAP值进行解释，以确定最能预测分裂方向的特征。比例尺，10 µm。
(B) 随机森林分类器根据几何特征和组织密度特征预测细胞分裂方向的性能。在细胞分裂前的28分钟内，将连续两个时间点的特征值划入同一时间箱。图中展示了各连续时间箱中预测平面内（ip，洋红色）和平面外（oop，绿色）分裂的F1分数（精确率与召回率的调和平均值）。
(C) 细胞分裂前12至8分钟这一时间箱内所测特征的SHAP值汇总图。各特征按其对预测的贡献排序，预测能力最强的特征位于顶部。每个点代表一次对平面内（洋红色）或平面外（绿色）分裂的预测。点在x轴上的位置表示该特征在多大程度上增加或降低预测为平面内或平面外分裂的可能性。负SHAP值表明该特征使预测倾向于平面内分裂，正值则使预测倾向于平面外分裂。
(D) 相对顶端面积（细胞顶端面积相对于相邻细胞平均顶端面积
在一个 20 µm 的窗口内）、平均细胞顶端面积和细胞核拥挤程度随时间的变化，分别对应于平面内分裂的细胞（粉色，n = 189）和平面外分裂的细胞（绿色，n = 61）。曲线表示根据 N = 3 个胚胎中追踪的细胞计算所得的平均值；阴影区域表示标准差。图中报告了对分裂前 16 至 8 min 期间取平均后的数据进行 Mann–Whitney 检验所得的 p 值。
随后，我们确定了哪些局部细胞特征与平面外分裂取向的关联最强。首先，我们利用数据集训练了一个随机森林分类器⁴⁷，以预测细胞将发生平面内分裂还是平面外分裂（图 4A，详情见方法）。通过评估多个时间点，我们能够追踪模型的预测能力在细胞分裂前不同阶段的变化。为评估模型性能，我们采用了 F1 分数⁴⁸；这一模型性能指标能够稳健地应对频繁发生的平面内分裂与罕见的平面外分裂之间的类别不平衡问题（见方法）。我们发现，尽管分类器在所有时间点对平面内分裂均具有良好的预测表现，但其对平面外分裂的预测能力逐渐增强，并在分裂前 −12 至 −8 min 的时间区间达到平台期（图 4B）。这一发现表明，从分裂前 12 min 起，我们所选的一组特征即可预测平面外分裂取向。
为确定哪些特征对分裂取向的预测能力最强，我们使用 Shapley 加性解释（SHAP）值分析了模型在分裂前 −12 至 −8 min 时的决策过程（图 4C）。SHAP 分析可量化每个特征对机器学习分类器某一具体预测的贡献程度⁴⁹˒⁵⁰。不同于仅反映某个特征的传统特征重要性评分，
对模型准确性的总体影响，SHAP 值描述了各特征的具体取值如何影响单次预测。这使我们不仅能够识别对模型性能影响最大的特征，还能够揭示各个特征的取值如何影响模型的具体预测。SHAP 分析表明，在 −12 至 −8 min 的时间窗口内，相对细胞面积、绝对细胞面积和细胞核拥挤程度是对模型性能影响最大的特征（图 4C 和 S5A）。具体而言，较小的细胞顶端面积——无论是绝对面积，还是相对于最近邻细胞的面积——以及较高的局部细胞核拥挤程度，是最能预测平面外分裂取向的特征。其他特征对区分平面内与平面外分裂的贡献较小，但其中一些仍反映了拥挤的某些方面（例如，较高的顶端密度也与平面外分裂相关；图 4C 和 S5A）。这一模式在 SHAP 依赖图中十分明显：绝对面积、相对面积和细胞核拥挤程度呈现显著的双峰分布，表明其取值对区分平面内与平面外分裂具有较强影响；而其他特征的分布则逐渐趋于平坦，表明其判别能力较低（图 S5A）。绘制预测能力最强的三个特征随时间变化的曲线后发现，在分裂前的整个 30 min 内，与发生平面内分裂的细胞相比，发生平面外分裂的细胞具有更小的绝对和相对顶端面积，并且其细胞核拥挤程度更高（图 4D）。相比之下，与拥挤不直接相关的特征，如实心度或偏心率，并未表现出一致的变化趋势（图 S5B）。
最后，我们探究了细胞挤出是否也与这些特征相关
与局部组织高度拥挤相关。细胞挤出事件发生频率较低（在3个胚胎中共观察到n = 22次），使我们无法有效应用基于机器学习的SHAP分析。然而，我们确实观察到，与发生平面外分裂的细胞类似，发生挤出的细胞相较于未发生挤出的中胚层细胞，顶端面积更小，细胞核拥挤程度更高（图S5C）。这表明，局部组织拥挤也可能驱动细胞挤出。综上，我们的系统性机器学习分析结合对描述细胞形态和局部环境的特征进行的动态分析，强烈表明，在赤拟谷盗（Tribolium）中胚层中，平面外分裂和细胞挤出均由局部组织拥挤驱动。
扰动实验表明，早期细胞内移由顶端收缩与细胞增殖共同促成
我们的结果显示，在发生顶端收缩的赤拟谷盗中胚层中，组织拥挤程度的增加与平面外分裂及细胞挤出事件密切相关。因此，我们探究了通过抑制中胚层命运指定来阻断顶端收缩，是否会减少这些早期内移事件的发生。我们通过RNAi敲低了Tc-twi，该基因是驱动中胚层命运指定及增强中胚层区域顶端收缩性的关键因子³⁰。我们证实，Tc-twi敲低（Tc-twi-KD）胚胎的腹侧组织未发生折叠（图5A及视频S3），且细胞未表现出顶端收缩（图5B）。Tc-twi-KD胚胎中的细胞仍然进行分裂，子细胞的平均顶端面积约为母细胞的一半（图5B）。然而，与对照胚胎相比，Tc-twi-KD胚胎的腹侧组织总面积减小幅度较小（
图 5C），这与顶端收缩被消除的情况一致。人工追踪显示，Tc-twi-KD 胚胎中未出现面外分裂或细胞挤出事件（视频 S3，N = 3 个胚胎）。这些观察结果支持以下假设：面外分裂和细胞挤出事件均是顶端收缩导致组织拥挤加剧的结果。
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图 5.
扰动实验表明，顶端收缩中的中胚层发生细胞增殖会导致面外分裂。
(A) 对照 Tribolium 胚胎（左）和注射 Tc-twi dsRNA 的胚胎（右）顶端表面的代表性延时成像（4∼µm 掠射切面的平均投影）。Tc-twi-KD 胚胎未显示顶端收缩。比例尺，40 µm。
(B) 对照胚胎（上）和 Tc-twi-KD 胚胎（下）腹侧区域细胞顶端面积随时间的变化，包括分裂前的细胞（母细胞）和分裂后的细胞（子细胞）。样本量：对照母细胞（n = 170）、对照子细胞（n = 235）、Tc-twi-KD 母细胞（n = 150）、Tc-twi-KD 子细胞（n = 222）；每种条件下 N = 3 个胚胎。由于有丝分裂圆化期间细胞面积会暂时增大，因此母细胞追踪数据中排除了分裂前 8 分钟的细胞面积。实线：均值；阴影区域：± 标准差。
(C) 对照胚胎和 Tc-twi-KD 胚胎中所有追踪细胞顶端面积总和随时间的标准化值，用作相对组织面积的替代指标。每个胚胎的顶端总面积均按其初始值进行标准化。虚线：各个胚胎（每种条件 n = 3）；粗线：均值。十字标记各个胚胎的沟裂形成时间。黑色圆圈表示对照组的平均内陷时间（121 min）。
(D) 代表性延时成像，显示
对照胚胎（左）与注射了 Tc-string dsRNA 的胚胎（右）的顶端表面（约 4 µm 掠射层面的平均投影）。Tc-string-KD 胚胎出现顶端收缩，并且比对照胚胎更早形成腹沟。比例尺，40 µm。
(E) 对照胚胎（上）和 Tc-string-KD 胚胎（下）中，细胞分裂前（母细胞）及分裂后（子细胞）的细胞顶端面积随时间的变化。样本量：对照母细胞（n = 170）、对照子细胞（n = 235）、Tc-string-KD 未分裂细胞（n = 99）；每种条件下 N = 3 个胚胎。细胞在有丝分裂圆化期间顶端面积会短暂增大，因此母细胞追踪数据中排除了分裂前 8 分钟的细胞面积。实线：均值；阴影区域：± 标准差。上方面板显示的数据与 B 图上方面板相同。
(F) 对照胚胎和 Tc-string-KD 胚胎中所有追踪细胞顶端面积总和随时间的归一化变化，用作组织相对面积的替代指标。每个胚胎的顶端面积总和均以其初始值归一化。虚线：各个胚胎（每种条件下 N = 3）；粗线：均值。十字标记各个胚胎的腹沟形成时间。黑色圆形和黑色方形分别表示对照胚胎（121 min）和 Tc-string-KD 胚胎（72 min）的平均内陷时间。对照组数据与 C 图相同。
(G) 一个具有代表性的果蝇 tribbles 突变体胚胎横切面，经 DAPI 染色标记 DNA（洋红色），并经鬼笔环肽染色标记细胞轮廓（灰度）。箭头 1、2 和 3 指示三个相邻中胚层细胞中处于不同分裂阶段的细胞，显示分裂方向偏离成像平面。比例尺，20 µm。
(H) 对照组和果蝇 tribbles 胚胎在连续两个
中胚层内陷的不同阶段。胚胎经鬼笔环肽染色（图中显示反转对比度）。与对照组相比，
tribbles
胚胎的内陷沟形成延迟，且较早出现内化细胞。比例尺，40 µm。
由于降低顶端收缩和组织拥挤程度会消除细胞内化事件，我们进一步探究：阻断细胞分裂以降低组织拥挤程度，是否会产生相同效果。因此，我们通过敲低
Cdc25
在赤拟谷盗中的同源基因（
Tc-string
；
string
在
Drosophila
中的对应基因），阻断细胞分裂。已有研究表明，这种磷酸酶是
Drosophila
囊胚后期进入有丝分裂所必需的
51
–
53
。我们优化了注射双链 RNA 的时间，以靶向原肠胚形成期间发生的细胞分裂，同时不干扰此前的细胞分裂轮次（见方法）。尽管
Tc-string
敲低（KD）胚胎的中胚层细胞不发生任何分裂，但仍表现出顶端收缩（
Fig. 5D,E
）；此外，我们未观察到
Tc-string
敲低胚胎中胚层发生细胞挤出（Video S4）。值得注意的是，我们进一步观察到，与对照组相比，
Tc-string-KD
胚胎的腹侧内陷沟形成提前了约50 min（
Fig. 5F
）。综合这些扰动实验结果可知，
Tribolium
中胚层通过面外分裂或挤出发生的早期细胞内化，是由顶端收缩和细胞分裂共同导致的组织拥挤所引起的。此外，阻断细胞分裂显著加快了
Tribolium
的原肠胚形成进程。
Drosophila tribbles
突变体中胚层过早进入有丝分裂导致面外分裂
鉴于细胞分裂会影响
Tribolium
中细胞内化的时间，我们决定研究细胞分裂对
Drosophila
中胚层的影响；该中胚层会发生顶端收缩。
但通常不显示细胞分裂
34
,
36
。在
Drosophila
中，原肠胚形成期间腹侧细胞的分裂受到
tribbles
的抑制；tribbles
可促进 String 降解
35
。与此一致，在
Tribolium
中，
Tc-tribbles
的表达局限于胚外浆膜，而该处不发生细胞分裂（
Fig. S6A
）。因此，我们分析了
Drosophila tribbles
突变胚胎中的细胞行为。这类胚胎的中胚层会发生过早的细胞分裂，从而扰乱顶端收缩和腹沟形成
54
。正如我们根据
Tribolium
中的观察所推测的，在
Drosophila
中，中胚层内陷期间的有丝分裂导致中胚层细胞发生面外分裂（
Fig. 5G
）。此外，与对照胚胎相比，
tribbles
胚胎形成腹沟的时间更晚（
Fig. 5H
、
Fig. S6B
），这与
Tribolium
野生型胚胎相较于
Tc-string-KD
胚胎的中胚层内陷延迟相呼应。综上，这些观察结果表明，原肠胚形成期间的细胞分裂会阻碍组织内陷，而面外分裂可能代表了细胞应对这一力学挑战的一种保守反应（
Fig. 6
）。
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图 6.
中胚层内陷期间的不同细胞行为。
昆虫原肠胚形成过程中促成组织内化的不同细胞行为示意图。在
Drosophila
和
Tribolium
中，中胚层的命运指定会导致中胚层细胞发生顶端收缩；单凭这一过程即可驱动组织折叠（左）。当顶端收缩与细胞增殖同时发生时，组织折叠会延迟，而面外分裂则促使细胞提前内化（中）。若只有细胞增殖而没有顶端收缩，则不会发生面外分裂（右），这表明顶端收缩有助于组织】【。
拥挤导致面外分裂。
讨论
通过将细胞形状嵌入一个共同的低维空间，形态空间为比较不同条件及不同物种间的形态发生行为提供了定量框架。例如，在果蝇中识别出的中胚层形态空间轨迹（图 1C、E），为评估扰动如何影响原肠胚形成期间的细胞形状动态提供了定量参照。更一般地说，形态空间分析能够量化细胞形状动态及其变异，并识别罕见或偏离常态的形态行为。我们在此利用形态空间分析发现，尽管组织尺度的内化过程相似，赤拟谷盗与果蝇的中胚层细胞却沿着显著不同的细胞形状轨迹变化（图 1）。聚焦于形态空间中形状变异最大的时间点，我们发现，部分赤拟谷盗中胚层细胞在组织折叠之前，先通过面外分裂发生内化；细胞挤出也有一定贡献，但程度较小（图 2、3）。
动物界各类群中均可观察到原肠胚形成期间的细胞分裂，但面外分裂导致一个子细胞离开上皮的实例十分罕见。在若干甲壳类动物^55–57以及头索动物文昌鱼^58中，细胞分裂有助于原肠胚形成期间上皮平面的折叠，但两个子细胞均留在上皮内。在小鼠原条中，有研究提出，非顶端有丝分裂可能促进 EMT 驱动的细胞脱离^59,60；但在这种情况下，两个子细胞最初也都留在上皮内。相比之下，类似于我们在赤拟谷盗中观察到的面外分裂，已有研究报道其发生于若干刺胞动物物种的原肠胚形成期间^61–65。除了
据我们所知，在刺胞动物中，尚无研究报道面外细胞分裂会直接驱动中胚层内化。
相比之下，许多动物会抑制中胚层/内胚层在原肠胚形成过程中的细胞分裂，或对其进行精细调控⁶⁶–⁶⁸,¹²,⁶⁹。例如，在蛙类非洲爪蟾（*Xenopus laevis*）中，部分细胞的分裂受到抑制，而另一些细胞则必须分裂，原肠胚形成才能继续进行⁷⁰。研究者在果蝇（*Drosophila*）中探讨了原肠胚形成期间不适当细胞分裂的后果：在 *tribbles* 突变体中，有丝分裂导致的细胞变圆会削弱顶端 RhoA 介导的肌球蛋白收缩性，从而拮抗腹沟形成期间的顶端收缩，并破坏组织协同收缩⁵⁴。与此一致，我们的数据表明，阻止赤拟谷盗（*Tribolium*）中胚层的细胞分裂会加速组织折叠，而诱导果蝇中胚层发生细胞分裂则会延缓折叠（图 5A–F）。综合来看，这些观察结果提示，在这些胚胎的上皮组织折叠过程中，细胞增殖与顶端收缩性相互拮抗（图 6）。我们的研究提示，在中胚层诱导 *tribbles* 表达以抑制细胞分裂、进而加速原肠胚形成，可能是果蝇演化出快速胚胎发育这一特征的关键一步⁷¹–⁷³。
我们借助机器学习进行的分析显示，面外细胞分裂与局部组织拥挤程度升高存在特异性关联。此外，在顶端收缩被消除时，所有细胞均在上皮平面内分裂，这表明顶端收缩是组织拥挤的驱动因素。研究表明，拥挤会诱导哺乳动物皮肤中的细胞发生面外分裂：细胞会先在平面内分裂，直至达到某一密度阈值，随后重新定向。
垂直于上皮排列的有丝分裂纺锤体
45
。上皮培养实验进一步表明，压迫上皮单层可促使细胞重新定向纺锤体，使其垂直于上皮平面
46
。未来值得探究在
Tribolium
中胚层发生面外分裂时，哪些分子机制会导致纺锤体重新定向。
近期有研究提出，面外分裂可能为
Drosophila
及其他双翅目昆虫头部区域缓冲机械压缩力提供一种机制
74
,
75
。我们推测，面外分裂在
Tribolium
中胚层以及
Drosophila tribbles
突变体的中胚层中可能发挥类似作用：当顶端收缩与细胞增殖共同作用导致组织拥挤时，面外分裂或可缓解组织压力的积聚。这提示，在收缩组织中进行面外分裂，可能是应对原肠胚形成期间机械约束的一种保守性反应
76
,
77
。除
Tribolium
外，许多昆虫在原肠胚形成期间也有细胞增殖的报道
78
–
82
，但是否存在因拥挤诱发的面外分裂，仍有待进一步研究。当前亟需对不同物种中增殖、顶端收缩与分裂方向之间的关系开展定量研究，以揭示驱动原肠胚形成的细胞行为背后的进化起源与力学原理。
资源可用性
主要联系人
本研究中生成的所有质粒均可向主要联系人 Ewa K. Paluch（ekp25{at}cam.ac.uk）索取。本研究期间生成的数据集将在论文发表前存入 BioImage Archive，所有定制分析代码则……
可向通讯作者索取。
作者贡献
M.B.、E.K.P. 和 M.A.B. 设计了本研究。M.B. 和 M.A.B. 完成了实验。M.B. 负责数据分析、计算流程开发、图表制作，并撰写了论文初稿。W.P. 开发了形态空间分析框架，并参与数据分析。E.K.P. 和 M.A.B. 监督了研究工作，参与实验设计和结果解读。M.B.、M.A.B. 和 E.K.P. 撰写了论文。所有作者均参与讨论研究结果。
方法
动物饲养
俄勒冈品系的 *Drosophila melanogaster*（黑腹果蝇）在 25°C 下饲养于标准配方培养基中，每 2–3 周转移一次。按照标准流程收集虫卵：将果蝇置于圆柱形塑料笼中，笼子一端设有网罩以确保空气流通，另一端装有可拆卸的苹果琼脂平板。平板上涂有酵母膏，以刺激产卵。携带功能缺失型 *tribbles* EP11¹⁹ 等位基因³⁵的果蝇由 Bénédicte Sanson 惠赠。该品系与带有 *hunchback-lacZ* 标记的 TM3 平衡子（BDSC:78357）平衡，因此，在针对 *lacZ* 转录本进行染色时，可通过信号缺失识别纯合 *tribbles*⁻/⁻ 个体。
*Tribolium castaneum*（赤拟谷盗）在 30°C 下饲养于塑料盒中，盒盖设有网罩窗口以确保适当的空气流通。赤拟谷盗以粗面粉为食，饲料由 1 kg 有机全麦面粉（Prior’s Flour，英国）、约 50 g 干酵母粉（Sainsbury’s 超市）和 1 g Fumagilin-B（Medivet #12415）混合制成。混合前，所有饲料成分均通过 700 μm 钢筛（Retsch 测试筛，200 mm × 50 mm）筛滤，以去除较大颗粒。饲料……
每1–2周更换一次。每月收集一次过夜产下的卵，并在30°C下培养一个月，以获得下一代甲虫。收集卵时，使用800 μm钢筛（Retsch试验筛，200 mm × 50 mm）将甲虫从粗面粉混合物中分离出来，再转移至Prior’s Flour有机白面粉中；该面粉此前已用300 μm钢筛（Retsch试验筛，200 mm × 50 mm）筛过。随后使用300 μm钢筛从白面粉中收集卵。培养箱的相对湿度维持在40–60%。关于赤拟谷盗饲养的更多详细信息，请参阅《The Beetle Book》^83。
据我们所知，尚无研究报告胚胎性别会影响原肠胚形成。因此，本研究未记录胚胎性别。
胚胎去卵壳与固定
让果蝇连续以20分钟为间隔产卵。在特定时间点，即产卵后180、200、220和240分钟，对胚胎进行固定。固定前，按照标准操作流程^84，将胚胎置于小型网篮中（网孔孔径为250 μm），用漂白液（Thermo Scientific Chemicals 10527752）处理3分钟；漂白液以双蒸水稀释，使次氯酸盐终浓度达到2.5%。随后用装有双蒸水的挤压瓶多次冲洗胚胎，以去除残留漂白液。将网篮置于纸巾上吸去大部分水分，再用细毛笔将沉于网篮底部的胚胎转移至装有庚烷的试管中。将胚胎置于摇床上，在室温下用37%多聚甲醛与庚烷按1:1配制的溶液固定5分钟。根据胚胎数量，我们采用以下方式进行固定：
置于 1.5 ml 塑料 Eppendorf 管或 5 ml 玻璃样品瓶中。随后用 1× PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄）清洗胚胎两次，以去除固定液。弃去 PBS，换入新鲜庚烷。通常在此阶段使用甲醇（MeOH）去除包裹胚胎的卵黄膜，使抗体及其他染色分子能够进入胚胎组织。然而，甲醇会破坏鬼笔环肽识别的表位。因此，为了进行鬼笔环肽染色，我们采用了一种无需使用甲醇即可去除卵黄膜的方法⁸⁴。将置于新鲜庚烷中的胚胎吸入玻璃移液管中；用镊子剪去移液管颈部，并将切口打磨成直径为 2–3 mm 的开口。随后将胚胎滴在圆形 Whatman 3 号滤纸（Camlab #1003-070）的中央。让滤纸上的庚烷挥发不足 30 秒；胚胎干燥时间过长可能会损伤样品。将滤纸轻轻放入 100 mm 培养皿中，使附着胚胎的一面朝下，从而将胚胎转移至培养皿底部的双面胶带上。立即用 PBS 覆盖胚胎，并手动去除卵黄膜。具体操作如下：剪取一段长 3–4 cm、直径 0.375 mm 的钨丝（Thermo Fisher #043995.H1），在火焰上加热，并在亚硝酸钠磨刀棒（McCRONE #107-SK）上敲击使其磨尖。将磨尖的钨丝段插入一根 0.8 mm 针头（Terumo Agani #8AN2150R1）中；随后用火焰熔化塑料，并迅速将熔化的 P1000 移液器吸头与钨丝连接并粘合。然后使用该工具小心地刺破已固定胚胎的卵黄膜。
剥离胚胎。解剖约 200 个胚胎后，使用 200 μm 移液器将其转移至装有新鲜 PBS 的离心管中。移液器吸头为塑料吸头，并在使用前用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）快速润洗，以防胚胎黏附在塑料表面。用剃刀片切开吸头，使其开口达到 2–3 mm。
由于赤拟谷盗（Tribolium）的发育时间平均约为果蝇（Drosophila）的三倍，因此将甲虫置于 30°C 下产卵 1 小时。随后筛除甲虫，并将含卵的白面粉置于 25°C 下培养 18、20、22、24、26 或 28 小时。收集的胚胎首先置于小型网篮中（网孔直径为 250 μm），并用 II 型水反复冲洗，以去除残留面粉。具体操作为：将装有胚胎的网篮放入盛有水的 50 mm 培养皿中冲洗 30 秒；期间用塑料 3 ml 移液器从网篮外吸取液体，再将其喷洒到网篮上。
随后，将网篮移至盛有次氯酸钠的培养皿中。次氯酸钠（有效氯含量为 6–14%，Merk #7681-52-9）用水稀释至最终浓度为 2.5–5%。使用塑料 3 ml 移液器冲洗胚胎 3 分钟，以去除胚胎外壳。之后，将胚胎依次转移至 6 个装有水的培养皿中，充分冲洗。最后，用细毛刷将去壳胚胎从网篮转移至装有庚烷的新鲜 1.5 mL 离心管中。去壳胚胎会漂浮在水中，因此可轻易与未去壳胚胎分离。胚胎随后按上述方法进行固定和去卵黄膜处理。
针对果蝇的操作流程，但固定时间有所不同：赤拟谷盗胚胎固定 7.5 分钟，而非 5 分钟。在最脆弱的囊胚期，有时需要将固定时间延长至 10 分钟。
胚胎染色
为观察果蝇胚胎中的 RNA 转录本，我们使用 Molecular Instruments 制备的探针和发卡探针，按照全胚原位果蝇胚胎方案（https://files.molecularinstruments.com/MI-Protocol-HCRv3-FruitFly-Rev6…），进行原位杂交链式反应（HCR）v3.0⁸⁵。根据已发表的文献⁸⁶对方案进行了修改：固定后的胚胎在染色前不使用乙醇、二甲苯或蛋白酶 K 处理；此外，为降低黏度并使胚胎更容易沉降至管底，将探针杂交液和扩增储备缓冲液中硫酸葡聚糖的浓度从 10%（质量/体积，w/v）降至 5%（w/v）。另外，将探针杂交液、扩增液和洗涤液进一步用水稀释至 40%，以便进行鬼笔环肽染色。用于制备 HCR 探针的 mRNA 序列由以下 FlyBase 基因及异构体 ID 标识：snail（异构体 sna-RA）为 FBtr0080739，twist（异构体 twi-RB）为 FBtr0100130。为检测 lacZ 转录本，我们针对序列 NCBI: NC_000913.3: c366305-363231 设计了探针。按照 Molecular Instruments 的建议，每个靶基因订购了 20 对短探针。HCR 结束后，将胚胎在室温下用 1 ng/μl DAPI（ThermoFisher Scientific）和 5 ng/μl DyLight650 鬼笔环肽（Cell Signaling T567）孵育 1 小时，以标记细胞核和丝状肌动蛋白。随后用 5× SSC + 0.1% Triton X-100（5× SSCT）洗涤胚胎 3 次。对胚胎进行成像。
染色后应尽快进行后续处理，因为鬼笔环肽信号会在一周内显著衰减。
赤拟谷盗胚胎的 HCR 染色按照上述果蝇的相同流程进行，但在杂交步骤中将 HCR 探针和发卡探针的浓度加倍，以增强信号（终浓度：4 nM/mL）^87。用于制备针对中胚层基因转录本的 HCR 探针的 mRNA 序列，可在 iBeetle 数据库（https://ibeetle-base.uni-goettingen.de/）中通过以下基因标识符查询：Tc-sna 为 TC032125，Tc-twi 为 TC014598，Tc-tribbles 为 TC033074，Tc-string 为 TC001885。HCR 后的 DAPI 和鬼笔环肽染色按上述方法进行。
在赤拟谷盗中进行微管蛋白抗体染色时，先将固定后的胚胎置于封闭液（1× PBT 中含 5% 正常山羊血清和 0.1% BSA）中，在室温下轻柔振荡孵育 30 分钟；振荡使用连接至旋转混匀器的样品架进行。随后，将胚胎与小鼠单克隆抗乙酰化 α-微管蛋白一抗（Sigma #T6793）按 1:100 稀释后孵育，并在 4°C 下轻柔振荡过夜。接着，将装有胚胎的试管横置于旋转混匀器上，在室温下用 1× PBT 和 0.1% Triton X-100 洗涤 4 次，每次 15 分钟。之后，在室温下用封闭液孵育 30 分钟。随后，将胚胎与按 1:200 稀释的山羊抗兔 Alexa Fluor 555 二抗（Invitrogen #A-21429）在室温下孵育 2 小时；该抗体以 1:1 的比例与 100% 甘油混合，用于储存。之后，在室温下用 1× PBT 洗涤 4 次，每次 15 分钟，最后再洗涤 30 分钟；整个过程中均保持振荡。
HCR 后的 DAPI 和鬼笔环肽染色按上述方法进行。
在每次实验中，胚胎均采用 Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555 和/或 Alexa Fluor 594 的组合进行转录本或抗体染色。
固定样本的图像采集
染色后立即将胚胎置于玻璃显微镜载玻片（Thermo Scientific）上，并使用 1.5 号盖玻片（Corning #2850-22），以 SlowFade Diamond 抗淬灭封片剂（ThermoFisher #S36972）封片。对于果蝇胚胎，还将 1.5 号盖玻片切割后用作垫片，以防胚胎被压扁。赤拟谷盗胚胎的封片方法为：在盖玻片的四角放置少量 Plasticine，用镊子轻轻下压，直至样本与盖玻片接触。沿盖玻片边缘涂刷透明指甲油，以密封载玻片边缘。
显微成像在剑桥大学动物学系成像设施使用 Olympus FV3000 共聚焦显微镜完成，配备 Olympus UPlanSApo 30×、数值孔径（NA）为 1.05 的硅油浸物镜；物理像素尺寸为 0.23 μm × 0.23 μm，Z 轴堆栈步长为 0.79 μm。采集图像为 12 位，扫描格式为 1024 × 768，像素驻留时间为 2 μs。切片数量根据样本厚度而变化。为获取用于提取三维细胞形态的图像，果蝇胚胎的摆放方向经过调整，以采集头褶后方不远处的中胚层组织；赤拟谷盗胚胎则根据 Tc-eve 信号调整摆放方向，以采集前三个副体节（Patel et al. 1994）。所有成像通道均按顺序采集，以尽量减少串扰。激光线及采集窗口如下：DAPI 使用 405 nm 激光和 443–472 nm 窗口；Alexa Fluor 488 使用 488 nm 激光和 500–536 nm 窗口；561
用于 Alexa Fluor 546 和 Alexa Fluor 555 的 566–584 nm 激发窗口；用于 Alexa Fluor 594 的 594 nm 激光和 610–631 nm 检测窗口；用于 DyLight650 的 640 nm 激光和 663–713 nm 检测窗口。
用于赤拟谷盗显微注射的 mRNA 模板设计
为在赤拟谷盗活体成像实验中观察细胞膜和细胞核，我们设计了两种荧光报告分子，编码可定位于细胞膜或细胞核的信号肽，并与荧光蛋白连接。细胞质膜采用与 GAP43 的 N 端棕榈酰化序列融合的荧光蛋白进行标记，该序列可引导蛋白定位至细胞质膜。GAP43 是一种定位于细胞质膜内侧的小蛋白，已成功用作赤拟谷盗的膜标记物⁶⁻⁸。为标记细胞核，我们通过使用 blastn 套件（美国国立卫生研究院，NIH）将果蝇 H2Av 序列与赤拟谷盗基因组进行比对，鉴定出赤拟谷盗变异型组蛋白 H2A（H2Av）序列。随后，我们将这些标记物分别与亮度高、折叠速度快的荧光蛋白融合：用于 Gap43 的黄绿色荧光蛋白 mNeonGreen⁹，以及用于 H2Av 的红色荧光蛋白 mScarlet-I¹⁰。为提高标记物的翻译效率，我们在信号肽上游加入了合成的富含 AT 的 21 bp 序列（Syn21），以促进翻译起始¹¹˒¹²。在荧光报告序列下游，我们加入了高效的杆状病毒 p10 多聚腺苷酸化（polyA）信号¹²˒¹³。荧光构建体由 Genescript（英国）合成并插入 pUC57 载体；合成前已针对昆虫进行了密码子优化。收到质粒后，按照标准方案将其转化至 DH5α 感受态细胞（Zymo Research，T3009），并使用 Monarch 质粒小量提取试剂盒（#T1010S）进行小量提取。
获得的质粒命名为 pUC57[G43-mNeonGreen] 和 pUC57[Tc-H2Av-mScarlet-I]，可按要求提供。
加帽单链 RNA 的合成
为在活体成像中对赤拟谷盗（*Tribolium*）胚胎的细胞膜、细胞核或非肌肉肌球蛋白 II 进行瞬时标记，我们以三种 DNA 质粒为模板合成了加帽 mRNA：用于标记细胞膜的 pUC57[G43-mNeonGreen]（见上文）、用于标记细胞核的 pUC57[Tc-H2Av-mScarlet-I]（见上文），以及用于通过绿色荧光蛋白标记非肌肉肌球蛋白 II 调节链的 pCS2+[Tc-sqh-GFP]（由 Pavel Tomancak 惠赠）¹⁴。
使用带有 5′端延伸序列的引物扩增质粒中的构建体；该延伸序列包含 SP6 RNA 聚合酶基因核心启动子序列（ATTTAGGTGACACTATAG）¹⁵。PCR 反应采用 Phusion 高保真系统（New England Biolabs，#E0553L）或 Q5 高保真 DNA 聚合酶（New England Biolabs，#M0491）进行。
使用 Monarch Spin 基因组 DNA 提取试剂盒（New England Biolabs，#T3010S）纯化由这些质粒扩增得到的扩增产物。随后对其进行沉淀，并重悬于无核酸酶水中，使浓度达到约 100 ng/μl。之后按照制造商说明，使用 SP6 mMESSAGE mMACHINE 试剂盒（Invitrogen，#AM1340）以纯化后的 DNA 扩增产物为模板合成加帽 mRNA。经 TURBO-DNase 消化后，采用酚／氯仿和氯仿抽提纯化 RNA，随后加入等体积异丙醇进行沉淀。RNA 保存于异丙醇中，置于 −20°C。注射前，将 RNA 在 4°C、13,000 rpm 条件下离心 20 分钟，收集后重悬于 5 μl 无核酸酶水中。使用 Nanodrop 分光光度计测定 RNA 浓度。
双链 RNA 的合成
基因敲低
使用 TRIzol 试剂（Invitrogen #15596-026）从胚龄为 0–72 小时的胚胎中提取 cDNA，并使用 Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒（Invitrogen #18080-051）合成 cDNA。使用以下引物从提取的 cDNA 中扩增 *Tc-twi* 基因（TC014598）和 *Tc-string* 基因（TC001885）的序列：*Tc-twi*-F GCTGATGGACCTGACCAACT，*Tc-twi*-R GCTTGAATTTCGGTGGAAAA；*Tc-string*-F TTTCCGATATTGAGCCCTTG，*Tc-string*-R TCCAGGTTTTGGATTTGAGC。将 PCR 产物连接至质粒 pGEM-T Easy（Promega #A1360）或 pCR4-TOPO（ThermoFisher #K450030）中，分别构建得到 *pGEM[Tc-twi]* 和 *pCR4[Tc-string]*。
使用带有 T7 接头的 M13 引物，从 *pGEM[Tc-twi]* 和 *pCR4[Tc-string]* 扩增 DNA：M13-18mer-F TGTAAAACGACGGCCAGT，M13-T7-R GGGTAATACGACTCACTATAGGGCAGGAAACAGCTATGACC。使用 Monarch Spin gDNA Extraction 试剂盒纯化 PCR 产物，并稀释至 1 µg/µl。按照制造商说明，使用 MEGAscript T7 Transcription Kit（Invitrogen #AM1334）合成双链 RNA（dsRNA）。反应在 37°C 下总共孵育 4 小时。随后将 RNA 混合物置于 75°C 下孵育 5 分钟，然后在实验台上自然冷却至室温，使 RNA 退火并形成双链 RNA。之后进行酚-氯仿抽提。加入试剂盒中的 0.1 倍体积 Ammonium Acetate STOP Solution 和 2.5 倍体积 99.5% 变性乙醇（APC Pure #GWN9065-E）后，将样品于 −20°C 下保存过夜。次日，在 4°C 下以最高转速离心 30 分钟。移除上清液后，加入 1 mL 新鲜的冰冷 70% 乙醇溶液。再次以最高转速离心后，】【。
30分钟。弃去液体，将沉淀在空气中干燥10分钟。最后，将RNA沉淀重悬于20 µL水中。
赤拟谷盗胚胎显微注射
胚胎显微注射按照已发表的方法进行
5
。将成虫置于过筛的有机普通面粉（Prior’s Flour）中，在32°C下产卵1小时。随后将成虫从面粉中过筛除去，并使胚胎继续发育至少1小时。按照上述固定胚胎收集方法对卵进行去卵壳处理，但为减轻处理强度，使用了浓度较低的漂白液（次氯酸盐浓度为0.5%）。胚胎在漂白液中清洗两轮，每轮30秒，两轮之间在ddH
2
O中暂停30秒。使用玻璃移液管将去卵壳胚胎转移至50×22 mm盖玻片上的一滴水中；该移液管的颈部用镊子剪开并打磨，使其形成直径为2–3 mm的开口。盖玻片通过少量橡皮泥固定在载玻片上。
使用单股画笔，或将眉毛粘附在玻璃移液管上制成的工具（使用蓝丁胶固定），将胚胎排列在盖玻片上，使胚胎前端朝外。为避免窒息，胚胎之间保持间隔，彼此不相接触。排列好约50个胚胎且水分蒸发后，在其上覆盖卤代烃油混合物；该混合物由50%的Halocarbon oil 700（Sigma Aldrich，货号H8898-100ML）和50%的Halocarbon 27（Sigma Aldrich，货号H8773-100ML）组成。
显微注射针使用针具拉制仪（Sutter Instrument P-87）制备，所用材料为硼硅酸盐玻璃毛细管，其外径为1 mm、内径为0.58 mm，并带有内部 filament（Warner Instruments G100F-4）。针尖以30°角进行磨斜处理，使用一支、】【
微电极斜面磨针仪（Sutter Instrument BV-10）。随后使用 MicroloaderTM 枪头（Eppendorf 5242956003）装载针具，并将针插入胚胎前极，以避免损伤胚胎本体。
注射使用 Femtojet 微量注射器（Eppendorf 4i）进行，氮气加压。通过脚踏开关控制注射时长。为确保注射体积一致，以卵细胞质外流程度作为指示指标。
微注射实验使用由 pUC57[G43-mNeonGreen]、pUC57[Tc-H2Av-mScarlet-I] 和 pCS2+[Tc-sqh-GFP] 合成的加帽 mRNA，以及由 pGEM[Tc-twi] 和 pCR4[Tc-string] 合成的 dsRNA。注射使用以下四种不同的 mRNA 和 dsRNA 混合液：
sqh-GFP 条件：2 µg/µL Tc-sqh-GFP + 1 µg/µL Tc-H2Av-mScarlet-I，以 ddH₂O 配制（总浓度 3 µg/µL）
对照条件：2 µg/µL G43-mNeonGreen + 1 µg/µL Tc-H2Av-mScarlet-I，以 ddH₂O 配制（总浓度 3 µg/µL）
Tc-twi-KD 条件：2 µg/µL 靶向 Tc-twi 的 dsRNA + 1 µg/µL G43-mNeonGreen，以 ddH₂O 配制（总浓度 3 µg/µL）
Tc-string-KD 条件：2 µg/µL 靶向 Tc-string 的 dsRNA + 1 µg/µL G43-mNeonGreen，以 ddH₂O 配制（总浓度 3 µg/µL）
每种混合液均在注射前现配并离心，以确保均一性并防止微注射针堵塞。除 Tc-string-KD 条件外，所有条件下的胚胎均在产卵后 2–3 小时注入 RNA 混合液；Tc-string-KD 条件下，胚胎在产卵后 6 小时注射，以避免干扰此前的细胞分裂周期。
注射后，将盖玻片翻转至 Lumox 组织培养皿（Sarstedt #94.6077.305）的透氧膜上，操作如前所述⁸⁸。盖玻片与培养皿等宽，因此……
其可置于膜周围的短塑料边缘上，以避免挤压胚胎。根据需要加入混合油，以填满盖玻片与 Lumox 膜之间的空间，并避免对胚胎产生过大压力。注射后，将胚胎置于 30°C 的湿润环境中保存；该环境通过在带盖塑料容器内放入潮湿的纸巾制成。随后将 Lumox 培养板直接移至显微镜下进行成像。
赤拟谷盗胚胎活体成像
活体成像在欧洲分子生物学实验室（EMBL，海德堡）的先进光学显微镜设施中进行。使用 Leica Stellaris 8 显微镜对胚胎成像，并将温控罩设定为 32°C。采用 HC PL APO CS2 20×/0.75 多介质物镜采集 15 或 18 个焦平面的图像堆栈（z 轴步长为 2 μm）。注射了 Tc-sqh-GFP 和 Tc-H2Av-mScarlet-I mRNA 混合物的胚胎每 10 分钟成像一次。其他所有条件下的胚胎均每 4 分钟成像一次。采集的图像为 8 位，物理像素尺寸为 0.29 μm × 0.29 μm，扫描格式为 512 × 1024，像素驻留时间为 1.5 μs。图像尺寸为 195.45 × 107.67 µm，Z 轴堆栈步长为 1 μm。使用厂商软件中的 Smart Setup 工具设定采集窗口。两个通道同时采集。绿光通道使用陷波滤光片，以去除卵黄膜造成的自发荧光。
由于无法确定囊胚胚胎的背腹方向，因此每次成像均同时采集至少 10 个胚胎。仅对腹侧朝向、且中线位于图像高度中央的胚胎进行后续分析；符合这些条件的时间序列中，平均约每 10 个有 1 个。
图像处理与三维分割
用于中胚层分析的……
在固定胚胎中，基于 (Tc-)twi 和 (Tc-)sna 的 HCR 染色确定中胚层区域。对于果蝇，使用 Fiji 分析 HCR 图像⁸⁹。首先，对 (Tc-)twi 通道（标记中胚层）应用中值滤波器（r = 2）。随后将图像转换为 8 位图像，并使用 Otsu 方法自动进行阈值分割。由此生成的掩膜标示了图像中含有中胚层细胞的区域。接着，使用 Fiji 中 Image Calculator 菜单的“AND”功能，将该掩膜应用于 DAPI 通道，以提取中胚层细胞核信号。对于赤拟谷盗，信号的均一性不足，无法自动提取中胚层掩膜。因此，我们根据中胚层及前后轴基因的 HCR 信号手动选取该区域。
随后使用机器学习框架 Cellpose 2.0⁹⁰ 对中胚层细胞核进行三维分割，并在 Python 3.8.12⁹¹ 中运行。对于每幅图像，软件会自动校准细胞核大小，并使用 cytoplasm 2.0 模型进行细胞核分割；在我们的数据集中，该模型的效果优于细胞核专用模型。其他参数均保持默认值。在 Cellpose 图形用户界面中手动删除分割错误的掩膜。随后将中胚层细胞核掩膜载入 Fiji，提取每个掩膜的质心坐标。坐标使用 MorphoLibJ 插件⁹²中的 3D Centroid 功能计算。
为对中胚层细胞进行三维分割，我们使用 Fiji 中的 LimeSeg 插件⁸⁹。以细胞核质心作为种子，对由鬼笔环肽信号标记的细胞轮廓进行分割。为此，我们使用了由剑桥大学的 Erik Clark 提供的脚本，该脚本是脚本 DemoVescicleSegmentation.groovy 的修改版本（
该脚本读取包含细胞核质心坐标的文本文件，并在鬼笔环肽通道中以细胞核质心为中心添加球形 ROI。随后，脚本启动 LimeSeg 球形分割功能。该算法使球形种子同时生长，其动力学受脂质膜行为启发，直至到达局部强度峰值。参数设置如下：d_0 = 3.5，f_pressure = 0.015，z_scale = 3.376，range_in_d0_units = 1.5。优化过程在 10 分钟后停止，此时掩膜已充分收敛。为验证分割准确性，采用 Wolfram Pönisch 博士编写的自定义 MATLAB 脚本（版本 R2022b–R2024a）将三角网格转换为掩膜。随后，在 Fiji 中将 3D 细胞掩膜通道与相应的鬼笔环肽通道合并。使用 MorphoLibJ 中 Label Edition 插件的图形界面，剔除错误掩膜（主要包括超出胚胎表面并填满图像背景的掩膜）。该流程最终生成包含准确分割细胞掩膜 .ply 文件的目录。
基于球谐函数和降维算法的 3D 细胞形态分析
随后，按照先前描述的框架
32
，对 .ply 文件中的点云进行球谐分解和降维。简言之，将细胞分割得到的点云进行三角剖分（使用 MATLAB 函数 MyRobustCrust.m，见
https://github.com/markeroon/matlab-computer-vision-routines/blob/maste…
），从而将 3D 形状表示为
表示为一组表面点（称为顶点），这些顶点由边连接并构成三角形（称为面）。随后，移除存在孔洞、代表分割不完整的表面。接着，按细胞的最长轴对细胞进行对齐，具体如下。对齐时，我们计算居中细胞体积的（体积）协方差矩阵，并将其特征向量定义为新的坐标轴。选择细胞对齐的初始方向，使得新 x 轴上的三阶矩 ⟨x³⟩ 为正。中间轴的方向则选择为 ⟨x²y⟩ > 0。对齐后，使用 MATLAB 函数 reducepatch() 简化细胞形状，将每个细胞的面数减少至 2000 个。这显著加快了后续的球谐分解。提取顶点旋转后的 x、y 和 z 分量，并通过对细胞表面点进行保面积展平，将其映射到球面上⁹⁴。该方法能够描述非星形凸形状，因为它提取了球面上的三个分布，分别对应 x、y、z 维度。对每个细胞分别进行球谐分解，其中 i = 1、2、3，坐标 x₁、x₂、x₃ 分别对应 x、y、z。Yₗₘ(θ, φ) 为球谐函数，θ 和 φ 为角度。系数 βᵢₗₘ 是球谐振幅，也是唯一的形状描述符。我们还引入了 N，表示所考虑球谐函数的最高阶数。我们发现，20 阶以上的球谐函数对球谐系数总累积方差的贡献并不显著（见图 S1B），因此也不会对主成分分析（PCA）产生显著贡献。在
在我们的研究中，我们使用了 \(N = 40\) 阶，共计 5043 个系数（在三个维度 \(x\)、\(y\)、\(z\) 中各有 1681 个）。完成所有细胞形状的分解后，我们使用 MATLAB 中的 point2trimesh() 函数（https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/52882-point2trimes…），通过计算原始形状顶点到球谐系数重建表面以及反向计算的距离来估算误差。随后，我们计算了每个细胞形状的平均误差和最大误差，仅纳入平均误差低于 0.1 µm 且最大误差低于 2 µm 的形状。
为表示形态空间，我们使用主成分分析（PCA）或 t 分布随机邻域嵌入（t-SNE）对球谐数据集进行降维。对于 PCA，我们计算了能够解释总方差 90% 的主成分（PC）数量 \(N_{\mathrm{PC}}\)（图 S1C）。平均细胞形状（见图 1 和图 2）以及图 1、S1、S2 和 S3 中的背景形状，均基于主成分值重建。为使形态空间中的距离具有明确意义，我们计算了形态空间中两个细胞形状 \(m\) 和 \(n\) 之间的欧氏距离，并将其与这两个形状之间的平均误差进行比较。
为生成袋状图⁹⁵（见图 S1、S2 和 S3），我们使用了 MATLAB LIBRA 工具箱⁹⁶。t-SNE 的 perplexity 参数设为 30。
我们使用三个数据集构建形态空间：
全局形态空间包含果蝇（*Drosophila*）12 个胚胎和赤拟谷盗（*Tribolium*）14 个胚胎中的所有细胞（图 1 和图 S1）；果蝇和赤拟谷盗每个发育阶段的平均细胞数分别为 316 ± 170 和 291 ± 75；
归一化形态空间包含所有胚胎中的全部细胞……
果蝇和赤拟谷盗的数据按每个细胞具有相同体积进行归一化（图 2 和图 S2）；
聚焦形态空间中每个物种包含 6 个胚胎，每个发育阶段（囊胚期、腹沟形成期、管状期）各取 2 个（图 2 和图 S3）。
细胞分裂取向
为对赤拟谷盗的细胞分裂进行活体成像，我们从 4 次独立实验中选取了 6 段延时序列（3 段来自外胚层视野，3 段来自中胚层视野）。实验所用胚胎注射了 G43-mNeonGreen RNA（标记细胞膜）和 H2Av-mScarlet-I RNA（标记染色质），共采集 11 个时间点（总时长 44 分钟）。我们对每段延时序列进行手动裁剪，使 Frame = 1（Time = 0 分钟）对应细胞化完成时刻；此时可清楚观察到细胞膜在每个细胞的基底侧凝聚成明亮的点状结构³⁷。随后，我们使用 Fiji 提取 H2Av 通道，应用中值滤波器（半径 = 5 µm）并增强对比度。之后使用 Ilastik⁹⁷˒⁹⁸ 中的对象分类工作流对细胞核和有丝分裂染色体团进行分割，并导出为 Object Identities .tiff 文件。在这些文件中，每一帧的每个细胞核均以掩膜标记，并以唯一像素值作为标识符。随后，我们在 Fiji 中将掩膜与原始 H2A 信号合并为 RGB 堆栈，以检查分割准确性。对于每次细胞分裂，我们使用多点工具，在两个子细胞首次呈现为两个独立对象的那一帧中手动选取它们。随后将对应的两个染色体掩膜的像素值作为三维坐标保存至 .csv 表格，同时记录时间帧、样本名称和各掩膜的整数值。
本文所述的所有后续分析均使用 Python（v3.8.18）⁹¹，并借助 NumPy⁹⁹、pandas¹⁰⁰、SciPy¹⁰¹ 以及
scikit-image
102
Jupyter Notebook 中的库。数据可视化使用 Matplotlib
103
和 Seaborn
104
。若正文中提及的特定软件包未包含在上述列表中，则会在文中单独引用。
为确定分裂方向，我们使用 Jupyter Notebook，从 Object Identities .tiff 文件中提取染色体团块质心；提取时依据配套 .csv 表格中列出的每个分裂后细胞对所对应的唯一像素值。对于每个时间点的每个细胞核，首先识别与其标签（像素值）对应的体素坐标，再将体素索引的均值按其物理尺寸（每个像素为 0.284 × 0.284 × 2 µm）缩放，以计算质心。随后计算相关染色体团块之间的成对位移向量，并通过三角关系求得极角 θ（相对于 z 轴，采用反向约定）。为便于可视化，将中胚层和外胚层的 θ 值绘制为随时间变化的散点图，并叠加平均轨迹以及各时间分箱的均值 ± SEM（使用高斯滤波器平滑，σ = 2），以突出显示时间趋势。
活体成像处理、追踪与特征提取
为对原肠胚形成期间赤拟谷盗（*Tribolium*）中胚层进行活体成像，每种条件选取了三个时间序列。按照上述方法向胚胎注射编码 G43-mNeonGreen 和 H2Av-mScarlet-I 的 mRNA（对照组），或同时注射 G43-mNeonGreen mRNA 与靶向 Tc-twi 或 Tc-string 的 dsRNA。对时间序列图像进行裁剪和对齐，使第一帧对应细胞化完成时刻，并使图像左侧对应头部形成区域的后方。
若存在细胞核通道（仅对照组胚胎中存在），则在 Fiji 中使用中值滤波器（r = 2）对该通道进行处理，然后……
生成投影图。对于膜通道，使用 LocalZProjector Fiji 插件生成平均投影图¹⁰⁵，参数如下：分箱 = 4，方法 = 标准差最大值，邻域大小 = 16，高斯预处理 = 0.70，中值后处理 = 30，方法 = 最大强度投影（MIP）。该插件生成两个输出：投影后的二维图像序列，以及一个高度图，用于指示原始 z 维度中各像素的高度。随后利用高度图进行形态学校正。
使用 Tissue Analyzer 插件¹⁰⁶，通过分水岭方法（强模糊 = 3.5，弱模糊 = 1.0）对膜通道二维投影图中的顶端膜进行自动分割。随后对分割结果进行人工检查，以验证其准确性。将生成的二值掩膜导入 Ilastik 进行人工追踪。追踪过程生成以下文件：
一个 .tiff 文件，其中每个追踪对象均被赋予唯一的像素值，且该像素值在各帧之间保持一致；
一个 .csv 文件，其中包含细胞分裂数据，记录母细胞与子细胞之间的对应关系，并注明每次分裂发生的帧。
对于平面外分裂和细胞挤出，在 .txt 文件中手动标注分裂和挤出发生的时间，并检查原始 z 轴图像序列以确认这些事件。
总体而言，人工追踪确保后续分析仅纳入分割正确的中胚层细胞。
在 Jupyter Notebook 中处理所有 .tiff 和 .txt 文件。使用 ndimage.label（SciPy）将二值掩膜转换为带标签的对象，像素值对应追踪 ID。
对于对照胚胎，从数据中提取了一组形态计量特征。特征计算、尺度和校正的详细说明见表 S1。针对每个对象提取了以下几何特征。
使用 regionprops 函数（scikit-image）计算各项特征，并根据图像的像素尺寸（0.284 µm²/pixel）将其归一化为微米单位：面积、凸包面积、长轴长度、短轴长度、质心 x 坐标、质心 y 坐标和方向。为校正高度畸变，我们根据 LocalZProjector 的高度图调整特征，具体做法是将原始 MATLAB 版 DeProj 代码改写为 Python。其他特征（偏心率、范围比和实心度）则根据校正后的数值计算（见 Table S1）。
谱系分配、密度测量与挤出追踪
对追踪数据进行处理，为每个对象分配分裂时间并确定谱系身份。新增一列“归一化时间”，其值由绝对时间减去分裂时间得到。分裂时间取自 Ilastik 手动追踪流程输出的 .csv 文件；对于成像平面外发生的分裂，则通过检查 z-stack 手动确定。因此，该时间以分裂时间点为基准进行了归一化。这一转换确保归一化时间 = 0 对应于母细胞仍为独立对象的最后一个时间点。每个腹侧胚盘细胞均被归类为母细胞（分裂前）或子细胞（分裂后）。在 Sample 1 中共分析了 93 个母细胞和 165 个子细胞，在 Sample 2 中分析了 99 个母细胞和 176 个子细胞，在 Sample 3 中分析了 58 个母细胞和 92 个子细胞。根据手动追踪观察，腹侧胚盘细胞在细胞化至原肠胚形成期间只分裂一次。
共计算了三项密度参数：顶端密度、相对面积和细胞核拥挤度（详见 Table S1）。为确保中胚层边界处测量准确，将每个时间点追踪到的细胞与 TissueAnalyzer 生成的分割结果进行匹配（顶端细胞
掩膜）和 Cellpose（细胞核掩膜）。追踪数据集仅包含人工随时间追踪的细胞，而分割结果则包含各时间点视野内所有细胞的掩膜。因此，将追踪到的细胞与完整的分割数据集进行匹配，便可相对于完整的局部细胞群体，而非仅相对于已追踪的细胞子集，计算密度测量值。这样可确保测量纳入分析窗口内的所有邻近细胞，前提是该窗口未超出图像边界。顶端密度和相对面积在以细胞顶端掩膜质心为中心、半径为 20 µm 的窗口内测量；核拥挤度则在以细胞核质心为中心、半径为 10 µm 的窗口内测量。这些指标是在测试了不同半径（5 至 25 µm）的窗口后确定的，目的是大致纳入各时间点最近的邻近细胞，并根据不同类别调整窗口大小。由于细胞面积会动态变化，且由于 *Tribolium* 中胚层的细胞分裂具有异步性，细胞邻居也在不断更替，因此无法在各时间点自动追踪细胞邻居；我们改用固定窗口内的测量值作为近似。
为分析特征随细胞挤出发生的动态变化，根据追踪过程中记录的 .csv 文件手动标注挤出时间，并将其定义为顶端投影中仍能观察到挤出细胞的最后一个时间点。
根据细胞质心 x 坐标的平均值，将细胞划分为前部或后部，并以样本长度的一半作为两个区域的分界线。这不一定与“前部”或“后部”相对应。
这些区域并非经典意义上的胚胎区域，而是指所成像和分析的视野中中胚层细胞的相对位置。
处理后的数据保存为 .csv 文件，以供进一步分析。使用 Seaborn 和 Matplotlib 生成可视化结果，包括时间序列图和密度比较图。使用 SciPy 实现双侧非参数 Mann–Whitney U 检验，对独立组进行统计比较。
沟深测量
对三个对照胚胎的沟深进行手动测量。裁剪每个图像堆栈，使其包含中胚层区域在前后轴和背腹轴上的范围，并进行对齐，使 time=0 对应于细胞化完成。沿前后轴（图像的左右轴）将堆栈划分为三个等距区域，重新切片后使用 Fiji 中的直线工具进行测量。在重新切片的堆栈中，对每个相关位置的沟深进行手动判定。在沟形成开始之前，沟深记为 0。
随机森林分类器与用于预测特征分析的 SHAP 值
为识别可预测分裂方向的特征，使用上述几何特征和组织密度特征（另见表 S1）训练随机森林分类器（scikit-learn），并使用 Shapley 加性解释（SHAP）值评估各特征的重要性。使用 Shap 包计算随机森林分类器的 SHAP 值；该包提供与模型无关的预测解释。使用 Shap 包生成 SHAP 汇总图和依赖图。SHAP 分析所纳入的特征包括：面积、顶端密度、相对面积、偏心率、范围、方向，
实心度和核拥挤程度。
在随机森林分类器分析中，我们生成了一个数据集，其中包含每次细胞分裂前 28 分钟内所有母细胞的特征；如正文所述，这些特征按两个时间点划分的时间区间取平均值。随后将数据集划分为训练集（60%）、验证集（20%）和测试集（20%）。我们使用了 Scikit-learn 中的 RandomForestClassifier 包。针对每个时间区间，分别训练并评估一个模型，评估指标为 F1 分数。F1 分数是精确率（所有预测为阳性的样本中被正确预测为阳性的比例）与召回率（所有实际为阳性的样本中被正确预测为阳性的比例）的调和平均数。
为进一步探究特征重要性与发育时间之间的关系，我们针对最能预测细胞分裂取向的时间区间（−12 至 −8 分钟）专门训练了一个随机森林模型，并计算其 SHAP 值。我们利用 SHAP 值确定这一阶段特定特征对细胞分裂取向的相对贡献。
补充信息
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图 S1.
与图 1 相关的果蝇和赤拟谷盗中胚层原肠胚形成期间细胞形状轨迹的补充数据。
(A) 原肠胚形成的囊胚期（上图）和腹沟期（下图）中，果蝇胚胎内 twi 和 sna 的染色，以及赤拟谷盗胚胎内其同源基因（Tc-twi 和 Tc-sna）的染色。使用 DAPI 对胚胎进行染色以显示细胞核，并使用 HCR v3 探针检测转录本。左图：DAPI 与 HCR 信号的合并视图。比例尺，100 µm。
(B) 球谐系数的总累积方差（公式 1）。
(C) 细胞形状的单项和累积百分比
以果蝇（*Drosophila*）和赤拟谷盗（*Tribolium*）中分割得到的所有细胞构建的形态空间，其方差由前 23 个主成分（PC）解释，占总方差的 90%。
(D) PC1 和 PC2 的变化所反映的重建细胞形状变化。中心形状对应 PC1 = PC2 = 0。
(E 和 F) 果蝇（E）和赤拟谷盗（F）胚胎原肠胚形成过程中，中胚层三维细胞形状在 PC1-PC2 形态空间中的袋图表示。多边形表示袋图：内多边形（袋）包含 50% 的数据点，外多边形（围栏）对应所有数据的凸包。黑线：细胞形状轨迹，定义见图 1E、F。
(G 和 H) 果蝇（G）和赤拟谷盗（H）中胚层细胞形状的 t-SNE 嵌入。袋图表示方式同 E、F。
对于 (E-H)，每个袋图对应一个胚胎；较深的色调表示较晚的发育时期，与图 1E、F 相同。
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图 S2。
对体积进行归一化后的赤拟谷盗中胚层细胞形状分析显示，细胞形状变异性在腹侧沟形成阶段达到峰值，相关内容见图 2。
(A) 形态空间中的距离（见公式 3）与细胞形状间平均表面距离（见方法）的比较。此处选取了用于计算距离的 1000 对细胞（见方法）。
(B) 对细胞体积进行归一化后，各阶段所有球谐函数的总方差（见公式 2 和方法）。
(C) 赤拟谷盗胚胎原肠胚形成过程中，中胚层三维细胞形状在 PC1-PC2 形态空间中的袋图表示。细胞体积经过归一化，使所有细胞体积相同。每张图绘制同一发育阶段两个胚胎的数据；较深的色调表示较晚的发育时期，与……相同。
见图 1F。袋形图表示：内多边形（袋）包含≤50%的点，外多边形（围栏）对应所有数据的凸包。
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图 S3.
与图 2 相关的补充数据：对腹沟形成阶段赤拟谷盗和果蝇中胚层细胞形状进行聚焦形态空间分析。
(A) 赤拟谷盗和果蝇胚胎在囊胚期、腹沟期和管状期的最小数据集中，前 15 个主成分（PC）所解释的细胞形状方差的单项百分比和累积百分比（解释见图 2）；这 15 个主成分对应总方差的 90%。使用 PC1 和 PC2 构建聚焦形态空间。
(B) 聚焦形态空间中 PC1 和 PC2 变化所反映的细胞形状重构变化。中心形状对应 PC1 = PC2 = 0。
(C 和 D) 腹沟形成期间赤拟谷盗（C）和果蝇（D）胚胎中胚层三维细胞形状的袋形图表示，绘制于图 2 所示的 PC1-PC2 聚焦形态空间中。多边形表示袋形图：内多边形（袋）包含≤50%的点，外多边形（围栏）对应所有数据的凸包。黑线：细胞形状轨迹。
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图 S4.
与图 3 相关的赤拟谷盗中胚层面外分裂位置和时序分析的补充信息。
(A) 赤拟谷盗中胚层中两个正在分裂的细胞，其纺锤体分别位于上皮平面内（左侧细胞）和上皮平面外（右侧细胞）。胚胎经乙酰化 α-微管蛋白染色以显示微管（绿色）、鬼笔环肽染色以显示肌动蛋白（灰度），并经 DAPI 染色以显示 DNA（洋红色）。该图像为共聚焦显微镜的横截面。
平均堆栈，跨越 4µm。比例尺，10µm。
(B) 果蝇拟步甲（Tribolium）胚胎共聚焦显微镜延时成像的顶端视图（约 4µm 厚的掠入射切面的平均投影）。胚胎短暂表达 H2Av-mScarlet 标记 DNA（蓝色），并表达 G43-mNG 标记质膜（灰度），显示腹侧沟形成和中胚层内陷从胚胎后端向前端推进。时间以细胞化后的分钟数表示。比例尺，20µm。
(C) 3 个胚胎的沟深随时间变化的平均值，按位置绘制（前部、中部、后部，沿前后轴在三个等间距位置定义）。在每段延时成像的横截面中手动测量沟深。
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图 S5。
与图 4 相关的、用于可解释机器学习分析以预测分裂方向的局部细胞特征的补充数据，以及发生挤出的细胞中关键特征的动态变化。
(A) 使用随机森林分类器预测分裂方向所用特征的 SHAP 依赖图，显示各特征对模型预测的贡献。各特征 x 轴所用单位见表 S1。每个点代表一个细胞，颜色按特征值编码（由蓝色表示低值渐变至红色表示高值）。较高的 SHAP 值表示该特征对预测细胞发生面外分裂的贡献更大；较低（更负）的 SHAP 值则表示该特征有助于预测细胞发生面内分裂。
(B) 面内分裂（粉色，n = 189）和面外分裂（绿色，n = 61）中，5 个预测能力较弱的局部细胞特征（偏心率、顶端密度、方向、实心度、范围）随归一化时间的变化。样本量为 3 个胚胎。
进行分析。实线表示均值，阴影区域表示标准差。各特征在 y 轴上所用的单位见表 S1。
(C) 与所有中胚层细胞相比，排出细胞的顶端面积、相对顶端面积及细胞核拥挤程度的动态变化。上排：均值 ± 标准差；下排：随机选取的 10 个细胞的单细胞轨迹。n = 628 个细胞，来自 3 个胚胎，其中共有 21 个排出细胞（3% 的细胞发生排出）。
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图 S6.
中胚层中 Tribolium Tc-tribbles 和 Tc-string 的表达，以及 Drosophila tribbles 突变体胚胎的分期；相关内容见图 5。
(A) 第 13 个细胞周期期间 Tc-tribbles、Tc-twi 和 Tc-string 的表达。每种条件均显示第 13 个细胞周期的开始和结束阶段。Tc-tribbles 的表达局限于胚外组织。Tc-string 首先在外胚层表达，随后在外胚层和中胚层中表达。黄色虚线标示中胚层区域。比例尺，100 µm。
(B) 对照组和 Drosophila tribbles 胚胎在中胚层内陷两个连续阶段的代表性图像，与图 5 中的胚胎相对应。胚胎经鬼笔环肽染色（显示反相对比度）。比例尺 b
关键词：原肠胚形成 · 昆虫胚胎发育 · 细胞形态空间分析 · 顶端收缩 · 面外细胞分裂 · 组织形态发生
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.30.735526v1?rss=1