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人多能干细胞（hPSCs）分化为少突胶质细胞所需的时间较长，限制了其在疾病建模、药物筛选和细胞治疗中的应用。尤其是，在神经诱导和腹侧模式化之后，驱动少突胶质细胞命运特化与成熟的信号仍不明确。在此，我们提出了一种完全基于外源性信号、由hPSCs生成人少突胶质细胞的方案，并确定同时抑制BMP和Notch信号通路是驱动少突胶质细胞命运定向与成熟的关键因素。分化至第42天时，多达70%的细胞呈少突胶质细胞标志物O4阳性，星形胶质细胞混杂极少，并且高水平表达MBP、MOG和MAG等成熟髓鞘标志物。单细胞RNA测序分析表明，这些hPSC来源的少突胶质细胞在分子特征上与原代人胎儿少突胶质细胞高度一致；体外髓鞘形成实验则证实了其功能。除可快速生成具有髓鞘形成功能的少突胶质细胞外，该新方案还可通过模块化调整，高效生成PDGFR⁺少突胶质前体细胞或包含AQP4⁺星形胶质细胞的混合胶质细胞群，从而为转化应用中人类胶质细胞谱系的研究提供细胞工具箱。
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通过双重抑制 BMP 和 Notch 信号通路，使人多能干细胞快速、高效地分化为少突胶质细胞
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https://doi.org/10.64898/2026.06.30.729930
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少突胶质细胞分化所需的漫长时间
从人多能干细胞（hPSC）中获取少突胶质细胞的局限性，限制了其在疾病建模、药物筛选和细胞治疗中的应用。尤其是，在神经诱导和腹侧模式化之后，驱动少突胶质细胞命运特化与成熟的信号仍不明确。在此，我们提出了一种完全基于外源性信号、由hPSC生成人人少突胶质细胞的方案，并确定同时抑制BMP和Notch信号通路是驱动少突胶质细胞命运定向与成熟的关键因素。在分化第42天，多达70%的细胞呈少突胶质细胞标志物O4阳性，星形胶质细胞混杂极少，并且高水平表达MBP、MOG和MAG等成熟髓鞘标志物。单细胞RNA测序评估表明，这些hPSC来源的少突胶质细胞在分子特征上与原代人胎儿少突胶质细胞高度一致，体外髓鞘形成实验也证实了其功能。除能够快速生成具有髓鞘形成能力的少突胶质细胞外，该新方案还可通过模块化调整，高效生成PDGFRα⁺少突胶质前体细胞，或含有AQP4⁺星形胶质细胞的混合胶质细胞群，从而为转化应用中的人类胶质细胞谱系研究提供细胞工具箱。
引言
少突胶质细胞是最丰富的胶质细胞类型之一¹，负责中枢神经系统的髓鞘形成。髓鞘形成涉及富含脂质的膜结构的形成，这些结构使轴突实现电绝缘，从而支持动作电位的跳跃式传导，而这种传导对神经元之间的快速信息交流至关重要²,³。除形成髓鞘外，少突胶质细胞还在轴突代谢支持和离子稳态维持中发挥重要作用。此外，少突胶质前体细胞（OPC）能够直接
与神经元的突触相互作用⁴–⁷。因此，少突胶质细胞谱系构成了一个动态且多功能的细胞系统，对神经环路功能及稳态维持均至关重要。在前脑发育过程中，第一波少突胶质前体细胞（OPCs）起源于内侧神经节隆起（MGE）和前内脚区（AEP），在小鼠中约出现于胚胎第12.5天（E12.5），在人类中约出现于受孕后8–10周⁸–¹⁰。在发育中的人类脊髓中，OPCs于受孕后（p.c.）约7–9周从神经管腹侧的pMN区域产生¹¹,¹²。pMN区域是一个边界严格限定的区域，以转录因子NKX6.1和OLIG2的共表达为特征¹³–¹⁵。该区域先产生运动神经元，随后产生OPC谱系细胞；后者继而迁出脑室区，并分化、成熟为形成髓鞘的少突胶质细胞¹⁰,¹¹,¹⁶–¹⁸。
基于早期胚胎发育研究奠定的坚实基础，研究者已进行了大量尝试，以在体外生成人多能干细胞（hPSC）来源的少突胶质细胞¹⁹–²³。然而，方案的一致性与可重复性不足、分化周期漫长（体外培养通常超过数月）、成熟细胞产率低，以及使用成分不明确的培养基组分等问题，限制了少突胶质细胞在各类体外和体内转化应用中的使用。在现有体外分化方案中，已定向分化的O4⁺少突胶质细胞和更成熟的MBP⁺细胞通常都仅在晚期阶段出现；这可能是因为在体内发育过程中，少突胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最后以成熟形态出现的细胞类型²⁴,²⁵，因此其体外分化也相应需要较长时间。
此外，尽管人们已充分了解可产生少突胶质细胞谱系细胞的腹侧前体域的诱导过程，但对进一步驱动少突胶质细胞命运特化和成熟的信号仍知之甚少。此外，目前大多数方案尚未利用不断涌现的人类胎脑图谱中原代少突胶质细胞及相关谱系的单细胞RNA测序（scRNA-seq）表达谱，对所获细胞的身份进行无偏验证。
在此，我们提出了一种新颖、快速且高度可重复的方案，可从人多能干细胞（hPSC）生成人少突胶质细胞，且无需异位表达SOX9或SOX10等转录因子²⁶,²⁷。到第42天（6周）时，O4阳性细胞比例可达70%，其中大多数细胞表达MBP、MOG和MAG等髓鞘标志物。该方案的关键创新在于联合抑制BMP和Notch信号通路，从而抑制星形胶质细胞分化，并加速少突胶质细胞的命运定向与成熟。通过结合单细胞RNA测序与机制研究，我们描绘了从腹侧前体诱导、少突胶质前体细胞（OPC）建立到少突胶质细胞成熟的发育轨迹，并明确了调控细胞命运时序性转换及身份获得的信号通路。基于这些发育机制方面的认识，我们开发了模块化分化条件，以快速、高效地获得与转化应用相关的少突胶质细胞及相关谱系，包括：（1）可扩增的PDGFRα⁺ OPC群体；（2）表达MBP的成熟少突胶质细胞；以及（3）同时包含星形胶质细胞和少突胶质细胞的混合胶质细胞群体。
结果
少突胶质细胞诱导方案概述——从pMN域到成熟少突胶质细胞
为追踪人OPC的诱导及
为实现少突胶质细胞分化，我们首先构建了用于报告 OLIG2 和 SOX10 表达的双报告人多能干细胞（hPSC）系（SOX10::H2B-GFP；OLIG2::H2B-tdTom），详见图 S1 和文献 28。我们建立了基于三维类器官的分化方案，在促进分化过程中细胞间相互作用的条件下，按优化的顺序施加外源性模式化信号（图 1A、B）⁵,²⁹。在 42 天的分化过程中，细胞由 hPSC 依次发育为 pMN 谱系、具有胶质细胞分化潜能的前体细胞、具有少突胶质细胞分化倾向的谱系及少突胶质细胞前体细胞（OPC），最终形成以髓鞘碱性蛋白（MBP）为标志的成熟、具有髓鞘形成能力的少突胶质细胞（图 1B、C，S2A、B）。在该方案的第一阶段（分化第 0—26 天），细胞达到具有胶质细胞分化潜能的状态，即以共表达 SOX9 和 NFIA 为特征的双潜能前体细胞状态。为优化具有胶质细胞分化潜能的谱系中对少突胶质细胞谱系发育至关重要的 OLIG1 和 OLIG2 转录因子（TF）的表达，我们对现有方案进行了三项关键改进。早在第 6 天，我们便开始使用（1）视黄酸（RA）激动剂，这些激动剂可高亲和力地靶向 RARα 和 RXR 受体。以 RA 激动剂替代全反式视黄酸，可增强 pMN 区域的诱导，同时尽可能减少背侧和腹侧非目标细胞群的出现，包括混杂的 FOXA2⁺ 底板样细胞。在分化第 12 天，我们加入（2）FGF18，以抑制 pMN 前体细胞的神经元生成；在正常体内发育过程中，这些前体细胞会在胶质细胞生成启动之前产生脊髓运动神经元。此外，FGF18 还促进了保留 OLIG2 表达、具有胶质细胞分化潜能的细胞的增殖。在第 22 天，我们加入了一种强效的 Sonic hedgehog 信号抑制剂，（3）
环巴胺（cyclopamine），以抑制任何残留的FOXA2⁺底板样祖细胞。
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图1.
少突胶质细胞诱导方案概述——从pMN结构域到成熟少突胶质细胞。
（A）为期42天的类器官培养方案示意图，该方案可使人多能干细胞（PSC）快速分化为混合胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPC）及成熟少突胶质细胞群体。（B）发育模型展示了在42天方案中，通过调控信号通路实现少突胶质细胞命运特化与分化的关键调整——从诱导脊髓腹侧pMN结构域到生成成熟少突胶质细胞。（C）代表性免疫荧光图像显示，第42天可见OLIG2、SOX10及髓鞘碱性蛋白（MBP）阳性细胞。比例尺：100 μm。
在方案的第二阶段（分化第26—42天），我们建立了同时抑制BMP和Notch信号的分化条件，以获得增殖中的OPC、成熟少突胶质细胞，或同时包含成熟少突胶质细胞和星形胶质细胞的混合胶质细胞谱系（图1A）。在这三种条件下，均对第26天的前体细胞施用（4）DMH1，这是一种强效BMP信号抑制剂，可防止细胞由双潜能状态转向星形胶质细胞定向命运。进一步推动少突胶质细胞谱系特化的关键因素，是使用γ-分泌酶抑制剂（5）DAPT抑制Notch信号。持续抑制Notch信号（NOTCHi，第26—42天）可促进细胞退出双潜能状态，转向SOX10⁺定向少突胶质细胞谱系，并进一步分化为成熟的MBP⁺细胞。相比之下，较短时间或延迟给予的Notch信号抑制脉冲处理可促进PDGFRα⁺ OPC的出现（图1B）。最后，在存在DMH1的条件下，第26—42天不进行Notch信号抑制，可促进细胞分化为混合的
AQP4⁺星形胶质细胞和SOX10⁺少突胶质细胞群。重要的是，我们基于BMP和Notch双重抑制的成熟少突胶质细胞分化方案，能够在hPSC分化的6周内，在无星形胶质细胞的条件下高效生成成熟少突胶质细胞（图1C）。
从pMN结构域诱导到具有胶质细胞分化能力的双潜能前体细胞——RA激动剂、音猬因子抑制剂和FGF18处理可减少FOXA2⁺星形胶质细胞谱系并防止OLIG2丢失
pMN结构域严格局限于发育中脊髓的腹侧区域，其诱导需要背腹侧（D/V）模式化信号的适当平衡。视黄酸在腹侧脊髓中被认为发挥背侧化信号的作用³⁰，以平衡音猬因子（SHH）介导的腹侧化程度；联合使用视黄酸和SHH可将细胞“锁定”于pMN结构域内³¹,³²。在本研究所采用的方案中，我们通过单细胞RNA测序证实，到第12天时，细胞已表达界定pMN结构域的主要转录因子¹⁴,³³（图2A，左图）。这些转录因子包括NKX2.2，它是小鼠中位置更偏腹侧的p3结构域的经典标志物，但研究表明，在人类发育过程中，表达该因子的细胞可产生一部分较晚出生的运动神经元³⁴。尽管在神经元发生过程中，NKX2.2的表达通常局限于p3结构域，但在胶质细胞发生过程中，其表达范围会向背侧扩展至pMN结构域，而随后生成少突胶质细胞的pMN结构域祖细胞同时表达Olig2和NKX2.2¹⁴,³⁵,³⁶。
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图2。
从pMN结构域诱导到具有胶质细胞分化能力的双潜能前体细胞——通过RA激动剂、音猬因子抑制剂和FGF18处理减少FOXA2⁺星形胶质细胞谱系并防止OLIG2丢失。
（A）单基因表达
基于 OLIG2 和 NKX6-2 等主要转录因子的表达，scRNA-seq 数据的 UMAP 图显示，第12天时 pMN 区域已形成正确的模式，并在第22天时迅速转变为具有胶质分化潜能的 NFIA-SOX9 状态。(B) 与更常用的全反式视黄酸（ATRA）处理相比，使用视黄酸受体激动剂（RAR 和 RXR 激动剂）可在第22天时显著减少 FOXA2+ 底板样细胞。(C) 在第22天至第32天期间，使用环巴胺阻断内源性 Sonic hedgehog 信号传导，可进一步抑制 FOXA2+ 底板细胞。(D) 具有胶质分化潜能状态的代表性免疫荧光图像显示 NFIA-SOX9 的表达；截至第22天，培养物中超过80%的细胞被诱导表达这些标志物。(E) 与 ATRA 处理相比，RA 激动剂处理的培养物在第22天时 OLIG2 表达显著升高，而 NKX2-2 表达无显著变化。(F) 在第22天至第32天期间，使用 FGF18 而非更常用的 FGF2 处理细胞，可部分缓解第32天时 OLIG2 表达的下调，而在这些条件下 NKX2-2 表达无显著变化。根据高表达和低表达模式对 OLIG2 表达进行定量。比例尺：100 μm。
截至第22天，大多数细胞共表达 NFIA 和 SOX9，同时保留 OLIG1/OLIG2 的表达，提示这些细胞获得了胶质分化潜能，并具有向星形胶质细胞或少突胶质细胞分化的双向潜能（图2A，右图）。在已发表的方案中，通常通过添加 ATRA（全反式视黄酸）激活 RA 信号传导。然而，在比较 ATRA 与 RA 激动剂处理时，我们观察到 ATRA 处理的培养物中出现了共表达 NKX2.2 的 FOXA2+ 非目标细胞群（图2B）。我们推测，这些 FOXA2+/NKX2.2+ 前体细胞可能使分化发生偏向
向较晚阶段星形胶质细胞谱系的定向分化。星形胶质细胞是所有主要基于外源性因子的少突胶质细胞分化方案中常见的“非目标”细胞³⁷,³⁸，尽量减少FoxA2阳性杂细胞可能提高少突胶质细胞的产量，但代价是产生非目标星形胶质细胞。除了可能成为星形胶质细胞外，这些FOXA2+/NKX2.2+前体细胞也可能分化为中间神经元，因为小鼠p3区域最腹侧的细胞也具有这一标志物表达特征，而这些细胞可成为Sim1+ V3中间神经元³⁹。我们发现，与ATRA处理相比，同时靶向RAR和RXR受体的RA激动剂可显著减少第22天时向FOXA2+细胞的分化（图2B、图S3A）。然而，即使在经RA激动剂处理的培养物中，我们仍观察到少量FOXA2+前体细胞在第22—32天期间增殖。我们推测，内源性音猬因子（SHH）信号传导可能促使FOXA2+杂细胞持续增殖。因此，我们测试了在第22—32天期间对经RA激动剂处理的细胞施用强效SHH抑制剂环巴胺的影响。至分化第32天，环巴胺处理几乎清除了所有FOXA2+杂细胞（图2C），同时也限制了ISL1+运动神经元的发育（图S3B）。然而，尽管RA激动剂处理的类器官中大部分FOXA2+细胞被清除，且第22天时OLIG2+细胞显著增加（图2E），我们仍观察到OLIG2表达在第22天至第32天期间下调（图2E、F）。我们未采用广泛用于促进OLIG2表达的FGF2处理，而是使用FGF18处理细胞（第12—32天）。在稳定pMN来源的细胞谱系和OLIG2表达方面，FGF18处理优于FGF2
表达（图2F、S3C），并使具有少突胶质细胞分化倾向的双潜能前体细胞谱系得以高效扩增。此外，细胞仍保持OLIG1强阳性，并逐渐转变为PDGFRα⁺祖细胞和已定向分化的SOX10⁺少突胶质细胞（图S3D、E）。
BMP抑制可阻止星形胶质细胞定向分化，并促进形成具备少突胶质细胞谱系特化能力的胶质细胞分化潜能状态
第26天，具有胶质细胞分化能力的双潜能细胞以转录因子SOX9、NFIA与OLIG1/OLIG2的共同表达为特征。我们推测，要使细胞偏向少突胶质细胞命运，首先需要维持OLIG1/OLIG2的高水平表达（图2F、S3D）。其次，持续高水平表达OLIG1/OLIG2的细胞应随时间推移逐步进入以SOX10表达为特征的少突胶质细胞谱系定向阶段。我们发现，强效抑制BMP信号可引导双潜能前体细胞转变为表达NFIA/SOX2/PDGFRα、具有少突胶质细胞谱系倾向的前体细胞（图3A）；分化第42天出现的SOX10/PDGFRα/OLIG2细胞群进一步证实了这一点（图3B）。既往聚焦于星形胶质细胞发育的研究曾描述BMP抑制可能使细胞偏向少突胶质细胞谱系的一种机制。事实上，此前针对原代神经前体细胞的研究报道，激活BMP通路可在体内和体外均诱导细胞分化为星形胶质细胞⁴⁰–⁴²。然而，尽管这些研究显示BMP处理会导致少突胶质细胞减少，却未直接探讨抑制BMP信号是否会相应增强少突胶质细胞谱系特化。
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图3.
BMP抑制
阻止星形胶质细胞的定向分化，并促进形成具备少突胶质细胞谱系特化能力的胶质细胞分化潜能状态。
(A) 示意图展示了BMP抑制的拟议作用，即促使具有双向分化潜能的胶质细胞群体偏向少突胶质前体细胞分化，并抑制其向星形胶质细胞分化。(B) 代表性免疫荧光图像显示，具有胶质细胞分化倾向的OLIG2-SOX2-NFIA双潜能细胞群受到强烈诱导，继而产生PDGFRα阳性、SOX10低表达且具有OPC分化倾向的前体细胞。(C) 第32天的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据鉴定出两个不同的细胞群：最初为具有胶质细胞分化倾向的双潜能细胞群，随后转向OPC前体细胞命运，表现为OLIG2和PDGFRα阳性、SOX10低表达。(D) 单独使用BMP抑制剂（BMPi）可使细胞既分化为MOG/MBP阳性的成熟少突胶质细胞，也分化为GFAP-AQP4阳性的星形胶质细胞（混合胶质细胞条件）。(E) 使用Palantir进行的细胞轨迹分析显示，BMP信号通路（包括受体和调节因子）在星形胶质细胞中上调，同时在少突胶质细胞发育过程中下调。(F) 基于流式细胞术分析比较经BMP4与DMH1（BMPi）处理的培养细胞。与DMH1处理的细胞相比，从第26天至第42天进行BMP4处理导致第32天SOX10表达降低，并在第42天导致O4阳性细胞群显著减少。比例尺：100 μm。(G) 免疫细胞化学证实，BMP4处理后，第42天细胞中GFAP蛋白表达被诱导，而MBP未见表达。
通过对采用仅含BMPi的混合胶质细胞方案所培养的细胞在第32天进行scRNA-seq分析，我们发现存在两个不同的细胞群：一个是推定具有双向分化潜能的SOX2-NFIA-OLIG2阳性细胞群，另一个则是偏向OPC谱系、表达NFIA-OLIG2-PDGFRα并开始表达SOX10的细胞群（图3C）。到第43天，这些OPC推测已分化为成熟少突胶质细胞。
其特征为表达主要髓鞘成分 MBP 和 MOG，而此前尚无谱系偏向的祖细胞则转变为 GFAP 和 AQP4 阳性的分化星形胶质细胞（图 3D）。我们进一步在单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据集中，追踪了所有分化时间点（第 12、22、32 和 43 天）BMP 信号通路的关键组分。我们应用谱系轨迹分析工具 Palantir⁴³，追踪终点（第 43 天）被鉴定为星形胶质细胞或少突胶质细胞的细胞的预测发育轨迹。我们观察到，星形胶质细胞谱系沿拟时序呈现出一条独特的轨迹，BMP 信号分子在早期显著上调（绿色曲线）。相比之下，少突胶质细胞谱系轨迹（橙色曲线）显示，BMP 信号通路组分随时间显著减少（图 3E）。接下来，我们测试了能否调控早期双能前体细胞向星形胶质细胞谱系分化的倾向。从第 22 天起给予 BMP4 处理，减少了 SOX10⁺ 细胞的出现，并使第 42 天 O4⁺ 细胞的比例降至约四分之一（图 3F）。相应地，BMP4 处理诱导了 GFAP⁺ 星形胶质细胞的形成，并在很大程度上阻断了向 MBP⁺ 少突胶质细胞的分化（图 3G）。
Notch 抑制触发双能前体细胞的少突胶质细胞命运特化，并促进少突胶质前体细胞（OPC）向成熟少突胶质细胞转变
尽管 BMP 抑制（BMPi）降低了星形胶质细胞分化的倾向，并使细胞能够随时间向少突胶质细胞谱系转变，但它并未直接触发少突胶质细胞的诱导。我们推测，随时间推进的少突胶质细胞分化可能涉及双能祖细胞群体内部的一种反馈机制，该机制控制着渐进式分化。在神经元的
分化，抑制神经元前体细胞中的Notch信号传导可触发神经元分化⁴⁴–⁴⁶。为评估少突胶质细胞分化是否依赖于类似机制，我们在第26天使用γ-分泌酶抑制剂DAPT（一种广泛使用的Notch抑制剂）处理双潜能前体细胞。第42天的流式细胞术分析表明，DAPT处理使少突胶质细胞谱系细胞的比例从仅使用BMP抑制剂（BMPi）时（混合胶质细胞条件）的34.3% SOX10⁺、22.4% O4⁺和13.0% O1⁺，增加至同时抑制NOTCH和BMP时（成熟条件）的72.1% SOX10⁺、64.3% O4⁺和50.0% O1⁺（图4A、S4A）。有趣的是，将NOTCH抑制剂（NOTCHi）处理推迟6天可进一步增加SOX10⁺细胞群的比例（SOX10⁺细胞占78.3%；图S4B），但会导致O4⁺少突胶质细胞的比例降低（扩增条件）。我们还注意到，延迟NOTCHi处理会在第42天产生一群表达PDGFRα、处于细胞周期中的少突胶质前体细胞（OPC）（图S4C）。为评估能否进一步扩增PDGFRα⁺ OPC，我们在第26—32天对类器官进行早期NOTCHi处理，随后撤除DAPT，同时保留FGF18和DMH1。此外，我们还添加了由CHO细胞生产的重组PDGF-AA。CHO细胞来源的PDGF-AA比大肠杆菌表达的PDGF-AA具有更强的生物活性。在这些条件下，我们观察到，到第42天时，表达PDGFRα的细胞比例显著增加（图S4C）。相比之下，成熟方案中MBP⁺和PLP1⁺细胞的比例高于未使用DAPT的条件，进一步证实了DAPT处理可促使细胞向成熟少突胶质细胞转变（图S4D）。我们在第43天对上述三种条件分别进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图4B），包括不使用NOTCHi（混合胶质细胞）、晚期使用NOTCHi（扩增）、持续使用NOTCHi（成熟
）。这三个细胞群分别以AQP4、PDGFRα和MBP的表达为特征，呈现出不同的转录特征（图4C）。使用Palantir⁴³进行的拟时序轨迹分析显示，向星形胶质细胞或少突胶质细胞终末状态发育的过程中，Notch调控呈现对称但相反的模式。星形胶质细胞命运与Notch信号靶基因（HES1和HES5）表达随时间显著升高相关，而少突胶质细胞谱系轨迹则以HES1和HES5表达的延迟下降为特征（图4D）。
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图4.
Notch抑制触发双能前体细胞向少突胶质细胞定向分化，并促进少突胶质前体细胞（OPC）向成熟少突胶质细胞转变。
（A）在第26天联合抑制NOTCH和BMP（BMPi），可诱导具有OPC分化倾向的细胞发生转变；与仅用DMH1处理的细胞相比，SOX10定向分化细胞及O4–O1髓鞘形成前细胞群的比例增加。流式细胞术分析显示，混合胶质细胞条件下O4阳性细胞占22.4%，O1阳性细胞占13.0%；成熟条件下O4阳性细胞占64.3%，O1阳性细胞占50.0%。（B）单细胞RNA测序（scRNAseq）数据显示，采用混合胶质细胞、扩增和成熟方案（分别为不抑制NOTCH、晚期抑制NOTCH和早期抑制NOTCH）分化所得细胞的分布。（C）单基因表达UMAP图展示了三种方案中随NOTCH抑制而呈现的不同细胞身份：混合胶质细胞群主要表达星形胶质细胞标志物（AQP4）；扩增条件下少突胶质前体细胞标志物显著上调（PDGFRα高表达）；成熟细胞簇中MBP等成熟少突胶质细胞标志物上调。（D）轨迹分析证实Notch信号通路上调
在星形胶质细胞中，而在少突胶质细胞中显著下调。
星形胶质细胞与少突胶质细胞命运的获得依赖于BMP和Notch信号传导
我们的数据表明，细胞向星形胶质细胞或少突胶质细胞终末状态分化的命运决定受早期BMP信号传导调控，其中需要BMP抑制剂（BMPi）来限制星形胶质细胞分化；随后通过调节Notch信号传导，利用NOTCH抑制剂（NOTCHi）诱导偏向少突胶质前体细胞（OPC）的谱系，并促进后续的少突胶质细胞分化。为进一步支持这一模型，我们基于星形胶质细胞和少突胶质细胞比例均衡的混合胶质细胞分化方案，对单细胞RNA测序（scRNAseq）数据进行了更深入的分析。我们使用Palantir⁴³重建了通向这两种终末状态的发育拟时序。结果显示，细胞在不同的拟时序时间点逐步确定星形胶质细胞和少突胶质细胞命运（图5A、S5A）。两种终末状态分别以关键星形胶质细胞谱系标志物（包括CD44、GFAP和AQP4）的诱导表达，以及成熟少突胶质细胞标志物（如MBP、MOG和MAG）的诱导表达为特征（图5B、S5B）。对胶质细胞分化潜能因子NFIA的分析表明，其诱导表达对这两种谱系均至关重要。在拟时序约为0.5时，所有细胞均高表达NFIA，而不论其最终身份如何（图5C）。然而，少突胶质细胞谱系的特征是NFIA表达在初始诱导后急剧下降，而星形胶质细胞谱系则持续保持高表达直至终末状态。SOX9呈现类似模式，即在少突胶质细胞谱系中短暂诱导表达，而在星形胶质细胞谱系中持续表达。最后，OLIG2和PDGFRα的强烈诱导表达是少突胶质细胞谱系的特征，而仅呈低水平、短暂的
星形胶质细胞谱系内的表达（图5D）。在扩增方案中，OLIG2、PDGFRα及其他少突胶质细胞相关基因的诱导表达出现延迟，证实了Notch下调在少突胶质细胞谱系特化中的关键作用（图S5C、5D）。接下来，我们将分析重点放在胶质细胞亚型特化的分叉时间点，而非终末谱系重建。我们使用Genes2Genes⁴⁷比较不同命运之间基因水平的轨迹比对情况⁴⁷。我们构建了比对代价景观（其中，代价反映细胞间基因表达轨迹的差异程度），以揭示细胞类型组成与基因表达谱之间的关系（图5E）。每个分箱（共10个）对应于我们在分析中能够识别的转录程序多样性。热图显示，从少突胶质细胞的第5和第6分箱开始，其相对于星形胶质细胞的“代价”或转录程序差异显著增大，直至细胞完全确定各自的命运；这一过程推测发生在第10分箱附近，此时的代价达到最高值，表明两个谱系之间的转录差异最大（图5E）。通过映射相应scRNA-seq数据集的时间信息，我们观察到，第5和第6分箱主要对应于分化第22天（见颜色编码图例）。这些数据提示，在这一早期分化时间点，具备胶质细胞分化潜能的细胞已表现出朝向其中一种细胞命运的内在偏向（图5E）。沿拟时序的单基因表达图显示，第5分箱中BMP和Notch信号通路被诱导激活（分别对应SMAD1–4和HES1–5），并与星形胶质细胞谱系内NFIA和SOX9的诱导表达相关，而少突胶质细胞轨迹仅显示
这些通路的诱导程度有限且出现延迟（图5F）。这些数据进一步支持这样一种模式：同时抑制BMP和Notch信号通路是驱动少突胶质细胞谱系偏向及分化、同时减少星形胶质细胞命运定向的关键因素。
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图5.
星形胶质细胞与少突胶质细胞命运的获得取决于BMP和Notch信号传导。
（A）拟时序轨迹展示少突胶质细胞和星形胶质细胞的谱系进程。（B）基因表达趋势图界定了通过混合胶质细胞方案获得的两种不同胶质细胞群体。（C）NFIA表达在胶质细胞发育早期达到峰值，随着细胞定向为少突胶质前体细胞（OPC）而急剧下降，而在细胞分化为成熟的AQP4阳性星形胶质细胞时则急剧升高。（D）基因表达热图展示了参与少突胶质细胞与星形胶质细胞命运转换的主要转录因子的作用。（下）HES1基因表达趋势显示，NOTCH的激活或抑制分别与星形胶质细胞或少突胶质细胞的命运定向高度相关。（E）热图展示了基于细胞类型组成和基因表达的少突胶质细胞与星形胶质细胞基因水平轨迹比对（上），以及四个时间点上两种细胞类型轨迹之间的比对相似性（下）。（F）单基因表达趋势证实，在星形胶质细胞发育轨迹中，BMP和NOTCH通路上调，并与NFIA表达的稳步升高及持续维持高度相关。
单细胞RNA测序揭示，抑制NOTCH后可高效诱导少突胶质细胞谱系，且星形胶质细胞谱系混杂极少
纳入分析的全部数据集涵盖四个时间点（第12天、第22天、第32天和第43天）。前两个
三个条件下的时间点相同（Base D12–Base D22）。第32天的时间点涉及两种不同的处理方案：自第26天开始进行BMP抑制（BMPi；Base D32），以及自第26天开始联合进行BMP抑制和NOTCH抑制（NOTCHi；Mature D32）。第43天的时间点涉及三种不同的处理方案：第26–43天仅进行BMPi（Mixed glial D43）；第26–43天同时进行BMPi和NOTCHi（Mature D43）；以及第26–43天进行BMPi，但将NOTCHi延迟至第32–43天进行（Expansion D43）（图6A）。我们将四个时间点和各处理条件下的所有数据整合至同一张UMAP图中，并纳入了基于经典标志物人工审定的细胞类型注释（图6A、S6A–D）。单基因表达投影UMAP图基于pMN结构域、胶质细胞分化潜能状态、少突胶质前体细胞（OPC）身份、少突胶质细胞谱系定向，以及成熟和髓鞘形成型少突胶质细胞的标志物，展示了三种方案下少突胶质细胞谱系进程的发育特征（图6B）。基于单细胞数据的细胞类型定量分析显示，Mixed glial D43条件下星形胶质细胞约占40%，而Expansion D43和Mature D43条件下几乎完全不存在星形胶质细胞（图6C、S6C）。另一方面，在Mature D43条件下，少突胶质细胞约占总细胞数的65%（图6C、S6D），与我们基于流式细胞术的定量结果相近。Expansion D43条件下少突胶质细胞约占30%，Mixed glial D43条件下则约占20%。Expansion D43条件下OPC的比例最高（28%）（图6C），但Mature D32条件下也存在OPC富集，这支持了以下假设：对于富集表达PDGFRα的OPC样前体细胞而言，关键在于缩短NOTCHi的处理时长，而非特定地延迟NOTCHi的起始时间（图6D、E）。为进一步阐明
为比较谱系特异性转录谱的相对富集程度，我们将接受BMPi联合NOTCHi处理（分别于第26天和第32天）的条件与仅接受BMPi处理的条件分开分析。扩增组第43天（Expansion D43）与成熟组第32天（Mature D32）细胞的转录谱高度相似，进一步凸显了短期NOTCHi处理方案在诱导OPC样状态中的作用，并提示第26天和第32天的细胞具有相近的NOTCHi响应能力。另一方面，混合胶质组第43天（Mixed-glial D43）与成熟组第43天（Mature D43）呈现出明显不同的UMAP分布模式（图6D），前者富集AQP4、GFAP阳性的星形胶质细胞，后者则富集包括MBP和MOG在内的成熟少突胶质细胞标志物。扩增组第43天与成熟组第32天的细胞簇富集表达PDGFRα和SOX10，对应于OPC和未成熟少突胶质细胞谱系（图6E）。
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图6.
单细胞RNA测序显示，NOTCHi处理后可高效诱导少突胶质细胞谱系，且星形胶质细胞谱系混杂极少。
（A）合并后的UMAP图展示了三种方案（混合胶质、扩增和成熟）在第12、22、32和43天的细胞。左：三种方案在四个时间点的细胞分布。右：相应的人工整理细胞类型注释。（B）基因表达图展示了细胞从具备胶质分化潜能的细胞（OLIG2-NFIA-SOX9）向少突胶质祖细胞（PDGFRα-SOX10），再向成熟少突胶质细胞（MBP、MOG、MAG）的转变。（C）三种方案在第43天的星形胶质细胞、少突胶质细胞和OPC的定量分析。（D）UMAP图展示了各分化方案来源细胞的分布。（E）基因表达图展示了表征OPC、成熟少突胶质细胞和星形胶质细胞的经典标志物。（F）左：本研究体外数据的细胞类型注释。右：
CellTypist 的多数投票结果（概率 = 0.5）显示，我们的体外数据中的少突胶质细胞谱系与人类胎儿脊髓图谱高度吻合⁴⁸。
最后，我们将单细胞数据与公开可用的人类胎儿脊髓图谱⁴⁸进行了比较。我们使用 CellTypist⁴⁹，基于体内数据集训练了一个用于区分细胞类型的模型。为准确识别胶质细胞群体，我们对原始发表的注释进行了细化，因为其中未包含星形胶质细胞。此次细化纳入了公认的标志基因，使我们能够区分少突胶质细胞和星形胶质细胞，其中星形胶质细胞依据 GFAP 和 AQP4 等经典标志物进行鉴定（图 S6F）。
我们发现，在概率阈值大于 0.5 时，hPSC 来源的少突胶质细胞和星形胶质细胞与人类胎儿中对应的细胞高度匹配（图 6F、S6E），表明这两个谱系的细胞均与体内胎儿细胞图谱中的相应细胞类型高度一致。然而，我们发现，较早时间点的细胞状态（pMN 域和具备胶质细胞分化潜能的阶段）未能在胎儿数据中得到恰当体现。这可能是因为，这些体外 hPSC 来源的早期谱系反映了更早的发育阶段，而已发表研究⁴⁸所报道的受孕后 5–12 周的相应体内胎儿图谱并未充分涵盖这一阶段（图 6F）。
细胞在二维和三维（原生）环境中均早至第 42 天即出现髓鞘形成迹象
现有方案面临的主要挑战之一，是在无需进行长达数月的体外分化或体内移植的情况下，在基于 hPSC 的系统中获得髓鞘形成的证据。由于我们的分化方案采用三维类器官式分化模式，我们首先
评估了在这种原生环境中，细胞是否沿这些培养物中的 NF-H 阳性神经元轴突表达 MBP（图 7A）。接下来，我们在第 32 天将类器官解离，并以二维培养形式重新接种，以进一步表征细胞。我们在成熟（Mature）和扩增（Expansion）条件下使细胞在体外继续分化至第 42 天，结果显示，细胞呈分支状，表达 MBP 和 MOG 等成熟标志物，并沿神经轴突排列（图 7B、S7A）。在一项后续研究中，我们将细胞保留在类器官环境中直至第 42 天，随后进行解离并接种于二维培养体系，在第 52 天进行分析。我们观察到细胞形态复杂性及其与神经元的相互作用进一步增加（图 7C、S7B）。这些研究均基于将细胞保留在其原生体系中，其中神经元（大多具有运动神经元特征）作为分化的副产物出现（图 S6B）。然而，为进一步检验我们培养平台的实用性，我们建立了冷冻保存条件，以便在异源培养体系中检测冻存细胞群解冻后的髓鞘形成能力。我们利用双报告基因细胞系，在第 32 天分选出 SOX10+ 细胞，并立即使用程序降温仪将其冻存。与此同时，我们对多西环素诱导型 iNGN2 hPSC 细胞系进行分化，以快速生成皮质样神经元。在神经元分化约第 15 天时，我们将分选的 SOX10+ 细胞加入二维培养的 iNGN2 神经元上方，并继续共培养 15 天。我们观察到少突胶质细胞的形态复杂性进一步增加，单个细胞可接触多条轴突（图 7D，上排图）。重要的是，轴突（NF-H+）与 MOG 和 MBP 阳性纤维高度重叠，形成延伸的轴突
在我们的培养体系中，由少突胶质细胞包绕的结构模拟了髓鞘形成的早期步骤（图7D，下排图）。
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图7.
早至第42天，细胞在二维和三维（原生）环境中均表现出髓鞘形成的迹象。
（A）代表性共聚焦图像显示，在第42天，MBP染色广泛分布于整个类器官，而大多数细胞仍呈SOX10和OLIG2阳性（从左至右分别为10倍和20倍放大）。（B）在第32天解离细胞，接种后进行二维培养，并于第42天固定；可见MOG和MBP阳性的少突胶质细胞沿NF-H阳性的神经元轴突广泛分布（上图为63倍放大，下图为40倍放大）。（C）在第52天，少突胶质细胞呈现出更复杂的结构，胶质细胞突起沿神经元延伸至更远处（63倍放大）。（D）将此前分选的SOX10阳性细胞（第32天）与iNGN2来源的神经元共培养15天，并于第47天固定，可见沿NF-H阳性轴突延伸的复杂髓鞘网络（MOG和MBP）。比例尺：100 μm。
讨论
过去几年中，多种人多能干细胞（hPSC）来源的中枢神经系统（CNS）细胞谱系已逐步应用于转化研究，包括人类疾病建模和药物筛选⁵⁰–⁵⁵，以及细胞治疗⁵⁶–⁵⁸。然而，由于分化所需时间较长²⁰,²¹,⁵⁹，且这些方案产生的细胞培养物往往具有较高的异质性，少突胶质细胞的制备仍面临挑战，这些因素使其在包括临床级生产在内的转化应用中难以使用。
我们的研究采用与既往方案¹⁹类似的脊髓分化模式，重点研究少突胶质细胞的分化。在胎儿发育过程中，第一波少突胶质细胞的发育
发生于脊髓，尤其是腹侧区域，因此我们推测，该区域可能有助于最快地获得少突胶质细胞。然而，未来研究仍需证实，我们采用BMP抑制剂（BMPi）和NOTCH抑制剂（NOTCHi）的方案是否同样适用于在其他脑区发育的少突胶质细胞，包括前脑少突胶质细胞以及起源于更背侧区域的少突胶质细胞。我们采用类器官平台诱导少突胶质细胞，因为该平台可能更好地重现体内环境与组织结构，其中包括广泛的细胞间相互作用⁶⁰–⁶²以及被认为对少突胶质细胞发育和成熟至关重要的神经元活动⁴˒⁶³˒⁶⁴。
本研究的一项关键发现是鉴定出作用于源自pMN区域、具有双向分化潜能和胶质细胞分化能力的前体细胞的信号通路，这些通路控制星形胶质细胞与少突胶质细胞之间的谱系选择，并促进少突胶质细胞的分化和成熟。我们确定BMP和Notch信号是这些命运选择的关键调控因素，并发现同时抑制这两条通路是实现人多能干细胞（hPSC）来源少突胶质细胞快速、高效分化的有效策略。既往研究表明，BMP信号可促进星形胶质细胞分化，同时抑制神经发生⁴⁰。有研究提出，BMP激活是抑制胶质谱系限制性双潜能祖细胞向少突胶质细胞谱系发育的主要因素⁶⁵。一种可能的机制涉及BMP介导的OLIG1和OLIG2向细胞质转位，从而阻止参与少突胶质细胞分化的OLIG1/2依赖性基因的转录⁴¹。此外，对Notch的抑制
已有研究表明，该信号通路可抑制原代星形胶质细胞的发育⁶⁶，而其激活可抑制少突胶质细胞分化⁶⁷并诱导星形胶质细胞生成⁶⁸。我们的分化方案采用了基于类器官的培养体系。然而，初步数据表明，在二维少突胶质细胞分化条件下，双重抑制NOTCH和BMP信号通路同样有效。
我们还对整体分化方案进行了其他调整，使用视黄酸（RA）受体激动剂而非全反式视黄酸（ATRA）来激活视黄酸信号通路，从而更有效地诱导pMN谱系标志物表达，并减少细胞向更腹侧命运分化，包括降低FOXA2表达。一般认为，视黄酸信号通路的激活可通过拮抗来自脊索、方向相反的SHH梯度，使细胞维持在pMN区域内（图2A）；然而，RA激动剂与ATRA处理产生不同作用的机制仍有待确定：RA激动剂是否仅提高了通路激活的总体效力并避免了主要脱靶效应，抑或RAR与RXR激活之间的特定平衡至关重要。同样，我们观察到，与不添加FGF或使用FGF2处理相比，FGF18在维持OLIG2表达及双潜能前体细胞阶段方面具有更高效力，但我们尚未测试所有可能的FGF配体或不同水平的受体亚型激活，因此无法确定FGF18与FGF2之间的差异是源于FGFR激活模式的质的不同，还是仅为量的差异。最后，我们使用强效SHH信号通路抑制剂环巴胺，抑制少量混杂的FOXA2⁺腹侧底板样细胞，这些细胞可能更倾向于向星形胶质细胞分化。
我们的研究采用了单细胞RNA测序（scRNAseq）和轨迹
分析表明，在胶质细胞分化轨迹中，BMP与Notch信号通路之间存在紧密的时序联系，通路活化水平升高会促使细胞向星形胶质细胞命运分化。这些数据与既往研究一致，即Notch信号由振荡状态转变为持续高水平活化，标志着神经干细胞向星形胶质细胞定向命运的转变⁶⁹,⁷⁰；我们还通过证实BMP4能够高效诱导星形胶质细胞形成，进一步验证了这一联系。相反，我们发现，抑制BMP对于减少双潜能祖细胞向星形胶质细胞分化并保留其少突胶质细胞分化潜能至关重要。我们观察到Notch抑制（NOTCHi）的两种主要作用：早期抑制促进双潜能前体细胞转变为命运已定的髓鞘形成前少突胶质细胞，而持续抑制则发挥成熟开关的作用，促进少突胶质细胞的终末分化。尽管NOTCHi是促进神经前体细胞分化为神经元的一种公认策略⁴⁵，但其在少突胶质细胞分化中的作用尚不明确。然而，已有研究提出，可通过抑制NOTCH来促进原代少突胶质前体细胞（OPC）的少突胶质细胞分化和髓鞘形成⁷¹，其中包括针对脊髓OPC的研究⁷²以及经典的大鼠视神经研究⁶⁷。这些发现与本研究所报告的NOTCHi对少突胶质细胞谱系终末分化和成熟的作用一致。在本研究中，NOTCHi在早期驱动双潜能前体细胞向OPC分化的作用十分稳健，但其机制尚不十分清楚，因为一些体内研究报道，Notch信号对OPC的诱导具有正向调控作用，例如在斑马鱼中，
Delta-Notch 信号传导是脊髓少突胶质细胞命运指定所必需的⁷³。
我们用于获得三种不同胶质细胞产物的模块化策略，有望支持转化医学中的广泛应用。成熟少突胶质细胞方案（持续抑制 NOTCH）可用于髓鞘形成相关检测，以及旨在促进髓鞘形成的药物筛选。相比之下，扩增条件（短期抑制 NOTCH）可产生具有扩增能力的 SOX10/PDGFRα 祖细胞，适用于未来的细胞治疗研究；与 O4⁺ 非增殖性少突胶质细胞相比，这些尚未成熟、处于细胞周期中但已完成谱系定向的细胞，可能更有利于移植后的植入和广泛迁移。最后，混合胶质细胞方案（不抑制 NOTCH）可产生由少突胶质细胞和星形胶质细胞共同组成的异质性细胞群。这种混合胶质细胞群可作为星形胶质细胞和少突胶质细胞的来源，用于与神经元构建三元共培养体系，或与神经元及小胶质细胞构建四元共培养体系，以开展人类疾病建模。混合胶质细胞方案的一项主要优势是能够快速获得少突胶质细胞，同时也能获得 AQP4⁺ 星形胶质细胞。AQP4 是鉴定真正星形胶质细胞最具特异性的标志物之一⁷⁴，而在目前大多数快速星形胶质细胞分化方案中，其表达并不充分⁷⁵。
我们开发了一种简便、快速且可靠的方案，利用成分明确的外源性生长因子和小分子生成少突胶质细胞，无需表达任何转基因。本研究有望推动人少突胶质细胞在更广泛的干细胞与神经科学研究领域中的应用。尤其是，本研究可能有助于开发新的药物和细胞治疗策略，用于治疗多种脱髓鞘疾病，例如多发性
硬化症、多系统萎缩（MSA）、遗传性脑白质营养不良、放射治疗／化学治疗诱导的脱髓鞘（可导致显著且严重影响日常功能的认知障碍），以及年龄相关的中枢神经系统脱髓鞘。
局限性
尽管我们证明了成熟少突胶质细胞能够快速、高效地生成，但我们尚无法确切断言，这些细胞能够在本研究的培养体系中迅速为神经元形成髓鞘。我们展示了MOG/MBP阳性髓鞘纤维与NF-H阳性轴突在空间上的邻近关系，但在这些早期分化阶段获得的初步电子显微镜图像并未提供髓鞘包裹的确凿证据⁷⁶，未来可能需要开展体内移植研究，以评估这些细胞形成髓鞘的全部潜能。
数据可用性
本研究生成的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集已通过Annotare提交至ArrayExpress，登录号为E-MTAB-16931。这些数据将在经同行评审的论文发表后公开。
作者贡献
L.S.和A.E.构思并设计实验，分析和解释数据，并撰写论文。A.E.进行了类器官分化、成像实验、流式细胞术实验及单细胞RNA测序分析。S.P.参与了早期构思、研究设计及数据解释。J.J.为早期实验方案开发提供了专业指导，并参与了研究设计。R.M.W.为单细胞RNA测序样本制备提供了技术支持，并为类器官分化提供了专业指导。V.D.B.为单细胞分析提供了专业指导和反馈。Y.W.和T.Z.构建了本研究全程使用的SOX10-GFP/OLIG2-tdTomato双报告细胞系。
利益声明
L.S.是一名联合创始人、科学顾问，并持有
获得了BlueRock Therapeutics的研究资助。L.S.是DaCapo Brain Science的联合创始人兼科学顾问。L.S.和A.E.是纪念斯隆凯特琳癌症中心拥有并提交的一项专利申请的发明人，该申请基于本文所述的分化技术。
方法
细胞系
人多能干细胞［hPSCs；WA09（H9；46XX）、WA01（H1；46XY）、H9背景的SOX10-GFP-OLIG2-tdTomato-H2B以及MSKSRF01］在玻连蛋白（VTN-N，Thermo Fisher，#A14700）包被的6孔板中培养，使用添加了端锚聚合酶抑制剂XAV（#N/A）的Essential 8培养基（Life Technologies，#A1517001）。hPSCs每3–4天使用EDTA传代一次，实验使用第5–40代的hPSCs。如既往报道²⁸所述，通过连续进行CRISPR/Cas9介导的同源定向修复（HDR）构建H9 SOX10-GFP/OLIG2-tdTomato双报告细胞系（补充图1A）。通过电穿孔将靶向OLIG2基因座的sgRNA与供体质粒共同导入经验证的SOX10-GFP报告细胞系⁷⁷，从而引入OLIG2-tdTomato报告系统；该供体质粒含有P2A-H2B-tdTomato表达盒，其后连接一个两侧带有loxP位点的新霉素抗性表达盒（loxP-PGK-Neo-loxP）。
采用新霉素（G418）进行筛选，并通过PCR和Sanger测序鉴定正确靶向的双敲入克隆。通过电穿孔将表达Cre的质粒（1 µg）导入经确认的双敲入克隆，利用Cre介导的重组去除药物筛选表达盒。通过PCR和Sanger测序验证切除成功（补充图1B）。按照既往所述方法²⁸˒⁷⁸，利用CRISPRa介导的基因激活进一步验证两个报告等位基因的表达。简而言之，通过电穿孔将SAM-TET1系统及靶向SOX10和OLIG2的sgRNA导入
在双报告基因细胞系中瞬时激活内源性基因表达。电穿孔后48小时检测到GFP和tdTomato荧光（补充图1C）。
定向分化为脊髓少突胶质细胞（OLs）
将人多能干细胞（hPSCs）在室温下用EDTA处理5分钟，解离为较小的细胞团块，并以每孔10,000个细胞的密度接种于96孔V形底低吸附培养板（S BIO PrimeSurface #MS-9096VZ），使用含10 μM ROCK抑制剂（Y-27632，R&D Systems #1254）的Essential 6培养基（Life Technologies #A1516401）。随后将培养板以1100 rpm离心2分钟，完成分化第−1天的操作。次日，将培养基更换为含2 mM L-谷氨酰胺、250 nM LDN（Stemgent #04-0074-02）、10 μM SB431542（R&D Systems #1614）、3 μM CHIR99021（R&D Systems #4432）及100 μM抗坏血酸（AA；Sigma #4034-100g）的Neurobasal（Life Technologies）/N2（Stem Cell Technologies）/B27（Life Technologies）培养基，此后每日换液，直至第6天。第6天，将新形成的类器官从96孔V形底培养板转移至10 cm培养皿中，使用在前述培养基中添加2 μM SAG（Selleck #S6384）、0.2 μM RXR激动剂（Tocris Bioscience #5920）及0.25 μM RAR激动剂（Tocris Bioscience #3505）的培养基进行培养。每日换液，直至第12天。第12天，将培养基更换为添加20 ng/ml BDNF（R&D #248-BD）、20 ng/ml GDNF（Peprotech #450-10）、100 μM AA（Sigma #4034）、50 ng/ml FGF18（Peprotech #100-28）、20 ng/ml PDGF-AA（R&D #221-AA-100）、2 μM SAG（Selleck #S6384）、0.2 μM RXR激动剂（Tocris Bioscience #5920）及0.25 μM RAR激动剂（Tocris Bioscience #3505）的Neurobasal/B27/L-Glu培养基。每隔一天换液一次，直至第22天。在第16—18天，使用精密针头（BD #305106）将类器官切分为4小块，并取相当于一个10 cm培养皿培养量的类器官
转移至两个新培养皿中，使用与前述相同的培养基。第22天，撤去GDNF、SAG、RXR和RAR激动剂，并在小分子混合物中加入5 μM环巴胺（cyclopamine，Selleck #S1146）。此后每隔一天更换一次培养基，直至第26天。第26天，在培养基中加入2 μM DMH1（Tocris Bioscience #4126）和10 μM DAPT（R&D #2634），持续培养至第32天，期间每隔一天更换一次培养基。第32天，将培养基更换为补充有20 ng/ml BDNF（R&D #248-BD）、100 μM AA（Sigma #4034）、2 μM DMH1（Tocris Bioscience #4126）和10 μM DAPT（R&D #2634）的Neurobasal/B27/L-Glu培养基，持续培养至第42天及以后，期间每2–3天更换一半培养基。第42天，使用木瓜蛋白酶解离系统（Papain Dissociation System，Worthington Biochemical Corporation #LK003150）解离类器官1小时，并通过以下方式用于后续应用和/或质量控制：1. 将单细胞以300,000个细胞/cm²的密度重新接种于96孔板中，培养基为补充有20 ng/ml BDNF（R&D #248-BD）、100 μM AA（Sigma #4034）、2 μM DMH1（Tocris Bioscience #4126）、10 μM DAPT（R&D #2634）和10 μM ROCK抑制剂（Y-27632，R&D Systems #1254）的Neurobasal/B27/L-Glu培养基；或2. 采用荧光激活细胞分选术（FACS）分析O4阳性细胞群（操作方法见下文）。
免疫组织化学
在室温下，使用溶于DPBS的4%多聚甲醛（PFA）（Affymetrix #MFCD00133991）固定细胞12分钟。随后用DPBS++洗涤细胞。然后用0.1% Triton X-100对样品进行通透处理，并用含10%正常山羊血清（NGS）、1%牛血清白蛋白（BSA）和0.1% Triton X-100的DPBS++进行封闭。随后，将样品置于含10% NGS、1% BSA和0.1% Triton X-100的DPBS++配制的一抗溶液中，在4°C下轻柔摇动孵育过夜。次日，用DPBS洗涤后，将样品与偶联Alexa Fluor 488、555、647或750（Thermo Fisher）的二抗孵育。
在含10%正常山羊血清（NGS）、1%牛血清白蛋白（BSA）和0.1% Triton X-100的DPBS++中按1:400稀释，于室温下轻轻摇动孵育30分钟。随后用DPBS++洗涤样本，并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma，#D9542）复染。使用蔡司倒置荧光显微镜和徕卡STELLARIS共聚焦显微镜采集图像。免疫荧光染色使用以下抗体：山羊抗FOXA2（1:200，R&D）、大鼠抗MBP、大鼠抗PLP1（1:100）、兔抗MOG（1:300）、小鼠抗SOX9（1:100）、小鼠抗SOX10（1:100）、兔抗OLIG2（1:500）、小鼠抗OLIG2（1:100）、小鼠抗NKX2_2（1:100）、兔抗NFIA（1:500）、鸡抗NFH（1:500）、兔抗GFAP（1:2000）和小鼠抗ISLET1（1:100）。使用偶联Alexa Fluor-488、Alexa Fluor-555、Alexa Fluor-647或Alexa Fluor-750荧光染料的山羊源及驴源抗小鼠、抗山羊、抗兔或抗鸡二抗（1:400，Life Technologies）。细胞核用DAPI复染。
流式细胞术
使用木瓜蛋白酶解离系统（Worthington Biochemical Corporation，#LK003150）将类器官解离1小时。将单细胞悬液置于FACS缓冲液（DMEM/F12 + 2% FBS + 0.2 μM EDTA + ROCK抑制剂）中，在冰上用APC/PE偶联的O4抗体或APC偶联的O1抗体染色45分钟；每10万个细胞悬浮于100 μL FACS缓冲液中，两种抗体的用量分别为10 μL和50 μL。用FACS缓冲液洗涤细胞三次，随后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma，#D9542）复染。将细胞通过30 μm滤网（Sysmex，#04-004-2326），并使用Cytek Aurora流式细胞仪进行分析。
荧光激活细胞分选（FACS）
进行细胞分选时（第32天分选SOX10，第42天分选O4），使用木瓜蛋白酶解离系统（Worthington Biochemical
Corporation，#LK003150）。细胞用 FACS 缓冲液洗涤三次，随后用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma，#D9542）复染。细胞经 30 μm 滤网（Sysmex，#04-004-2326）过滤后，在 FACS 缓冲液中使用 BD FACSymphony S6 或 FACSDiscovery S8 细胞分选仪进行分选，并收集于 5 mL 聚苯乙烯管中。将分选后的细胞离心沉淀，并用添加了 20 ng/mL BDNF（R&D，#248-BD）、100 μM AA（Sigma，#4034）、2 μM DMH1（Tocris Bioscience，#4126）、10 μM DAPT（R&D，#2634）和 10 μM ROCK 抑制剂（Y-27632，R&D Systems，#1254）的 Neurobasal/B27/L-Glu 培养基洗涤两次。计数后，将细胞接种用于不同的下游实验，或以 5 × 10⁵ 个细胞/mL 的密度冻存于 STEM-CELLBANKER 中。使用程序降温仪（ThermoFisher）对细胞制品进行冷冻保存。
体外髓鞘形成实验
按照已发表的方案，在 μ-Plate 96 Well Square 方孔板（Ibidi，#89626）中制备 iNGN2 神经元，用于高分辨率显微成像。在神经元分化第 9–10 天，当神经突已延伸遍布整个培养体系时，将此前冻存的 SOX10⁺ 少突胶质细胞解冻，并以 1.8 × 10⁵ 个细胞/cm² 的密度接种于正在形成的神经元上，培养基为添加了 20 ng/mL BDNF（R&D，#248-BD）、100 μM AA（Sigma，#4034）、2 μM DMH1（Tocris Bioscience，#4126）、10 μM DAPT（R&D，#2634）和 10 μM ROCK 抑制剂（Y-27632，R&D Systems，#1254）的 Neurobasal/B27/L-Glu 培养基。每 2–3 天更换一半培养基，新加入的培养基不含 ROCK 抑制剂。15 天后，用 1×PBS 洗涤细胞，并用 4% 多聚甲醛固定。
单细胞 RNA 测序
类器官用 1×PBS 洗涤一次后，使用木瓜蛋白酶试剂盒（Worthington，#LK003150），在 37 °C、5% CO₂ 条件下置于轨道摇床上进行酶解，持续 60 min。酶解后，通过机械解离将类器官分散为
使用1,000 µL移液器吸头反复吹打，将其分散为单细胞。按照制造商说明终止木瓜蛋白酶活性并洗涤细胞。为实现样本多重化，对每个时间点的2–4个样本分别使用细胞哈希（Cell Hashing）抗体进行染色。简而言之，将单细胞悬液与human TruStain FcX（BioLegend，#422301）在室温下孵育10 min，以封闭Fc受体，随后使用TotalSeq™细胞哈希抗体（例如TotalSeq™-A0251抗人Hashtag 1抗体，BioLegend，#39460）在冰上染色30 min。使用细胞染色缓冲液（BioLegend，#420201）洗涤细胞3次，经30 µm细胞滤网过滤后，采用台盼蓝排斥法，使用Countess II自动细胞计数仪（Thermo Fisher Scientific）进行计数。随后将细胞合并至一个低蛋白吸附的1.5 mL微量离心管中，并重悬于含0.04% BSA的1× PBS中。质量控制后，将30,000–60,000个细胞加载至Chromium Next GEM Chip G（10x Genomics，#1000120）。按照制造商方案，使用Chromium Next GEM Single Cell 3′ Reagent Kit v3.1（10x Genomics，#1000268）完成乳液凝胶珠（GEM）生成、逆转录、cDNA扩增及文库制备。cDNA扩增采用11–12个PCR循环，取30–240 ng扩增后的cDNA进行文库构建，采用10–16个PCR循环。将带索引的文库按等摩尔浓度混合，使用NovaSeq S1或S4试剂盒（100或200个循环），在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端28/88 bp测序。
单细胞数据分析
使用Cell Ranger（v6.1.2）对原始测序数据进行解复用，并比对至人类GRCh38参考基因组。计数矩阵
被导入 Python（v3.12），在 Jupyter Notebook（v7.0.8）中使用 Scanpy 进行下游分析。保留至少表达 500 个基因且线粒体基因来源计数占比低于 10% 的细胞用于下游分析。剔除在少于 3 个细胞中表达的基因。针对各数据集分别应用额外的质量控制筛选，以去除低质量细胞和技术伪影。对基因表达值进行逐细胞归一化、对数转换和标准化，未显式筛选高变基因。在完整基因表达空间中进行主成分分析（PCA），并将所得主成分用于下游邻域图构建。为校正样本、时间点或实验条件之间的批次效应，在指定情况下采用批次平衡 k 近邻（BBKNN）整合方法。使用整合后的邻域图，通过均匀流形近似与投影（UMAP）进行降维和可视化。采用 Leiden 算法进行聚类，并根据所研究的生物学问题调整分辨率参数。在部分分析中，使用 Palantir 进行轨迹推断，以模拟细胞分化动态及其拟时序排列。在这些分析中，根据具体情况将 Palantir 应用于整合或未整合的嵌入表示，并基于扩散映射和概率性细胞命运分配推断谱系进程。进一步使用 genes2genes 探索基因调控动态及基因间的时序关系，从而识别与谱系转变和成熟状态相关的转录程序。作为最后一项比较分析，
CellTypist 被用作一种监督式机器学习框架，通过将待分析的单细胞转录组投射至参考数据集，为细胞赋予概率性细胞类型标签。该方法用于将体外获得的细胞群体与已发表的人胎儿单细胞参考数据进行比较。当预测类别概率 ≥ 0.5 时，才将相应的细胞类型归属纳入考量，且这些归属结果不用于主要的细胞类型注释。
定量与统计分析
使用 FIJI（ImageJ）对免疫荧光图像进行手动定量。使用 GraphPad Prism 10 进行统计分析。用于统计分析的实验均包含至少三个来自独立分化实验的独立生物学重复。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。统计学显著性表示如下：P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001、P < 0.0001。使用 FlowJo（v10）分析流式细胞术数据并进行可视化。使用 Jupyter Notebook（v7.0.8）中的 Scanpy 进行单细胞分析及可视化。
补充图图注
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补充图 1.
H9 SOX10-GFP/OLIG2-tdTomato 双报告细胞系的构建与验证。
（A）依次构建 H9 SOX10-GFP/OLIG2-tdTomato 双报告细胞系的示意图。（B）经 Cre 介导切除药物筛选盒后，对双报告克隆进行 PCR 验证。（C）将 SAM-TET1 系统及靶向 SOX10 和 OLIG2 的 sgRNA 电转染至 H9 SOX10-GFP/OLIG2-tdTomato 细胞后 48 小时的荧光图像。图中显示 tdTomato（OLIG2）、GFP（SOX10）及合并图像。BF，明场。比例尺，10 μm。
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补充图 2.
验证
三种分化方案中的少突胶质细胞身份。
(A) 代表性免疫荧光图像显示，采用 (A) 扩增方案和 (B) 混合胶质细胞方案培养至第42天的细胞大多呈OLIG2、SOX10和髓鞘碱性蛋白（MBP）阳性。比例尺：100 μm。
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补充图3。
RA激动剂、FGF18和SHH抑制剂使细胞维持在pMN域内，限制FOXA2阳性底板细胞的增殖和运动神经元的发育。
(A) 第12天，OLIG2-NKX2-2强表达，同时存在一个不表达SHH等常见底板细胞标志物的FOXA2阳性中间祖细胞群（左）。至第22天，单基因表达UMAP图显示，FOXA2阳性细胞群被完全抑制，而pMN域身份得以保留。(B) 使用环巴胺抑制内源性SHH，并去除视黄酸激动剂，可限制ISLET1+运动神经元的发育，同时在整个分化过程中维持OLIG2的高表达（C）。(D) 至第22天，细胞呈OLIG2和OLIG1强阳性；至第32天，其中部分细胞由少突胶质前体细胞（OPC）转变为SOX10阳性的定向分化少突胶质细胞（E）。比例尺：100 μm。
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补充图4。
双重抑制NOTCH和BMP可促进多个人多能干细胞系中的少突胶质细胞成熟，而早期抑制NOTCH则可促进处于细胞周期中的PDGFRα阳性细胞群扩增。
(A) FACS图显示，采用成熟方案后，各诱导多能干细胞（iPSC）系和胚胎干细胞（ESC）系中O4+细胞的比例；该方案在第26天至第42天同时抑制BMP和NOTCH。(B) 在扩增方案中延迟抑制NOTCH，可使SOX10+细胞群扩增，同时使其缓慢转变为表达O4的更成熟少突胶质细胞。(C) 代表性免疫荧光图像
显示，在第26天至第32天接受早期NOTCH抑制剂（NOTCHi）处理，随后接受DMH1、FGF18和20 ng/mL效力更强的人重组PDGF-AA蛋白（R&D #11564-PA）处理的类器官中，PDGFRα⁺增殖细胞群发生扩增（CHO条件与扩增条件比较）。（D）成熟方案和混合胶质细胞方案中MBP⁺和PLP1⁺细胞的定量分析。比例尺：100 μm。
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补充图5.
谱系轨迹分析揭示了三种方案中胶质细胞发育随时间变化的差异。
（A）使用Palantir对我们四个时间点的少突胶质细胞和星形胶质细胞进行轨迹重建（左）。概率条形图显示，第22天和第32天SOX9-NFIA双阳性细胞，以及第32天NFIA-PDGFRα双阳性细胞分化为少突胶质细胞或星形胶质细胞的可能性（右）。（B）基于Palantir的聚类显示，成熟方案、扩增方案和混合胶质细胞方案中经典少突胶质细胞及星形胶质细胞标志物的表达情况。（C）将NOTCHi处理推迟至第26天至第32天，可使少突胶质细胞分化过程中的各发育步骤整体延迟。
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补充图6.
单细胞RNA测序数据鉴定出三种方案中的少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元，它们与人胎儿数据中的相应细胞类型高度匹配。
基因表达图显示脊髓特征标志物（A）、神经元标志物（B）、少突胶质细胞标志物（C）和星形胶质细胞标志物（D）。（E）对Li等人⁴⁸发表的人胎儿脊髓数据集中的少突胶质前体细胞（OPC）、少突胶质细胞和星形胶质细胞进行表征，并将CD44-GFAP-APQ4细胞簇重新注释为“Astro”（星形胶质细胞）。（F）点图（左）显示CellTypist标签转移结果，突出展示了我们体外数据中的细胞与其中细胞类型高度匹配的概率及其相对比例
已发表的人类胎儿脊髓图谱。箱线图（右）显示各已注释细胞类型的 CellTypist 少突胶质细胞预测评分，表明匹配概率极高。
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补充图7。
扩增方案和混合胶质细胞方案中成熟少突胶质细胞的鉴定。
扩增方案的代表性免疫荧光图像显示，第42天（A）和第52天（B）出现 MOG 和 MBP 阳性的少突胶质细胞，并与 NF-H 阳性的神经元轴突紧密排列。（C）混合胶质细胞方案中 MBP 阳性少突胶质细胞和 GFAP 阳性星形胶质细胞的表征。比例尺：100 μm。
致谢
我们感谢 Studer 实验室成员提供的有益讨论。感谢 Elizabeth Calder 就 RAR 和 RXR 激动剂的使用提供具体建议。感谢 MSK 的 Ronan Chaligne 和单细胞分析创新实验室（SAIL）团队协助进行单细胞文库制备，并就转录组学方法和细胞标签多重化提供宝贵建议。感谢 MSKCC 的整合基因组学平台（IGO）、分子细胞学核心设施和光学显微镜仪器集群。本项目的部分经费由美国国立精神卫生研究所项目 R01MH135403、美国国立神经疾病与卒中研究所项目 R01NS128087，以及美国国立癌症研究所中心资助项目 P30CA008748 提供。A.E. 获得 Dompé 奖学金的部分资助，V.D.B 获得 Kravis Wise 奖学金资助。
已声明的资助方信息
美国国立精神卫生研究所
，R01MH135403
美国国立神经疾病与卒中研究所
，R01NS128087
美国国立癌症研究所
，P30CA008748
Kravis Wise 奖学金
Dompé（意大利），
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