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人类胎盘由滋养层细胞构成，这些细胞相互融合、分泌激素并侵入子宫；上述过程中的缺陷会导致子痫前期等妊娠疾病。由于细胞间融合和激素分泌本质上是非细胞自主过程，传统的混合型 CRISPR 筛选一直难以揭示其调控因子。在此，我们在具有融合能力的 BeWo 滋养层细胞中开发了一种阵列式 CRISPR 筛选方法，对 412 种基因扰动的细胞融合和 hCG 分泌进行同步定量。筛选结果表明，滋养层分化的这两项标志性功能在遗传学上可以彼此分离。我们在滋养层干细胞、类器官和胎盘组织中对最显著的新候选基因 ZBTB10 进行了表征，发现 ZBTB10 是人类滋养层分化的必需调控因子。ZBTB10 对侵袭性绒毛外滋养层的分化至关重要，并支持合体滋养层成熟，因此它是一种跨谱系调控因子，能够激活并抑制不同的滋养层命运程序。综上，这些发现提供了一个遗传学研究平台，并从表型层面解析了调控网络如何控制人类胎盘发育。
表型 CRISPR 筛选鉴定出 ZBTB10：人类滋养层细胞分化的新型调控因子 | bioRxiv
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表型 CRISPR 筛选鉴定出 ZBTB10：人类滋养层细胞分化的新型调控因子
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Meagan N. Esbin、Rituja Bhowmik、Hanqin Li、Andrew Cearlock、Jiayu Chen、Tomy Tran、Stephen A. McCartney、Ian A. Glass、出生缺陷研究实验室（BDRL）、Dirk Hockemeyer、Xavier Darzacq、Fyodor Urnov、Robert Tjian、Min Yang
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.06.29.734890
Meagan N. Esbin¹
¹ 华盛顿大学妇产科，西雅图，美国
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通讯联系：
mesbin{at}uw.edu
yangmin{at}uw.edu
Rituja Bhowmik²
² 加州大学旧金山分校 Weill 神经科学研究所 Edward and Pearl Fein 记忆与衰老中心，旧金山，美国
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Hanqin Li³
³ 创新基因组学研究所，伯克利，美国
⁴ 加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系，伯克利，美国
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Andrew Cearlock¹
¹ 华盛顿大学妇产科，西雅图，美国
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Jiayu Chen¹
¹ 华盛顿大学妇产科，西雅图，美国
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Tomy Tran
3
创新基因组学研究所
，美国伯克利
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Stephen A. McCartney
1
华盛顿大学妇产科学系
，美国西雅图
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Ian A. Glass
5
华盛顿大学儿科学系
，美国华盛顿州西雅图
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5
华盛顿大学儿科学系
，美国华盛顿州西雅图
Dirk Hockemeyer
3
创新基因组学研究所
，美国伯克利
4
加利福尼亚大学伯克利分校分子与细胞生物学系
，美国伯克利
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Xavier Darzacq
4
加利福尼亚大学伯克利分校分子与细胞生物学系
，美国伯克利
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Fyodor Urnov
3
创新基因组学研究所
，美国伯克利
4
加利福尼亚大学伯克利分校分子与细胞生物学系
，美国伯克利
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Robert Tjian
4
加利福尼亚大学伯克利分校分子与细胞生物学系
，美国伯克利
6
霍华德·休斯医学研究所
，美国伯克利
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Min Yang
1
华盛顿大学妇产科学系 &
华盛顿大学妇产科学系，美国西雅图
7
Brotman Baty 精准医学研究所，美国西雅图
8
干细胞与再生医学研究所，美国西雅图
9
华盛顿国家灵长类动物研究中心，美国西雅图
10
华盛顿大学基因组科学系，美国西雅图
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通讯作者：
mesbin{at}uw.edu
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摘要
人类胎盘由滋养层细胞构成，这些细胞彼此融合、分泌激素并侵入子宫；这些过程发生缺陷会导致子痫前期等妊娠疾病。由于细胞间融合和激素分泌本质上属于非细胞自主过程，其调控因子一直难以通过传统的混合式 CRISPR 筛选加以研究。在本研究中，我们在具有融合能力的 BeWo 滋养层细胞中开展了阵列式 CRISPR 筛选，同时定量分析了 412 种基因扰动对细胞融合和 hCG 分泌的影响。筛选结果显示，滋养层分化的这两项标志性功能在遗传调控上彼此可分离。我们在滋养层干细胞、类器官和胎盘组织中对最显著的新候选基因 ZBTB10 进行了研究，发现 ZBTB10 是人类滋养层分化的关键调控因子。ZBTB10 是侵袭性绒毛外滋养层分化所必需的，并支持合体滋养层成熟；这表明它是一个跨谱系调控因子，能够分别激活和抑制不同的滋养层命运程序。总之，这些发现提供了一个遗传学研究平台，并通过表型解析揭示了调控网络如何控制人类胎盘发育。
引言
胎盘是
胎盘是维持人类妊娠的关键性暂时器官。¹˒² 人类胎盘的发育依赖细胞滋养层细胞（CTB；人类胎盘中的祖细胞群）分化为两种下游特化细胞谱系：绒毛外滋养层细胞（EVT）侵入子宫并重塑螺旋动脉，从而为胎盘建立充足的血流；合体滋养层细胞（STB）则形成多核合胞体，覆盖胎盘绒毛，并在母胎界面介导营养物质交换、内分泌信号传导及屏障功能。³–⁵ 任一细胞谱系出现缺陷，都可能导致重大妊娠并发症，包括子痫前期、胎儿生长受限、着床失败和流产。⁶–¹²
在滋养层细胞谱系中，STB 经历一种极为特殊的分化过程：CTB 在分化过程中相互融合。细胞间融合促成胎盘合胞体的形成；该合胞体在整个妊娠期持续扩展，最终形成单层合体结构，足月时其中约含 600 亿个细胞核。¹³˒¹⁴ 在人类胎盘中，这一过程主要由合胞素-2（Syncytin-2；ERVFRD-1）驱动。合胞素-2 与相对细胞表面的受体 MFSD2A 结合，介导细胞融合。¹⁵–¹⁹ 与融合过程同步，STB 获得以内分泌功能为核心的特性，其中包括分泌 hCG。hCG 可刺激母体黄体产生孕酮以维持妊娠；研究还认为，hCG 可通过触发蛋白激酶 A（PKA）信号通路，激活融合机制上游的转录因子 GCM1，从而促进滋养层细胞融合。²⁰–²² 因此，细胞间融合和 hCG 分泌是合体滋养层分化的两项标志性特征。尽管人们通常认为二者密切耦联，相关研究……
采用单一遗传或药物扰动，分别在 BeWo 细胞（一种具有融合能力的绒毛膜癌滋养层细胞系）和人滋养层干细胞（hTSCs）中开展的研究，尚未就两者之间的关系达成共识。
10
,
19
,
23
–
29
阐明融合与内分泌分化在驱动机制上能否彼此分离，以及二者由哪些共同或不同的遗传程序驱动，或可为妊娠期合体滋养层功能障碍的特定方面提供检测和治疗的新途径。此外，明确调控 STB 功能的因素，也可能揭示更广泛的调控程序，阐明这些程序如何在胎盘发育过程中协调并平衡滋养层谱系的指定。
CRISPR 筛选已成为系统识别和表征细胞过程调控因子的有力工具，可用于
体外
和
体内
研究。
30
–
32
近年来，结合单细胞测序（如 CROP-seq、Perturb-seq）或基于成像的读数的 CRISPR 筛选改进方法，正大幅拓展基因型—表型分析的范围，使其不再局限于简单的存活率评估和基于荧光的分选。
33
–
35
然而，尽管这一领域已有进展且存在明确的生物学需求，能够形成合胞体的滋养层细胞仍给传统 CRISPR 筛选带来了独特挑战。融合和激素分泌本质上均为非细胞自主性表型，因此，假定读数具有细胞内在性的混合筛选方法并不适用于研究这些过程。少数可用于融合研究的筛选方法，要么要求融合能够在悬浮微液滴中迅速发生（例如病毒融合），要么通过过滤或表达具有毒性的分裂内含肽，从测序样本池中选择性去除已合胞化的细胞；这类方法会排除融合增强型表型，并且由于单个合胞体内的 sgRNA 混杂而大幅降低检测灵敏度。
36
–
38
最后，由于上述筛选方法均无法同时测量激素产生和细胞融合，既往滋养层研究一直依赖不具备高通量能力的候选基因策略。
为解决这一局限，我们开发了一种高通量、阵列式 CRISPR 筛选方法，利用 BeWo 细胞易于扩增且 Forskolin（FSK）诱导分化窗口较短的特点，对 412 个候选调控因子的滋养层细胞融合和 hCG 分泌进行同步定量。筛选结果显示，细胞融合和 hCG 产生主要受彼此不同的调控程序控制。值得注意的是，我们鉴定出转录因子 ZBTB10 是 STB 分化的新型调控因子。我们在具有生理相关性的人成滋养层干细胞、类器官和原代胎盘组织中系统表征了 ZBTB10 的作用，发现它既促进 STB 成熟，又是 EVT 分化所必需的。作为人滋养层分化的跨谱系调控因子，我们还发现，尽管不同物种的胎盘形成经历了进化分化，ZBTB10 在胎盘中的表达仍在真兽类哺乳动物中保守，这进一步凸显了其在胎盘侵袭中的重要性。
结果
基于 BeWo 细胞的可扩展阵列式 CRISPR 筛选将细胞间融合与 hCG 分泌相结合
合体滋养层的形成伴随人胎盘分化的两项标志性产出：细胞间融合和妊娠激素 hCG 的分泌。二者均以非细胞自主方式发挥作用，因此无法通过混合式遗传筛选进行检测。为系统解析其调控机制，我们在融合中的 BeWo 滋养层细胞中建立了阵列式 CRISPR 敲除筛选平台，通过高通量活细胞成像检测合胞体融合，并结合 ELISA 测量……
同一孔中的 hCG 分泌量（图 1A）。基于 BeWo 细胞的 RNA 测序数据，我们根据细胞融合过程中显著诱导表达的基因以及表达的转录因子，筛选出 412 个具有功能相关性的候选基因（图 1B、图 S1A）。该文库涵盖多种转录调控因子、膜蛋白及其他相关的滋养层细胞基因（图 S1C），每个基因靶向 1–3 条 sgRNA。每块板均设有阴性对照（非必需基因 TRAC、无 sgRNA，以及仅添加 Forskolin 的孔）和阳性对照（对 BeWo 细胞融合至关重要的 ERVFRD-1，以及同时参与融合和 hCG 产生的主调控转录因子 GCM1）10、16、39，并设有未分化的 DMSO 处理孔（图 S1B）。为建立一个可大规模测量细胞间融合及 hCG 分泌的 CRISPR 筛选平台，我们开发了一种共培养实验：将 GFP 和 mScarlet 标记的 BeWo 细胞按 50:50 的比例混合，通过核转染递送 Cas9 RNP 进行基因编辑，再用 Forskolin 诱导分化 48 小时，随后采用四通道活细胞共聚焦成像进行检测，并采集上清液以通过 hCG ELISA 测定 hCG（图 1C）。TIDE 分析证实，在可扩展的 96 孔板格式中，平均基因敲除（KO）评分约为 80%（图 S1D）。
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图 1.
用于检测细胞间融合和 hCG 分泌的阵列式 CRISPR 筛选示意图及对照。
A）具有配对读出指标的阵列式表型 CRISPR 筛选概览。
B）根据 Esbin 等人 2023 年对 Forskolin 诱导分化的野生型 BeWo 细胞与 DMSO 处理的 BeWo 细胞进行差异基因表达 RNA 测序所选出的 412 个候选靶基因。图中仅显示 Forskolin 处理的 BeWo 细胞中平均 RPKM > 10 且可由 Synthego 靶向的蛋白质编码基因（灰点），并以彩色标出纳入筛选的基因靶标。完整筛选内容
图 S1A 所示的方案。
C）筛选中对照（DMSO）组和 Forskolin 处理组孔的四通道原始成像数据示例。白色箭头标示同时呈 GFP 和 mScarlet 阳性的合胞体区域。
D）筛选中单个对照孔的配对测量示例。单个视野的分割叠加图显示：分割出的 GFP 阳性区域（青绿色）、分割出的 mScarlet 阳性区域（洋红色）、GFP 与 mScarlet 区域的重叠部分（橙色）、双阳性细胞核（黄色）及荧光细胞核总数（灰色）。各图下方显示计算所得的融合指数。底部展示筛选中对应单个孔的原始 hCG ELISA 吸光度值。
E）一个代表性亲本筛选板的原始融合指数测量值。各点表示三个成像板中每个孔的单次测量值。柱表示均值；误差线表示标准差。
F）一个代表性亲本筛选板的原始 hCG 测量值（ELISA 吸光度除以每孔细胞核数）。比例尺为 200 μm。
Forskolin 处理使融合指数从约 10% 升至约 40%，并使 hCG 分泌增加超过 10 倍，重现了合体滋养层分化过程。所有对照均呈现预期结果：ERVFRD-1 和 GCM1 缺失抑制细胞融合（TRAC 缺失无影响），而只有 GCM1 缺失抑制 hCG 分泌；两种情况下，指标均降至未分化 DMSO 对照组水平或更低（图 1D）。这些效应在技术重复和亲本孔之间均具有高度可重复性（图 1E、F；图 S1E、F）；即使尚未进行归一化，孔间三重复测量的相关性也很高（融合指数 R² 约为 0.9，hCG 约为 0.7；图 S2A）。阳性和阴性对照在融合指数和 hCG 指标上均表现出很高的精确度，且结果符合预期。
不同板组之间的检测结果存在一定变异（图 S1E、F）。为校正各板间整体分化效率的差异，我们采用抑制百分比策略对每块板进行内部归一化：以该板的 DMSO 孔（阴性对照）设为 0%，以 FSK/TRAC 孔（阳性对照）设为 100%；并将主要由死细胞构成的孔（荧光细胞占比 <45%）排除在分析之外（图 S2B–D）。
为在独立条件下评估实验的可重复性并验证筛选结果，我们在创新基因组学研究所（Innovative Genomics Institute）采用高通量机器人自动化技术，对 hCG 筛选进行了完整的生物学重复实验。对照组再次呈现预期结果，重复实验间的相关性较高（R² = 0.68–0.86，图 S3A–C）。采用相同的归一化方法和基于稳健 Z 分数 MAD ± 2 的命中判定标准后，我们发现两次筛选所得 hCG 命中基因存在显著重叠，其中 16 个重叠命中基因包括 GCM1、OVOL1、TFAP2C、ZBTB10 和 EGLN1，它们是调控 hCG 的主要候选基因（图 S3D）。综上，这些数据建立了一个定量且可重复的平台，可用于解析人类合体滋养层分化。
配对筛选鉴定出 ZBTB10 是滋养层分化的可分离调控因子之一
对全部 412 种扰动的融合与 hCG 进行联合分析显示，尽管二者均为合体滋养层分化的标志性特征，但在遗传调控上可以彼此分离：大多数基因敲除组聚集在对照组附近；CGB 激素基因敲除会降低 hCG 水平而不影响细胞融合；ERVFRD-1 缺失则会降低细胞融合而不影响 hCG 水平；此外，命中基因分布于融合—hCG 图谱的四个象限中（图 2A）。这使我们能够鉴定分别影响两种表型的基因。采用稳健 |MAD Z 分数| ≥ 2 的阈值后，我们……
鉴定出117个可能调控STB分化的因子，其中86个命中细胞间融合表型，45个命中hCG分泌表型，23个命中表型分化评分（图2B）。在单张图像中，大效应敲除呈现一致的融合变化，验证了命中判定的准确性（图2C、S4A）。由于分化伴随着协同的形态变化，我们采用Cell Painting方法分析活细胞成像数据中的数百种亚细胞特征，并将每个孔投射到一个主成分轴上。该轴可区分DMSO对照与FSK/TRAC对照，据此计算无偏的分化评分，以反映表型向分化方向或远离分化方向的变化（图2D、E；S4C–G）。在本次筛选中，已知调控因子的表现符合预期，验证了筛选结果：GCM1在全部3种表型中均命中；ERVFRD-1仅在融合表型中命中；关键转录调控因子OVOL1和TFAP2C则在两种表型中均呈现显著效应。⁴，⁴⁰–⁴³
综合三种读出指标，我们鉴定出对分化影响最显著的6个候选因子：GCM1、OVOL1、ZBTB10、STK40、EGLN1和ZNF292（图2F）。敲除已知融合抑制因子STK40后，观察到显著的功能获得表型，融合和hCG水平均升高（图2A）。令人意外的是，ZBTB10是一种锌指和碱性螺旋-环-螺旋转录因子，此前尚无证据表明其参与胎盘发育⁴⁴；然而，它成为细胞间融合中效应最强的功能缺失命中因子。敲除ZBTB10后，hCG水平也降至已分化对照组的36%（图2A）。GCM1、OVOL1和STK40是已确立的合体滋养层分化调控因子，而ZBTB10、EGLN1和ZNF292此前尚未在这一背景下得到表征。
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图2.
高通量阵列式…
筛选揭示了调控细胞间融合、激素分泌和分化表型的因子。
A）筛选中每孔 hCG 分泌量和细胞间融合率的抑制率归一化测量值。每块板上均设置的对照以彩色菱形标示。分别针对 hCG 分泌、细胞间融合或分化评分独立判定的命中基因（±2 MAD Z 分数）以蓝色显示。
B）按融合指数、hCG 分泌量和分化评分排序的结果，其中命中值（蓝色点）及阈值（±2 MAD Z 分数；灰色虚线）均有标示。
C）示例基因敲除后的细胞间融合表型。单个视野的分割叠加图显示：分割后的 GFP⁺ 区域（青绿色）、分割后的 mScarlet⁺ 区域（洋红色）、GFP 与 mScarlet 区域的重叠部分（橙色）、双阳性细胞核（黄色）以及荧光细胞核总数（灰色）。比例尺为 200 μm。
D）Cell Paint 分析及分化评分计算概览。利用 4 个独立通道（上：明场、DAPI、GFP、mScarlet）和 5 个分割后的细胞区室（下：细胞核、核环、细胞质、细胞膜、细胞），计算基于形态、纹理和强度的参数，以实现全面表型分析。
E）对标注了 Cell Paint 表型的孔进行主成分分析，并按 DMSO（红色）和 FSK/TRAC（橙色）对照着色。
F）各表型判定命中基因的维恩图。
G）三种表型中均被判定为命中的基因的 Z 分数热图（温莎化处理至 ±10），并采用无监督聚类分组。
H）筛选中测得的不同表型对应的单基因 Z 分数雷达图（温莎化处理至 ±5）。上方雷达图显示各簇中所有基因的平均值，下方展示单个基因示例。DAPI 总和 = 核内 DAPI 强度总和，
核区面积 = 核面积；接触 = 核-核接触面积百分比。
I）
117 个 CRISPR 命中基因的 STRING 网络（仅显示基于实验和数据库信息的相互作用；置信度相互作用评分 >0.40）。未连接的节点不予显示。使用 K-means 聚类对相关通路进行分组（聚类数 = 9），并按聚类着色；图例标出了三个主要聚类（基因数 > 3）。
为按功能对这些调控因子进行分类，我们对三种表型中的命中基因进行了无监督聚类，识别出四类：1）核心激活因子，其敲除会抑制 hCG 分泌和细胞-细胞融合；2）单一表型激活因子，仅影响一种检测指标；3）hCG 抑制因子，其敲除会提高 hCG 水平；4）融合抑制因子，其敲除会提高融合效率（图 2G-H）。令人欣慰的是，该分类识别出了已知滋养层调控因子的功能，包括 TFEB（融合特异性第 2 类基因）和已知的融合抑制因子 STK40（第 4 类），并将 CGA 归入 hCG 抑制因子（第 3 类）；这与我们的 ELISA 检测结果一致，即当其二聚化伴侣缺失时，可检测到释放的游离 hCGβ 亚基。⁴⁵⁻⁴⁸
核心激活因子类（第 1 类）在合体滋养层分化中表现出最显著的缺陷，其中包括 OVOL1、GCM1、TFAP2C 和 ZBTB10。蛋白质-蛋白质相互作用分析将筛选命中基因与 Pol II 和 Mediator、Rho GTP 酶循环以及 AP-2 调控的类固醇生成联系起来，揭示这些模块在合体滋养层分化调控中的重要作用；同时也凸显了 ZBTB10 是一种已知相互作用伙伴较少、胎盘功能尚不明确的因子（图 2I）。这些结果表明，ZBTB10 是人类滋养层分化的新型调控因子，并且鉴于其对……具有显著影响
融合、hCG分泌和形态学表现，因此我们选择该基因进行深入的功能分析。
ZBTB10 是 BeWo 细胞融合和 hCG 分泌所必需的
为解析 ZBTB10 的功能，我们首先在 BeWo 细胞中对其进行了表征。我们利用文库中的三条 sgRNA 构建了多克隆敲除细胞，并通过 TIDE 确认 indel 效率为 100%，敲除评分为 93%（图 3A）。Western blotting 证实，ZBTB10 KO BeWo 细胞中的 ZBTB10 蛋白水平降至野生型水平的 <10%（图 3B）。在未分化的 BeWo 细胞中，ZBTB10 缺失未影响细胞生长或形态（图 S5A、B），提示其作用更可能与分化有关，而非自我更新。与此一致，在 Forskolin 诱导分化后，ZBTB10 KO 细胞的 hCG 分泌显著减少（Western blot 和 ELISA 检测结果均如此），且在双色检测中观察到的细胞间融合也大幅减少（图 3B–D），重现了筛选实验中的表型。为明确这些缺陷的转录基础，我们对 Forskolin 处理后的野生型（WT）与 ZBTB10 KO BeWo 细胞进行了 RNA 测序。结果显示，KO 细胞分化过程中约有 2,500 个转录本上调，约有 2,500 个转录本下调（图 3E）。与蛋白水平的 hCG 分泌减少一致，与 WT 水平相比，CGB3、CGB5 和 CGB8 转录本显著下调。然而，值得注意的是，包括 ERVFRD-1、GCM1、OVOL1 和 TFEB 在内的大多数滋养层细胞融合经典调控因子均未受影响（图 3E），这表明 ZBTB10 的作用在很大程度上独立于已确立的 GCM1–合胞素通路。相反，差异最显著的基因之一是 MFSD2A，即介导 Syncytin-2 介导融合的受体。与 CGB 基因簇中的基因类似，MFSD2A 通常在 Forskolin 诱导的分化过程中上调，但未能被…
ZBTB10 缺失后，相关基因表达显著上调（图 3F、G），提示 ZBTB10 可能需要通过转录激活该受体来介导融合。此外，在 BeWo 分化过程中通常受到抑制的祖细胞基因（如 SLC1A5 和 CDH1）异常持续表达（图 3E）；而未能被诱导表达的基因则富集于细胞间黏附和细胞连接组装等与融合相关的条目（图 S5C）。这些结果共同表明，ZBTB10 既能激活分化相关基因，也能抑制干细胞基因程序。最后，我们通过生物学重复敲除验证了初筛中发现的另一融合相关候选基因 MED13，并观察到，敲除 MED13 始终会完全阻断细胞间融合，而不影响 BeWo 细胞生长（图 S5A–B、D），进一步支持该筛选能够识别滋养层分化的新型调控因子。
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图 3.
ZBTB10 通过调控 MFSD2A（合胞素-2 受体）及激素基因簇的表达，控制 BeWo 细胞融合。
A） 多克隆 ZBTB10 敲除 BeWo 细胞的 Sanger 测序结果，显示发生了缺失和插入缺失突变。
B） 野生型（WT）和 ZBTB10 敲除（KO）BeWo 细胞经 DMSO 或 Forskolin 处理 48 小时（诱导分化）后，ZBTB10 的 Western blot 检测结果。
C） 采用 ELISA 检测经 DMSO 或 Forskolin 处理 48 小时（诱导分化）的 WT 与 ZBTB10 KO BeWo 细胞上清液中的 hCG 分泌量。显著性标记表示 Brown–Forsythe 和 Welch ANOVA 检验结果；校正后 p 值小于 0.0332（*）、0.0021（）和 0.0002（*）。
D） 多克隆 TRAC KO（对照）与 ZBTB10 KO 的 mCherry 和 GFP BeWo 细胞共培养融合实验示例图像。图中显示 GFP BeWo 细胞（蓝色）、mCherry BeWo 细胞（黄色）及 Hoechst 标记的细胞核（洋红色）；白色箭头标示融合区域示例。
至少 3 次独立生物学实验中各孔的定量融合指数。图中比较采用单因素方差分析与混合效应分析、Geisser–Greenhouse 校正及 Dunnett 多重比较检验；**** 表示校正后 p 值 <0.0001。比例尺为 200 μm。
E）
RNA-seq 差异基因表达分析，比较 Forskolin 诱导分化的 ZBTB10 KO BeWo 细胞与 Forskolin 诱导分化的 WT BeWo 细胞。显著上调的基因（FDR < 0.05，Log Fold-Change > 0）以蓝色表示，显著下调的基因（FDR < 0.05，Log Fold-Change < 0）以红色表示。表达无变化的基因以黑色表示。
F、G）
BeWo RNA-seq 数据的基因组浏览器轨迹。
F）MFSD2A
G）CGB 簇基因。显示 3 个 RNA-seq 重复样本的合并（求和）读段。
ZBTB10 促进合体滋养层融合，并且是 EVT 分化所必需的
为探究 ZBTB10 是否能在比绒毛膜癌模型更具生理相关性的条件下调控滋养层分化，我们转而使用人滋养层干细胞（hTSCs）。⁴⁹–⁵¹ 为排除筛选所用引导 RNA 的脱靶效应，我们使用 3 条新的 sgRNA 在 hTSCs 中敲除 ZBTB10；这些 sgRNA 靶向第 4–6 外显子，该区域包含 ZBTB10 的 DNA 结合结构域和预测的核定位信号。在 hTSCs 中，这种多克隆敲除使细胞核内 ZBTB10 水平相较于非靶向对照（NEG）降低约 85%（图 4A）。ZBTB10 缺失降低了 hTSC 增殖，但未消除其自我更新能力，也未改变经典 TSC 标志物的表达（图 4B、图 S6A、B），表明 ZBTB10 对维持干细胞状态本身并非必需。
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图 4.
ZBTB10 调控人滋养层干细胞及类器官中的 STB 和 EVT 分化。
A）
ZBTB10 的免疫荧光染色。
A)
阴性对照（NEG）和多克隆 ZBTB10 敲除 hTSCs 中的检测结果；右侧显示 ZBTB10 核表达阳性细胞核所占百分比的定量结果。
B)
NEG 和 ZBTB10 KO hTSCs 的细胞生长曲线（每次实验每组 6–8 个孔，共进行 3 次独立生物学重复）。按每个孔的 t=0 时刻对汇合度进行归一化，虚线表示 95% 置信区间。右侧显示细胞生长 90 小时时的明场形态和汇合度图像。
C)
NEG 和 ZBTB10 KO hTSCs 向 STB 分化 6 天后的免疫荧光图像。对 3 次独立生物学重复的免疫荧光强度进行定量，并采用配对 t 检验进行比较。
D)
采用 ELISA 测定 NEG 与 ZBTB10 KO 分化 STB 培养上清中的 hCG 分泌量；基于 3 次生物学重复中的 6 次技术重复，采用 Welch’s t 检验进行比较。
E)
双色融合实验的原始图像：GFP/mScarlet 共培养 hTSCs 经 0.1% DMSO 处理（未分化）或分化为 STB 6 天。右侧显示 5 次生物学重复的融合指数定量结果。统计比较采用带 Geisser–Greenhouse 校正的重复测量单因素方差分析（RM one-way ANOVA）及 Dunnett 多重比较检验。
F)
NEG 和 ZBTB10 KO hTSCs 分化为 STB 6 天后的 F-actin（Phalloidin；洋红色）和 DAPI（蓝色）染色图像。右侧显示各条件下标注的未融合细胞数占细胞核总数的百分比，并采用配对 t 检验进行比较。
G)
ZBTB10 KO hTSCs 分化为 STB 6 天后的 Phalloidin（洋红色）和 ZBTB10（绿色）免疫荧光局部放大叠加图。标注的未融合细胞内的细胞核以黄色轮廓标示。右侧显示 3 次独立生物学重复中未融合区域与合胞体化区域内 ZBTB10 阳性细胞核所占百分比的定量结果，并采用配对……进行比较。
t 检验。
H）
对分化 6 天的 EVT 进行免疫荧光分析，比较 NEG 对照组与 ZBTB10 敲除（KO）hTSC。右侧显示 3 次独立生物学重复中 HLA-G 染色强度的定量结果，并采用配对 t 检验进行比较。A–H 面板中的比例尺均为 200 μm。
I）
Matrigel 胶滴中培养的第 7 天 hTSC 滋养层类器官（TO）的明场图像。右侧定量显示成像胶滴内类器官占据的总面积，并采用 Welch t 检验进行比较。
J）
对由 NEG 或 ZBTB10 KO hTSC 形成的第 7 天滋养层类器官的上清液进行 hCG ELISA 检测，并采用 Welch t 检验进行比较。
K）
对由 NEG 或 ZBTB10 KO hTSC 形成的透明化滋养层类器官（TO）进行免疫荧光染色。每张图像均为类器官 Z-stack 共聚焦图像的背景扣除后最大强度投影图。
L）
对 NEG 与 ZBTB10 KO EVT-TO 进行免疫荧光染色；右侧定量显示具有核内 ZBTB10 信号的类器官百分比。图像为 Z-stack 共聚焦图像经背景扣除后的最大强度投影图。K–L 面板中的比例尺均为 100 μm。所有图中，误差线表示标准差；调整后的 p 值以星号表示，分别对应小于 0.0332（*）、0.0021（）和 0.0002（*）。
随后，我们考察了 ZBTB10 对两种主要滋养层谱系形成的作用。定向分化 6 天后，ZBTB10 KO hTSC 仍可形成合体滋养层（STB），且 SDC1 和 hCGβ 等 STB 标志物的表达与对照组相当（图 4C）；然而，ELISA 测得其 hCG 分泌通量较低（图 4D），提示 ZBTB10 的作用在于支持 STB 的分泌功能，而非决定其谱系特化。相比之下，ZBTB10 缺失仅轻微影响细胞间融合；应用这种……
在双色细胞-细胞融合检测体系中，ZBTB10 敲除使 hTSC 的融合呈现轻微但无统计学显著性的降低趋势（图 4E）。不过，我们确实观察到细胞形态和细胞骨架形态发生改变，并量化发现，ZBTB10 KO STB 中完全未融合细胞的比例虽仅小幅增加，但这一变化值得注意（图 4F）。有趣的是，由于细胞群体中的敲除并不均一，在分化 6 天后，与未融合细胞相比，合胞体中的 ZBTB10⁺ 细胞核显著富集（图 4G），这表明表达 ZBTB10 的细胞更倾向于被整合进合胞体。值得注意的是，即使敲除融合素 ERVFRD-1 本身，尽管在分化 6 天后融合程度显著降低，但也未降至 BeWo 细胞中观察到的近乎未分化水平（图 4E、图 1D-E），这表明 hTSC 的融合对任何单一因子的依赖程度均低于 BeWo 细胞。
与 ZBTB10 在支持合体滋养层分化中的作用形成鲜明对比的是，ZBTB10 对绒毛外滋养层谱系至关重要：EVT 分化 6 天后，与对照组相比，ZBTB10 KO hTSC 的分化明显受损，侵袭性尖突形态减少，EVT 标志物 HLA-G 几乎不表达（图 4H）。在生理相关性更高的三维滋养层类器官中也观察到了这些效应。ZBTB10 缺失抑制了类器官生长（图 4I）；尽管 ZBTB10 KO 类器官可自发分化为表达 SDC-1 和 hCG 的 STB 细胞，且程度与对照组相近，但其总体 hCG 分泌量较低（图 4J、K）。与阴性对照 hTSC 不同，定向诱导 ZBTB10 KO 类器官向 EVT 谱系分化（EVT-TO）未能生成 KO EVT-TO，因为 KO 细胞在分化过程中被完全清除。
尽管其起始时占多克隆群体的多数，所有存活并成功附着的 EVT-TO 均一致呈 ZBTB10⁺，且未获得任何 ZBTB10 敲除类器官（图 4L）。由于 EVT-TO 的附着和向外生长需要成功完成 EVT 特化，这进一步表明，ZBTB10 缺失会严重损害向绒毛外滋养层谱系的承诺或维持。
为明确这些谱系特异性表型的转录基础，我们在未分化 TSC、STB 和 EVT 分化状态下，对对照组和 ZBTB10 敲除 hTSCs 进行了 RNA 测序分析（图 S7A）。ZBTB10 缺失对未分化细胞的影响极小，双向差异表达基因仅约 400 个（图 S7B、C）；但在分化过程中，尤其是在 EVT 中，引发了广泛的变化（图 5A、B）。与 BeWo 数据一致，与对照相比，ZBTB10 敲除 STB 中的 MFSD2A 显著降低，而经典融合调控因子（ERVFRD-1、GCM1、TFEB、OVOL1 等）未发生变化（图 5A；图 S7F）。在 EVT 中，ZBTB10 缺失显著降低了 HLA-G、NOTUM、MMP2、MMP15 和 ADAM19 的表达；这些基因是 EVT 命运和侵袭的关键标志物，同时还导致与 EVT 干扰素反应相关的基因过度激活^52,53（图 5B），提示 EVT 分化发生了严重的转录失调。在两种谱系中，KRT7 和 GATA3 等 TSC 标志物在 ZBTB10 敲除细胞分化过程中均未能得到有效抑制，这表明祖细胞程序的沉默受损，并提示 ZBTB10 在滋养层分化过程中可能发挥抑制作用（图 5C；图 S7E）。GO 富集分析与这些表型一致：ZBTB10 敲除 STB 异常保留了肌动蛋白丝组织和细胞-基质黏附相关特征，同时下调了蛋白质折叠和糖酵解相关过程。
这些通路提示其结构和代谢成熟受损；ZBTB10 敲除的 EVT 中病毒应答和干扰素信号增强，提示其未能充分获得正常功能所需的免疫耐受状态（图 S5D）。综上，这些数据表明，ZBTB10 是人类两种滋养层细胞谱系的转录调控因子，在激活关键 EVT 基因、支持 STB 功能以及在分化过程中抑制滋养层干细胞状态方面发挥作用。
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图 5.
ZBTB10 结合富含 GC 的基序，调控 STB、EVT 和 TSC 基因。
A、B）RNA-Seq 差异基因表达分析，比较 A）第 6 天 STB 分化的 ZBTB10 敲除型与阴性对照 hTSC，或 B）第 6 天 EVT 分化的 ZBTB10 敲除型与阴性对照 hTSC。显著上调的基因（FDR<0.05，Log Fold-Change >0）以蓝色表示，显著下调的基因（FDR<0.05，Log Fold-Change <0）以红色表示，表达无变化的基因以黑色表示。
C）热图展示各 RNA-Seq 重复样本的列标准化 log2(CPM) 值，按 TSC、STB、EVT 和融合相关标记基因分组，并按基因列进行标准化。
D）BeWo 细胞 ZBTB10 ChIP 各重复样本和处理条件下检出的 MACS2 峰总数。右侧“交集”表示在两个 Forskolin 重复样本中均检出的峰数。
E）对 Forskolin 处理组中共识 ZBTB10 ChIP 峰进行 HOMER 基序富集分析得到的排名前三的序列基序。
F）BeWo 细胞中 LEP 基因位点的 ZBTB10 ChIP 基因组浏览器轨迹。两个 Forskolin 重复样本中均检出的共识 ZBTB10 峰以黑色条带表示，峰中心以青绿色条带叠加标示。
G）火山图展示在 BeWo 细胞中通过 ChIP 鉴定的 ZBTB10 靶基因（启动子上下游 ±2000 bp 内存在共识峰；绿色）以及……
在分化为STB和EVT的hTSC中差异表达的基因，如图5A、B所示。图顶部标示了各条件下ZBTB10敲除后表达显著失调的独特靶基因（通过ChIP鉴定）数量。
H）
利用UMAP展示妊娠早期人胎盘单核ATAC测序（snATAC-seq）中经注释的细胞簇（Wang等，2024⁵⁹）（左），并标示主要细胞群（CTB、STB和Fusion）。右图将指定ZBTB10 ChIP基序的单细胞ATAC活性（chromVAR偏差z分数）叠加于snATAC-seq的UMAP图上。
ZBTB10通过结合富含GC的基序调控胎盘基因表达
为鉴定滋养层细胞分化过程中ZBTB10的基因组靶位点，我们在稳定过表达Halo-3xFLAG-ZBTB10的BeWo细胞中，分别于未分化（DMSO）和STB分化（福斯可林）状态下进行ChIP测序，绘制了ZBTB10的全基因组结合图谱。在福斯可林诱导分化的样本中，ZBTB10与染色质结合的富集程度显著高于输入对照，且检出的峰位于转录起始位点附近；但在未分化样本中，ZBTB10的结合信号接近于零（图5E，图S8A、B）。这提示，随着细胞分化，ZBTB10优先被募集至染色质。鉴于该转录因子的表达水平适中，且缺乏经ChIP-seq验证的抗体，ZBTB10 ChIP的信噪比较为有限，因此我们采用了基于可重复性的严格结合判定标准，将福斯可林处理重复样本中共有的4,153个峰作为高置信度的ZBTB10基因组靶位点（图5E）。对ZBTB10共有峰进行基序富集分析，鉴定出富含GC的NRF基序和CG重复基序可能是ZBTB10的结合位点（图5F），这与既往关于ZBTB10的报道一致
通过与Sp1竞争结合富含GC的区域。⁵⁴
值得注意的是，多个ZBTB10 ChIP靶标与敲除表型直接相关。在LEP基因的启动子和FSTL3基因的基因体区域均检测到明显的ZBTB10结合峰。这两个基因编码由合体滋养层细胞（STB）分泌的激素，可调控滋养层细胞的生长、侵袭和代谢。⁵⁵–⁵⁷ 在ZBTB10敲除的STB中，LEP和FSTL3均显著下调（图5B、5G、S8C），提示LEP和FSTL3可能是受ZBTB10激活的基因。在MFSD2A启动子处也可观察到ZBTB10的轻度富集，但由于信号较弱，未达到统计学显著性（图S8C）。NOTUM是一种细胞外滋养层细胞（EVT）分化所必需的WNT通路调节因子，其表达同样下调，且被鉴定为ZBTB10的靶标，提示ZBTB10可能与EVT表型存在直接联系（图S8C）。⁵⁸ 我们还在CDH1和TEAD1的启动子处检测到ZBTB10结合；这两个基因的转录本在滋养层干细胞（TSC）中表达，并在ZBTB10缺失后上调，表明ZBTB10在分化过程中还发挥抑制祖细胞状态的作用（图S8C）。将ZBTB10 ChIP-seq峰与ZBTB10敲除的EVT和STB中的差异表达转录本取交集后发现，ZBTB10既结合上调基因，也结合下调基因，从而在基因组层面证实，ZBTB10在滋养层细胞中兼具基因表达程序抑制因子和激活因子的作用，且略偏向于抑制作用（敲除后上调的基因中，存在ZBTB10结合的基因更多；图5H）。
最后，为推断ZBTB10在体内可能作用于哪些滋养层细胞状态，我们利用妊娠早期胎盘的单核ATAC测序（snATAC-seq）数据，分析了ZBTB10基序（NRF和CG重复序列）处的染色质可及性。⁵⁹ ZBTB10基序的可及性在细胞滋养层细胞（CTB）和正在融合的CTB群体中特异性富集，这些细胞状态正处于由CTB向STB转变的准备阶段，
这进一步表明，ZBTB10可能在这一阶段同时发挥抑制干细胞基因和激活分化基因（如LEP）的作用（图5I）。此外，ZBTB10基序在CTB和融合中CTB细胞群中的可及性模式具有独特性（其他与妊娠早期STB相关的转录因子，如MITF和CEBPA，呈现出不同的模式），且并非由这些细胞群中染色质可及性或测序读段深度的全局变化所致（图S8D–F），提示ZBTB10在促进CTB向STB转变过程中的染色质可及性方面具有特异性作用。综上，这些数据表明，ZBTB10在胎盘分化过程中发挥激活因子和抑制因子的双重作用，结合并调控相关基因。
ZBTB10在胎盘中广泛表达，并在融合中CTB和EVT中富集
鉴于ZBTB10在胎盘分化体外模型中的重要功能，我们接下来探究了人胎盘组织中ZBTB10在整个妊娠期的表达情况。在妊娠早期胎盘的单核RNA测序（snRNA-Seq）数据⁵⁹中，ZBTB10在融合中CTB细胞群中的表达最高，该细胞群的平均表达水平和表达ZBTB10的细胞比例均最高（图6A）。在HLA-G表达最高的一部分EVT细胞中，也观察到较高水平的ZBTB10表达（图6A、图S9A）。这些数据与功能上依赖ZBTB10的细胞状态一致。人胎盘的单核多组学分析发现，STB遵循分叉的成熟轨迹：一个共同的早期细胞群（新生eSTB）在合胞体内产生两种终末类型的细胞核，即PAPPA⁺生长激素型（成熟eSTB 1）和偏向氧应答及脂质转运的FLT1⁺转运型（成熟eSTB 2），两种状态的比例大致相等
在妊娠早期的比例，但至足月时转变为以PAPPA+ STB为主。⁵⁹ 在所有STB亚型中，ZBTB10的表达从妊娠早期至晚期均略有下降，且在足月胎盘的各类细胞中未发现ZBTB10的特异性富集，提示ZBTB10在早期胎盘发育中发挥更为重要的作用（图S9C）。沿妊娠早期胎盘STB成熟的拟时序轨迹映射ZBTB10的表达发现，其在ERVFRD-1高表达的早期CTB融合状态中富集，这与其促进融合的作用一致；此外，其也在FLT1高表达的eSTB成熟2分支（拟时序晚期）中富集，提示其还参与FLT1+ STB亚型的成熟（图S9D）。基因集富集分析显示，STB中ZBTB10敲除导致FLT1+成熟2基因特征显著且优先丧失，同时PAPPA+成熟1基因特征轻度富集，提示ZBTB10可能调控早期STB内这些转录亚型的平衡或成熟（图6B）。在蛋白水平上，ZBTB10在hTSC中呈中等水平表达，在完全分化的STB中表达略低，而在EVT中表达最高（图6C、F）。与此一致，在妊娠早期胎盘组织中，免疫染色显示整个绒毛组织内均存在清晰的核内ZBTB10蛋白信号，包括CTB和STB的细胞核，其中侵袭性HLA-G+ EVT中的表达尤为强烈（图6D、F、G）。至足月时，ZBTB10仍在部分CTB和STB细胞核中广泛表达（图6E、G）。我们的数据提示，ZBTB10是一种在胎盘中广泛表达的转录因子，尤其在早期胎盘中正在融合的CTB和侵袭性EVT中富集表达
发育过程中，我们发现这些细胞群需要其发挥功能，这与其在STB和EVT分化中的作用一致。
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图6.
ZBTB10在人胎盘中表达，并在融合中的CTB和EVT中富集。
A)
采用UMAP展示人妊娠早期胎盘单核RNA测序（snRNA-Seq）中经注释的细胞簇（Wang等，2024⁵⁹），并标示细胞簇编号（上图）。细胞群按主要类别标注（CTB、STB及融合中细胞等）。下图在同一UMAP图上展示ZBTB10的表达，数值为每个细胞经log2归一化的计数。右侧柱状图量化了各注释细胞簇中ZBTB10的平均表达量及其读段数>0的细胞百分比。
B)
将两个成熟STB细胞簇叠加显示于妊娠早期胎盘snRNA-Seq的UMAP图上。右侧为eSTB成熟1和成熟2通路中前100个差异表达基因的GSEA图，基因按其在ZBTB10敲除（KO）STB中富集（左）至在NEG STB中富集（右）的顺序排列。黑色竖线表示各通路基因在排序基因集中的位置。NES＝标准化富集分数。
C)
未分化人滋养层干细胞（hTSC）与经EVT或STB分化诱导至第6天的hTSC中ZBTB10的免疫荧光染色。C图中的比例尺为200 μm。
D,E)
D)
妊娠早期（第8–12周）和
E)
足月（第36–40周）人胎盘组织的免疫荧光染色。
F)
左侧为体外分化的hTSC免疫荧光图像中ZBTB10荧光强度的定量分析。比较采用经Geisser–Greenhouse校正的重复测量（RM）单因素方差分析及Dunnett多重比较检验，其中*表示校正后p值<0.0332。右侧为妊娠早期胎盘组织中经图像分割识别的指定标志物阳性细胞内ZBTB10荧光强度的定量分析。统计比较采用
采用配对t检验比较各供体之间的均值（n=4）。
G）
右下方展示了D、E中免疫荧光染色的局部放大叠加图像，白色箭头标示了示例细胞类型。D–G各图中的比例尺均为100 μm。
ZBTB10的保守性及胎盘特异性功能的演化
ZBTB10属于BTB-锌指蛋白家族（该家族包括BCL6），其成员在脊椎动物中具有保守性，并在非胎盘组织中发挥重要作用，尤其是在造血和免疫过程中。⁶⁰–⁶³
在人类中，ZBTB10在多种组织中广泛表达，其中在骨髓和肝脏中的表达量最高，在胎盘中也高度富集，胎盘的表达量在所有组织中位居第三（人类蛋白质图谱）。为阐明ZBTB10的组织特异性表达可能如何演化，我们对ZBTB10进行了氨基酸序列比对，发现尽管其整体蛋白质序列随演化时间发生分化，但从人类到鱼类，ZBTB10的两个锌指DNA结合结构域几乎完全保守，这与其在非胎盘组织中的祖先功能相一致（图S10A–C）。为进一步研究哺乳动物近期的演化变化，我们分析了来自不同哺乳动物物种的六个胎盘单核及单细胞测序数据集，包括人（Homo sapiens）、食蟹猴（Macaca fascicularis）、小鼠（Mus musculus）、豚鼠（Cavia porcellus）、有袋类灰短尾负鼠（Monodelphis domestica）以及马达加斯加普通马岛猬（Tenrec ecaudatus）。⁶⁴ UMAP分析证实，所有物种中均存在保守的细胞群，包括滋养层细胞、淋巴系细胞和髓系细胞等（图S10E、F）。在全部五种真兽类物种中，ZBTB10在滋养层细胞类型中的表达量均高得多
高于其在淋巴系或髓系细胞类型中的表达水平（图 S10D、G）；而在胎盘侵入程度有限的有袋类动物负鼠中，ZBTB10 的表达则在树突状细胞中最高（图 S10D），与其祖先型免疫功能一致。在具有侵入性胎盘、且亲缘关系最远的真兽类物种马岛猬中，ZBTB10 在树突状细胞和 B 细胞等造血细胞谱系以及胎盘外滋养层细胞（EPT）中均高度表达；EPT 在功能上相当于绒毛外滋养层细胞（EVT）（图 S10D）。鉴于马岛猬 EPT 与人类 EVT 均表达侵入相关基因 ADAM19 和 MMP15，而这两个基因在人类 ZBTB10 敲除（KO）EVT 中均下调，这些数据提示，ZBTB10 在调控真兽类绒毛外滋养层侵入方面具有保守作用（图 5B）。⁶⁴ 总体而言，ZBTB10 在马岛猬、豚鼠、小鼠、猕猴和人类滋养层细胞中的富集支持这样一种假说：在真兽类演化过程中，ZBTB10 的胎盘特异性表达是伴随侵入性胎盘形成而获得的（图 S10D）。
讨论
通过在同一孔中同时测量活细胞融合、hCG 分泌以及细胞形态的详细特征，我们采用可扩展的阵列式 CRISPR 筛选鉴定出了 117 个滋养层分化调控因子。我们独特的方法克服了以往的局限，建立了适用于细胞融合这一独特生物学过程的遗传筛选体系：阵列式筛选避免了克隆分离，因为对数百个基因进行克隆分离并不现实；BeWo 细胞较短的分化过程最大限度地减少了代偿性适应，而此类适应可能在较长期的分化实验中掩盖功能缺失表型；配对检测则捕获了多个表型中的功能获得和功能缺失效应。该筛选发现了逾百个对……产生影响的基因
STB分化，识别出了GCM1和STK40等已知调控因子，从而验证了其稳健性，并筛选出三个此前尚未得到表征的调控因子，作为STB分化的强效调控因子：ZBTB10、EGLN1和ZNF292。
对细胞融合和hCG的联合分析表明，STB的这两项标志性功能在很大程度上可以彼此分离，而非必然耦联。既往研究已提示这种可分离性：例如，直接破坏Syncytin-1或Syncytin-2会损害细胞融合，但不影响hCG分泌¹⁹；而敲低hCG信号传导在一些研究中会改变细胞融合，在另一些研究中则不会²⁶,²⁷。此外，白血病诱导因子（LIF）等调控因子可提高细胞间融合效率，同时降低hCG水平；MAPK14抑制剂则可降低hCG分泌，而不改变细胞融合²⁸,²⁹。我们的筛选为该领域提供了基于表型的定量研究资源，揭示出hCG作为体内胎盘功能的主要血清标志物，其调控可独立于合体滋养层的完整性。尽管已有证据表明子痫前期存在合体滋养层功能障碍，但hCG作为子痫前期预测指标的表现并不一致，这种分离现象或可解释其原因，并提示更具选择性的因子可能有助于区分妊娠期间合体滋养层功能障碍的不同病因，并有望针对这些病因进行纠正⁶,⁷,⁹,⁶⁵。
在效应最强的筛选命中因子中，EGLN1（PHD2）是位于GCM1下游的HIF调控因子，其缺失会导致小鼠胎盘畸形³⁶,⁶⁶,⁶⁷；ZNF292则是参与STB基因调控网络的因子⁶⁸。二者均已有与胎盘相关的研究证据，但尚未在STB分化中接受功能验证。相比之下，迄今尚无关于ZBTB10在胎盘中作用的报道，因此我们力图揭示其在滋养层生物学中的重要性。功能研究在
具有生理相关性的hTSC体系揭示了ZBTB10在胎盘发育中的广泛作用，这与其在人胎盘组织中的表达相一致。我们发现，ZBTB10通过结合特定基因，促进EVT和STB的功能（如LEP、NOTUM），同时抑制上皮细胞和祖细胞程序（如CDH1、TEAD1），从而协调多种滋养层细胞命运。因此，ZBTB10兼具激活因子和抑制因子的作用，决定滋养层细胞的谱系选择。
值得注意的是，ZBTB10缺失显著降低了BeWo细胞的融合和激素分泌，却未扰乱经典的GCM1–合胞素轴，提示ZBTB10通过一种独立的平行程序参与STB的形成。在hTSC衍生的STB中，ZBTB10敲除细胞仍能形成STB，但MFSD2A的转录本水平较低，且hCG分泌减少。然而，与BeWo细胞不同，其融合仅部分受损，而非完全丧失。结合单个ZBTB10阴性细胞更倾向于保持未融合状态这一观察结果，提示ZBTB10通过控制合胞素-2受体MFSD2A的表达，在受体细胞一侧调节融合；而多克隆敲除hTSC群体中未编辑细胞的存在，掩盖了这一特异性需求。此外，我们发现，ZBTB10直接调控STB分泌的两种关键胎盘激素——瘦素（LEP）和卵泡抑素同源蛋白FSTL3——的转录。在子痫前期和胎儿生长受限中，均已观察到LEP和FSTL3的病理性升高，且循环中FSTL3蛋白水平升高可预测随后发生的子痫前期（PE）和胎儿生长受限（FGR）。这提示，可评估靶向ZBTB10作为调控妊娠疾病中这些靶标的一种途径。69，70
更广泛而言，通过将我们的转录组学数据与体内两种主要的成熟STB状态进行比较，我们发现，
ZBTB10 缺失使细胞状态偏离缺氧响应性转运程序（FLT1⁺），转向在足月时占主导地位的生长激素响应性 STB 状态（PAPPA⁺）。综合来看，这些数据表明，ZBTB10 缺失会削弱 STB 的融合能力和分泌特性，但不会导致该谱系完全丧失，而是特异性地损害早期 FLT1⁺ 转运型细胞群，这与 ZBTB10 表达和 FLT1⁺ 状态在妊娠进程中均逐渐减少的趋势一致。
59
这提示 ZBTB10 协调 STB 的多项重要功能，包括细胞融合及随后的内分泌成熟，并可能调控胎盘中具有临床意义的 STB 亚型之间的平衡。
令人意外的是，我们发现 ZBTB10 是形成功能性 EVT 谱系所必需的。ZBTB10 缺失会损害 EVT 的功能性分化，表现为侵袭相关基因表达降低、侵袭性形态丧失，以及干扰素和抗病毒应答通路的激活。这些结果与近期研究一致，即干扰素暴露本身即可阻断 EVT 的侵袭
71
，
72
，并提示 ZBTB10 敲除导致细胞无法建立滋养层细胞在母胎界面进行侵袭所需的转录和功能状态。在 EVT-TO 分化过程中，ZBTB10 敲除细胞被完全清除，进一步凸显了这一必需性，表明 ZBTB10 可能是胎盘侵袭程序的主调控因子。ZBTB10 的侵袭调控作用可能具有深远的进化起源。我们发现，ZBTB10 在真兽类动物的滋养层细胞中富集表达；在亲缘关系较远的马岛猬中，ZBTB10 标记了具有侵袭性的胎盘外滋养层细胞，这些细胞共同表达 ADAM19 和 MMP15，而这两个基因也正是 ZBTB10 在人 EVT 中调控的侵袭相关基因。ZBTB10 表达的征用在
因此，胎盘可能是侵入性胎盘形成演化过程中的一个重要环节。这种功能征用现象与GCM1的情况类似：GCM1是果蝇中决定胶质细胞命运的核心转录调控因子，在演化过程中逐渐在胎盘中富集，并成为滋养层谱系分化所必需的因子，同时仍保留了在哺乳动物中调控胶质细胞命运的能力。39,73–76 ZBTB10的祖先免疫功能是否在胎盘中仍具有意义，以及该功能是否与ZBTB10敲除（ZBTB10-KO）绒毛外滋养层细胞（EVT）中解除抑制的干扰素程序有关，仍是有待探索的开放问题。
综上，我们鉴定出ZBTB10是人滋养层分化过程中一种保守的跨谱系调控因子，通过协调激活和抑制不同的滋养层基因程序，对绒毛外滋养层细胞（EVT）的侵袭和合体滋养层（STB）的成熟发挥必不可少的作用。本研究提供了系统性资源和调控框架，有助于解析胎盘主要的细胞融合及分泌功能如何建立，以及遗传调控失常如何促成胎盘疾病的发生。
材料与方法
伦理声明
本研究方案已获华盛顿大学机构审查委员会批准，批准编号为STUDY00023408。本研究使用了此前由华盛顿妊娠生物样本库（STUDY00010803）和出生缺陷研究实验室（STUDY00000380）采集的去标识化样本。研究参与者均已签署书面知情同意书，同意将组织用于研究目的。本研究亦经华盛顿大学胚胎干细胞研究监督（ESCRO）委员会审查并批准。
细胞培养
BeWo细胞培养
人胎盘绒毛膜癌BeWo细胞（ATCC CCL-98）在37°C、5% CO₂条件下，于F-12K培养基（Corning或
ATCC），并补充10%胎牛血清、10 U/mL青霉素–链霉素及5 μg/mL头孢噻肟（Millipore Sigma，C7912-1G）抗生素。细胞每2–4天经胰蛋白酶消化后传代，传代比例为1:3–1:5。每24–36 h完全更换培养基。
初始态来源的人滋养层干细胞（hTSCs）
人滋养层干细胞此前由初始态人多能干细胞（RUES2 NIHhESC-09-0013）建立，并在低氧条件下（37°C、5% CO₂、5% O₂）使用TSC培养基培养。TSC培养基为DMEM/F12，补充0.1 mM β-巯基乙醇、0.2% FBS（Sigma，F4135）、0.5%青霉素–链霉素（P/S；Gibco，15140122）、0.3% BSA、1% ITS-X（Gibco，41400045）、1.5 μg/mL L-抗坏血酸、50 ng/mL EGF、2 μM CHIR99021、0.5 μM A83-01、1 μM SB431542、0.8 mM VPA和5 μM Y-27632。⁵¹ 每隔一天更换培养基，当TSC达到80%汇合度时（约每4天），使用TrypLE Express（Gibco，12605010）消化，并以1:4–1:6的比例传代至Cultrex（R&D）包被的培养板上。实验使用第10–25代细胞。
hTSC的分化
将TSC培养至80%汇合度，随后在37°C下使用TrypLE Express消化8–15 min。为诱导绒毛外滋养层细胞（EVT），将TSC以1.05 × 10⁴个细胞/cm²的密度接种于预先用Laminin-521（BioLamina，货号：LN521-05；用PBS稀释，4°C包被过夜）包被的Ibidi四腔玻底载玻片（货号：80426）或CellVis玻底24孔板（P24-1.5H-N）中，用于成像；或接种于Cultrex包被的6孔塑料组织培养板中，用于RNA-Seq。在TSC培养基中使细胞贴壁过夜，随后更换为EVT1培养基（DMEM/F12、0.1 mM β-巯基乙醇、0.5%青霉素/链霉素、0.3% BSA、1% ITS-X、100 ng/mL NRG1、7.5 μM A83-01、2.5 μM Y-27632和4% Knockout血清替代物），以启动分化。
补充1% Geltrex（Gibco）（第1天）。第3天，将培养基更换为补充0.5% Geltrex的EVT2培养基（不含NRG1的EVT1培养基）。第5天，将培养基更换为EVT2培养基。第7天对细胞进行分析。为诱导合体滋养层细胞（STBs），按上述相同方式接种滋养层干细胞（TSCs）。将细胞置于TSC培养基中培养过夜，使其贴壁，然后于第1天更换为STB培养基（DMEM/F12、0.1 mM β-巯基乙醇、0.5%青霉素/链霉素、0.3%牛血清白蛋白、1% ITS-X、2.5 μM毛喉素、2.5 μM Y-27632及4% KnockOut血清替代物），以启动分化。第4天更换培养基，第7天对细胞进行分析。
滋养层类器官
按照既往建立的方案生成滋养层类器官（TOs）。⁴⁹,⁷⁷,⁷⁸ 简而言之，将TSCs培养至汇合，随后用TrypLE Express解离，并用DMEM/F12洗涤两次。将总计6000个细胞悬浮于25 μL Matrigel液滴（Corning，354277）中，接种于48孔板，在37 °C下孵育15 min后加入滋养层类器官培养基（TOM）。TOM由以下成分组成：Advanced DMEM/F12、1× GlutaMAX、1× N2补充剂、1× B27补充剂、1.25 mM N-乙酰-L-半胱氨酸、50 ng/mL重组人表皮生长因子（EGF）、1.5 μM CHIR99021、80 ng/mL重组人R-spondin-1（R&D Systems，4645-RS）、100 ng/mL重组人成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、50 ng/mL重组人肝细胞生长因子（HGF）、500 nM A83-01、2.5 μM前列腺素E2（Sigma，P0409）、0.1 mM 2-巯基乙醇及2 μM Y-27632。每隔一天更换培养基。类器官培养7天后进行传代。传代时，在冰冷的DMEM/F12中用力吹打以打散Matrigel液滴，随后以600 × g离心4 min，去除培养基及凝胶上清液，再将类器官沉淀重悬于冷DMEM/F12中。重复该过程3次，以去除凝胶并
重悬类器官。为促进形成正确的极性（STB位于外侧），随后将类器官转移至超低黏附Nunclon Sphera 96孔板中，并在TOM培养基中继续培养2天。⁷⁹˒⁸⁰ 随后于第9天收获类器官：将类器官收集至预先用抗黏附溶液（Stem Cell）包被的1.5 mL管中，用PBS++洗涤一次，然后在4°C下用4%多聚甲醛（PFA）固定过夜，再进行免疫染色。
EVT-TOs按照先前的方案生成。⁴⁹˒⁷⁷˒⁷⁸ 简而言之，TOs在Matrigel中形成，并在TOM培养基中培养7天，随后按上述方法传代，以1:2–1:4的比例接种于玻底培养皿中的10 μL Matrigel液滴内，在TOM培养基中继续培养2–4天，或直至大小达到约200 μm，然后更换为TO-EVT1培养基（由Advanced DMEM/F12、1× GlutaMAX、0.1 mM β-巯基乙醇、0.5% P/S、0.3% BSA、1% ITS-X、100 ng/mL NRG1、7.5 μM A83-01、2.5 μM Y-27632和4% KSR组成）。在EVT1培养基中培养5–6天后，将其更换为EVT2培养基（不含NRG1的TO-EVT1培养基），继续培养5–6天。所有类器官培养基均每2天更换一次。
BeWo CRISPR筛选（伯克利与IGI）
冻干的向导RNA文库由Synthego提供，并储存于−80°C。通过短暂涡旋振荡，将向导RNA在1× TE中重悬至100 μM，并于4°C孵育72小时。随后使用Benchsmart Pro 96孔移液器，将100 μM文库储备液分装至无菌Nunc V形底96孔板中，用铝膜密封，并储存于−80°C直至使用。将用于筛选的向导RNA储备液进一步用1× TE缓冲液稀释至5 μM，用铝膜密封，并储存于−80°C直至使用。
sgRNA-Cas9 RNP复合物在核转染前即刻制备。重组Cas9蛋白（QB3 Macrolab）被
用1× TE缓冲液稀释至20 μM。对于每块96孔核转染板，按照制造商说明配制预混液，其中含1,446.4 μL添加了补充剂的Lonza SG缓冲液和53.6 μL 20 μM Cas9，总体积为1,500 μL。将每孔含6 μL 5 μM sgRNA的96孔文库板在室温下解冻10分钟，以500 × g离心2分钟以收集冷凝液，随后置于冰上。将Cas9/Lonza SG预混液直接加入各含sgRNA的孔中，每孔14 μL，轻柔混匀以形成核糖核蛋白（RNP）复合物。RNP置于冰上孵育直至即将使用，并在核转染前于室温孵育10分钟，以促进复合物组装。
BeWo细胞在标准生长培养基中培养，于15 cm细胞培养皿中扩增，并通过胰蛋白酶消化进行常规传代，为核转染做准备。每次96孔核转染共收集3 × 10⁷个细胞（1.5 × 10⁷个GFP BeWo细胞和1.5 × 10⁷个mScarlet BeWo细胞），合并后离心收集细胞沉淀。将细胞重悬于1.5 mL BeWo培养基中，使最终浓度达到每5 μL含1 × 10⁵个细胞。使用多道移液器，向每个含有核转染缓冲液中预组装Cas9 RNP的孔中加入5 μL细胞悬液。加入细胞后，立即将20 μL细胞-RNP混合液转移至96孔Lonza核转染杯板。使用配备96孔Shuttle系统的Lonza 4D-Nucleofector X Unit，采用CA-137程序进行核转染。核转染完成后，立即向各孔轻柔加入80 μL预温的BeWo培养基，不进行混匀。将细胞置于37°C、5% CO₂的湿润培养箱中恢复10分钟。随后通过轻柔吹打重悬细胞，并从每孔取出60 μL，
转移至96孔组织培养板中，每孔含190 μL完全培养基。核转染后24小时更换培养基。核转染后48小时，使用Accutase对原始培养板中的细胞进行传代，并加入培养基终止消化，将每块原始培养板中30%的细胞转移至3块Cell Carrier Ultra 96孔接收板（PerkinElmer 6055300）中。培养板孵育过夜后，将培养基更换为含20 μM毛喉素（Forskolin）的BeWo培养基，以诱导除DMSO对照孔之外所有孔中的细胞分化（每块板的E1–E3孔为对照孔，加入含0.1% DMSO的BeWo培养基）。细胞分化培养48小时，在分化24小时时分别更换相应的含DMSO或毛喉素的培养基。分化48小时时，从每孔取25 μL上清液样本，转移至96孔PCR板，并于−80 °C保存至使用。随后，将培养基更换为含4.5 g/L葡萄糖、不含酚红的DMEM，其中添加10% FBS、1× GlutaMAX补充剂和1×丙酮酸钠补充剂，以及终浓度为2 μg/mL的Hoechst 33342（Invitrogen），孵育30分钟后进行成像。依次对各培养板中的活细胞进行成像；每块板的成像耗时约1小时，因此错开各板的分化起始时间，以确保所有培养板均在分化48小时±2小时的时间范围内完成成像。
核转染时，从每份100 μL核转染反应液中另取15 μL，转移至单独的96孔组织培养板（备用板）中，每孔含85 μL完全培养基。核转染后约72小时，将已长满的备用板中的细胞冻存（在96孔板中每孔加入20 μL胰蛋白酶使细胞脱附，随后每孔加入150 μL含10% DMSO和90% FBS的溶液终止消化，并置于泡沫聚苯乙烯盒中，在−80 °C下缓慢冷冻），之后用于提取基因组DNA（gDNA），以通过TIDE分析评估筛选中的基因编辑情况。
部分孔中的效率。
成像在 Perkin Elmer Opera Phenix 高通量转盘式共聚焦显微镜上进行，采用 37°C、5% CO₂ 的培养条件及 10× 干式物镜（NA = 0.3），采集四个通道（明场、Hoechst、GFP、mScarlet）的图像。其中，Hoechst 和明场图像在同一次曝光中采集，mScarlet 和 GFP 图像则在第二次曝光中采集。所用照明设置及滤光片组如下：明场成像采用透射光和 650–760 nm 发射滤光片；GFP 成像采用 488 nm 激发光，发射波段为 500–550 nm；mScarlet 成像采用 561 nm 激发光，发射波段为 570–630 nm；Hoechst 成像采用 375 nm 激发光，发射波段为 435–480 nm。每孔采集 12 张图像（视野），覆盖几乎整个孔的区域，各测量指标取全部 12 个视野的平均值，作为孔水平的测量结果。
hCGβ ELISA（货号：DY9034-05）按照制造商的操作方案进行，使用 96 孔 Immulon 4HBX 平底板（货号：3855）。上清液样本用试剂稀释液（PBS 中含 1% BSA）按 1:10,000 稀释。使用 BioRad 洗板机以 PBST 进行洗涤。ELISA 检测使用 BioRad 微孔板分光光度计完成，记录 450 nm 和 540 nm 处的吸光度。筛选时，将扣除背景后的吸光度（450 nm − 540 nm）按每孔细胞核总数（由各孔对应的活细胞共聚焦成像获得）进行归一化，以定量相对 hCG 水平。
创新基因组研究所的高通量自动化 hCG 筛选
自动化筛选在全封闭的 BSL-2 机器人操作舱内进行，细胞处理过程中无人工干预。一套全自动细胞培养系统被
该系统采用自动化液体处理设备（Tecan Fluent）、培养设备（Thermofisher Scientific Cytomat 5）、机械臂操作设备（HighRes Biosolutions A Cell机械臂）以及洗板分液设备（Agilent EL 406）进行操作。在该系统中，液体处理的体积精度可达到变异系数（CV）为2.0%，死体积通常小于1 μL；洗板分液器各分液管路的变异系数（CV）最高为2.5%，吸液死体积通常小于2 μL。针对子板的机器人液体处理程序经过校准，以确保在全体积处理过程中，吸液和分液均在液面以下进行；同时对操作高度进行校准，使一次性吸头不接触细胞，并尽量减少液流对细胞的扰动。
使用HighRes Biosolutions Cellario调度软件开发了两套操作方案，分别用于自动化细胞传代，以及结合上清液收集的自动化分化。按照上述方法，手动将阵列化CRISPR文库通过核转染导入BeWo细胞，并将细胞预先接种于96孔板中，培养2天后转入自动化系统。接收后，使用机器人液体处理设备，将预先接种于一块母代96孔组织培养板（Corning，96孔、透明、平底、经组织培养处理）中的细胞传代至三块子代96孔高内涵成像板（PhenoPlate，96孔、黑色、光学透明平底、经组织培养处理）。使用自动化洗板分液器将培养基完全吸除，以100 μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤母板中的细胞，随后加入50 μL Accutase细胞解离液。将细胞置于温度为37 °C、相对湿度为90%、O₂浓度为21%的受控环境中孵育10分钟。
浓度。孵育后，快速振荡培养板10秒，使细胞解离。通过机器人液体处理系统（Tecan Fluent），将预先准备的96孔源液槽中的培养基以每孔220 μL分装至各孔，并使用配备96通道移液头的机械臂对母板中解离的细胞进行20次上下吹打混匀。混匀后，从母板依次向各子板（每孔预先加入20 μL BeWo培养基）分装80 μL细胞悬液，使每孔总体积达到100 μL。每块子板均孵育24小时后开始诱导分化。
通过将预先准备的96孔源液槽中的培养基转移至子板来诱导分化，转移过程中尽量减少对细胞的扰动。该源液槽经手动配制，除3个仅含DMSO的孔加入BeWo培养基＋0.1% DMSO外，其余各孔均加入分化培养基（BeWo培养基＋20 μM福斯可林）。该操作流程按子板逐块依次执行，每24小时进行一次，每块培养板的总分化时间为48小时。在各操作步骤之间，各子板均保持孵育状态（温度37 °C、相对湿度90%、O₂浓度21%）。分化48小时后，使用配备96通道移液头的机械臂从各培养板液面顶部吸取20 μL上清液，并分装至PCR板中，用于ELISA检测；随后由自动封板机进行热封，并将PCR板输出系统。
CRISPR筛选分析
BeWo CRISPR筛选成像在5个生物学培养板组（母代sgRNA培养板）中进行，每组包含3个技术重复（A、B、C），共计15块培养板。初步图像分析使用Perkin Elmer Harmony软件完成。为定量分析融合
在BeWo细胞中进行指数的高通量分析时，使用Perkin Elmer Harmony软件进行明场校正，并对每个视野进行基本平场校正。使用“查找细胞核”（find nuclei）功能和方法C分割细胞核，并筛选面积>50 μm²的细胞核（以排除碎屑）。使用强度阈值和100 μm²的面积阈值分割每张图像中的GFP⁺和mScarlet⁺区域。为避免相邻细胞边界处出现伪mScarlet和GFP区域，对所有选定的mScarlet和GFP区域进行5像素的腐蚀处理，以缩小区域。使用“交叉群体”（cross population）功能，计算所选细胞核与缩小后的GFP⁺或mScarlet⁺区域之间基于像素的重叠百分比。随后使用布尔运算符筛选细胞核，并将融合指数计算为与mScarlet和GFP区域均具有至少90%像素重叠的细胞核（融合细胞核）所占比例，除以与mScarlet或GFP区域中的任一区域具有至少70%像素重叠的细胞核（荧光细胞核总数）所占比例。次级表型直接在Harmony软件中计算。对于细胞涂染（Cell Paint）分析，我们使用细胞间融合分析流程中分割得到的细胞核，然后使用“查找细胞质”（Find Cytoplasm）功能和方法D，接着通过Harmony软件中的“Cell Paint”分析流程，以默认参数（默认区域、属性集=基础、SER尺度=2）提取所有通道的多参数特征。此外，将按每孔细胞核总数归一化的hCG水平添加至Excel电子表格中，并使用自定义R脚本与成像特征一同分析。采用线性回归（R²），基于未经任何排除处理的原始孔水平数值评估重复间的相关性。随后，将孔从
若荧光细胞核占总细胞核的比例低于45%（表明细胞死亡或未表达），则将其排除在下游分析之外。若某块板中通过细胞活力筛选的阴性对照孔少于3个，或阳性对照孔少于3个，则将该板排除在细胞绘画（Cell Painting）分析之外。融合指数和hCG分泌值在每个板-重复组内分别进行独立归一化，转换为抑制百分比（PI），所用公式如下：
其中，x表示孔的原始测量值，中位数由同一板内通过细胞活力筛选的对照孔计算得到。该归一化将DMSO（0%分化）对应的值设为0，将FSK/TRAC（最大程度分化）对应的值设为100。对于细胞绘画分析，从初始特征矩阵（每孔包含900多个形态学参数）中剔除非生物学列，包括元数据字段（行、列、时间点）、仪器环境参数（温度、CO₂）以及板级标识符。通过计算每个板-重复组内阳性对照孔中各特征的中位数绝对偏差（MAD），识别并剔除近零方差（NZV）特征；MAD低于全局中位数的0.0001倍的特征被标记为无信息特征并予以排除。最终得到包含866个具有生物学信息的形态学参数的特征集。细胞绘画特征以阳性对照孔（FSK/TRAC）作为参考群体，在每个板-重复组内独立归一化为稳健Z分数：
其中，MAD为采用标准缩放因子1.4826校正的中位数绝对偏差。在进行主成分分析（PCA）之前，将Z分数缩尾至±10，以限制极端离群值的影响。对归一化后的特征矩阵进行PCA，保留累计解释90%方差的主成分（PC）（40
成分）。通过将每个孔的主成分（PC）坐标投影到PC空间中连接阴性对照（DMSO）质心与阳性对照（FSK/TRAC）质心的轴上，计算各孔的带符号分化评分：
其中，û为沿DMSO→FSK/TRAC轴方向的单位向量。该指标量化了细胞相对于对照的分化程度，其中0表示类似DMSO的状态，100表示最大程度的FSK/TRAC样分化。对于每个基因，计算所有有效样本孔（合并技术重复）中融合指数PI、hCG PI和分化评分的中位数。针对每项读出指标计算基因水平的MAD Z分数，以识别相对于总体分布的离群值。如果某个基因在三项主要读出指标（融合、hCG或分化评分）中至少一项的|MAD Z分数| ≥ 2.0，则将其归类为命中基因。根据超过阈值的读出指标组合分配命中类别（例如，“融合+hCG”“仅分化”）。基于命中基因在全部三项主要读出指标上的截断MAD Z分数谱（上限为+8，下限为−8），采用完全连接法和欧氏距离进行无监督层次聚类。将所得树状图切分为k=4个簇，以对具有相似多表型特征的基因进行分组。表型谱以笛卡尔坐标雷达图展示，各轴表示每项读出指标的截断MAD Z分数（范围为±5），从而可对不同基因、簇及命中类别的多维表型进行直观比较。所有分析均在R（版本4.3.2）中完成，使用以下软件包：dplyr（版本1.1.4）、tidyr（版本1.3.1）和ggplot2（版本3.5.2）用于数据处理和可视化；ComplexHeatmap（版本2.18.0）用于
聚类热图；eulerr 用于绘制集合重叠图；patchwork（版本 1.2.0）用于多面板图的组合排版。
TIDE PCR 和 ICE 分析
使用 Zymo Genomic DNA miniprep kit（Zymo，D7001）纯化 BeWo 细胞的基因组 DNA。按照制造商说明，使用下列引物及 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶（Takara Bio）或 KOD One（Sigma Aldrich）PCR 预混液进行 PCR 扩增。Sanger 测序由 Elim Biopharm 或 Genewiz 完成。使用 Synthego 的 ICE Analysis 工具（
），基于 Sanger 测序的 .ab1 文件评估 TIDE 插入缺失百分比（Indel %）和敲除评分（KO Score）。
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使用 Cas9 RNP 在 BeWo 细胞和 hTSC 中进行多克隆敲除
所使用的向导 RNA 序列：
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向导 RNA 购自 Synthego 或 IDT，用 TE 缓冲液重悬至 100 μM，并于 −80°C 保存。进行 Cas9 RNP 核转染时，将向导 RNA 与 Cas9 按 3:1 的摩尔比组装。对于 hTSC，使用 15 pmol RNP（45 pmol sgRNA 加 15 pmol Cas9 酶）；对于 BeWo 细胞，使用 10 pmol RNP（30 pmol sgRNA 加 10 pmol Cas9）。使用 Lonza SG 核转染液（按照制造商说明预先混入 1× Supplement 1）将每个反应体系补足至总体积 20 μL。加入细胞前，在室温下孵育 10 分钟以完成 RNP 组装。进行 BeWo 细胞敲除时，每个反应使用 1×10⁵ 个细胞；对于 hTSC，每个反应使用 2×10⁵ 个细胞。将细胞重悬于 5 μL 细胞培养基中，加入核转染/RNP 溶液，随后使用 Lonza 4D 核转染仪，采用 SG 缓冲液设置和 CA-137 程序进行核转染。核转染后立即加入 80 μL 培养基，并让细胞恢复培养，持续时间为
在37°C、5% CO₂条件下孵育10分钟，然后转移至培养板中进行培养。Cas9 RNP核转染后1–2代内的基因敲除 hTSC 用于后续实验。
细胞与类器官生长实验
使用置于37°C、5% CO₂培养箱内的 CELLCYTE Studio（CYTENA）评估 TSC 的汇合度及滋养层类器官的大小。使用“Spheroid”模式对基质胶中的类器官进行成像。采用 Cellcyte 内置软件对汇合区域和类器官大小进行分割与计算。使用置于37°C、5% CO₂培养箱内的 Incucyte S3（Sartorius）测量 BeWo 细胞的生长情况，并通过 Incucyte 内置软件计算汇合度。
hCGβ 定量的 ELISA 检测
将 WT 和 ZBTB10 KO BeWo 细胞以每孔 3E5 个细胞的密度接种于 6 孔板中，并用 0.1% DMSO 或 2 μM FSK 处理。处理48小时后，收集200 μL细胞上清液，置于低吸附 Eppendorf 管中，并于−80°C保存，直至 ELISA 检测当天。对于 hTSC，将 Cas9 RNP 转染后的细胞培养并恢复2–3天，随后以每孔 3E4 个细胞的密度接种于玻底四孔 Ibidi 培养腔室中（货号：80426）。之后将细胞置于 STB 培养基中分化6天（第3天更换培养基），并从每孔收集200 μL上清液。按照制造商的操作说明，使用96孔 Immulon 4HBX 平底板（货号：3855）进行 hCGβ ELISA（货号：DY9034-05）。将上清液样品用试剂稀释液（PBS中含1% BSA）稀释1:2,000–1:10,000，并根据稀释倍数计算上清液的最终浓度。使用 BioRad 洗板机以 PBST 进行洗涤。ELISA 检测的成像在 BioRad 微孔板分光光度计上完成，使用……
在 450 nm 和 540 nm 处记录吸光度。为定量计算插值得到的 hCG 水平，取两条标准曲线的平均值，并对扣除背景后的吸光度与 hCG 浓度进行双对数作图，再采用线性回归进行拟合。
细胞间融合实验
按照既往方法，使用 96 孔板进行双色 BeWo 融合实验，每孔接种 10,000 个细胞，按 50:50 混合。
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使用相同的质粒制备 GFP 和 mScarlet 慢病毒，并通过在 TSC 培养基中转导 hTSC、随后使用 62.5 ug/mL Hygromycin 筛选至少 10 天，建立双色 hTSC 稳定细胞系。进行双色 hTSC 融合实验时，将 3E4 个细胞按 50:50 混合，接种于预先包被 Laminin-521 的 Ibidi 玻底四孔培养皿中。随后按上述方法将细胞分化为 STB，分化 6 天后于第 7 天固定；或保持未分化状态，并于第 3–5 天细胞长至汇合时固定。随后将 hTSC 在 PBS 中用 DAPI 染色 30 分钟，以 PBS 清洗两次，并使用 ECHO Revolution（BICO）宽场显微镜及 4X Air 物镜成像。BeWo 细胞的融合指数采用与 CRISPR 筛选完全相同的方法，使用 Harmony 软件计算。对于 hTSC，采用类似方法，通过自定义 Python 脚本进行分析：使用 Cellpose 3.0.10 版本进行细胞核分割（model = cyto2，diameter = 30 pixels，flow threshold = 0.4，cell probability threshold = 0.0），由用户设定 mScarlet 和 GFP 通道的强度阈值，随后按上述方法计算融合指数。通过 Phalloidin 染色定量未融合细胞核时，由不知晓成像条件的标注者进行手动标注。仅将具有完整、连续 Phalloidin 边界的细胞核计为“未融合”，其余均计为已融合。总细胞核通过分割获得。
使用 Cellpose，并将标注的未融合细胞核数量除以检测到的细胞核总数。
RNA-Seq
将 BeWo 细胞以每孔 3E5 个细胞的密度接种于 6 孔板中，随后分别用 0.1% DMSO 或 20 µM FSK 处理 48 小时，每 24 小时更换一次培养基。按照 Trizol 用户指南（Thermo Fisher MAN0001271），使用 500 µL Trizol 收集 BeWo 细胞，随后依次进行两次氯仿抽提，并以乙醇沉淀。将 hTSCs 以每孔 1E5 个细胞的密度接种于 Cultrex 包被的 6 孔板中，并按上述方法诱导分化为 EVT 或 STB，于第 7 天收集；未分化的 hTSCs 则在第 4 天细胞汇合时收集。使用 RNeasy mini 试剂盒（Qiagen，74104）提取 hTSC RNA。对于 BeWo RNA-Seq，使用 Illumina rRNA depletion 试剂盒（NEB E6310）去除总 RNA 中的 rRNA，随后按照制造商的方案，使用 NEBNext Ultra II directional RNA library preparation kit for Illumina（E7760）制备 Illumina 测序文库。MedGenome 使用 Illumina NovaSeq 平台进行测序，采用双端 150 bp 读长。使用 FASTQC 评估 FASTQ 文件，随后以 mapping-based 模式通过 Salmon 将其伪比对至 hg38 转录组，以定量转录本（salmon quant -i）；比对时采用 decoy-aware 策略，并使用 gencode.v39.transcripts.fa。对于 hTSCs，将纯化后的 RNA 送至 Plasmidsaurus；该机构采用 Illumina NovaSeq 测序，并使用 3′ 端计数方法。Plasmidsaurus 使用 FastP v0.24.0 对测序读段进行过滤：修剪 poly-X 尾序列和基于 3′ 端质量值的尾序列，要求最低 Phred 质量分数为 15，且最短读长为 50 bp；随后使用 STAR aligner v2.7.11 将读段比对至 hg38 参考基因组，并去除非经典剪接连接位点，同时输出未比对的读段。
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基因表达定量
使用 featureCounts（subread 软件包 v2.1.1）进行链特异性计数，对多重比对的读段进行分数分配，以外显子和 3′ UTR 作为特征标识，并按 gene_id 分组。最终的基因计数结果根据从参考 GTF 文件中提取的基因生物类型及其他元数据进行注释。所有数据集均在 Jupyter Notebook 中使用 EdgeR 进行差异基因表达分析，并通过 edgeR::filterByExpr 过滤低表达基因。使用 EdgeR makeContrasts 和 glmQLFit 对各个样本条件进行统计比较。报告的 P 值和 FDR 值使用 adjust.method = “BH” 进行校正；差异表达基因的判定标准为校正后 FDR < 0.05。可视化方面，使用 STAR 程序将 .fastq 读段比对至 hg38 基因组，为每个样本生成 .bam 文件。随后使用 bedtools 将这些 .bam 文件转换为 .bigWig 文件，并通过 IGV Viewer 进行可视化。
ChIP-Seq
将样本送至 Active Motif（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）进行 ChIP-Seq。Active Motif 负责制备染色质、进行 ChIP 反应、构建文库、对文库进行测序并开展基础分析。简而言之，将两份生物学重复的人 BeWo 绒癌细胞培养至约 50% 汇合度；这些细胞稳定过表达 N 端带标签的 Halo-3XFlag-ZBTB10（通过 Piggybac 整合，在 L30 启动子驱动下表达，并经嘌呤霉素筛选）。随后用 0.1% DMSO 或 20 μM Forskolin 处理 48 小时，并在 24 小时后更换培养基。向现有培养基中加入甲醛，使其终浓度达到 1%，固定细胞 15 分钟，随后加入 0.125 M 甘氨酸终止反应。加入裂解缓冲液分离染色质，继而使用 Dounce 匀浆器进行破碎。对裂解液进行超声处理，并将 DNA
使用 Active Motif 的 PIXUL® Multi-Sample Sonicator（目录号 53130）将其剪切至平均长度为 200–500 bp。基因组 DNA（Input）通过以下步骤制备：取等份染色质，依次进行 RNase 和蛋白酶 K 处理，并加热进行去交联，随后使用 SPRI 磁珠（Beckman Coulter）进行纯化，并通过 Qubit（Thermofisher）进行定量。根据原始染色质体积进行外推，从而确定染色质的总产量。
取 30 μg 染色质，用蛋白 G 琼脂糖磁珠（Invitrogen）进行预清除。使用 4 μg 抗 ZBTB10 抗体（Abcam，货号 ab117786，批号 1036026-8）分离目标基因组 DNA 区域。复合物经洗涤后，使用 SDS 缓冲液从磁珠上洗脱，并进行 RNase 和蛋白酶 K 处理。通过在 65°C 下孵育过夜使交联逆转，随后采用酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法纯化 ChIP DNA。
采用标准的连续酶促步骤，包括末端修复、dA 加尾和接头连接，由 ChIP DNA 和 Input DNA 构建 Illumina 测序文库。相关步骤在自动化系统（Apollo 342，Takara PrepX DNA Library Kit）上完成。经过最终 PCR 扩增后，对所得 DNA 文库进行定量，并在 Illumina NextSeq 2000 上进行测序（PE50，3000 万条 reads）。
ChIP-Seq 分析
使用 FastQC（v0.11.9）^83 对原始测序 reads 进行质量评估，以评估每个碱基的质量评分、核苷酸组成、接头污染情况以及过度代表性序列。使用 Trim Galore（v0.6.7）^84 并采用默认参数去除接头序列和低质量碱基。使用 BWA（v0.7.17）^85 将修剪后的 reads 比对至参考基因组（hg38），并使用 SAMtools（v1.17）^86 将比对结果转换为 BAM 格式。BAM 文件已】【。
随后使用 Picard（v3.0.0）去除重复读段、非主要比对、未比对读段以及比对至黑名单区域的读段。使用 MACS2（v2.2.7.1）鉴定信号富集区域，q 值阈值设为 0.1，并以相应的 input 样本作为背景。使用 epic2（v0.0.52）鉴定宽信号富集区域，q 值阈值设为 0.05，并以相应的 input 样本作为背景。使用 HOMER（v4.11）将峰注释至最近的基因和基因组特征。使用 HOMER（v4.11）对峰集进行已知及从头基序富集分析，以鉴定富集的 DNA 结合蛋白基序。峰内读段比例（FRiP）作为质量控制指标进行计算。使用 deepTools（v3.5.1）将过滤后的 BAM 文件转换为 bigWig 格式，并按每百万计数（CPM）进行标准化，以供可视化。
蛋白质印迹
细胞经胰蛋白酶消化后，加入培养基终止消化；取 1×10^6 个细胞，以 200g 离心 2.5 分钟。细胞重悬于 150 µL PBS 和 50 µL 4× SDS-PAGE 上样缓冲液中（200 mM Tris，pH 6.8；400 mM DTT；10% β-巯基乙醇；8% SDS；0.4% 溴酚蓝；40% 甘油），随后在 100°C 加热模块上煮沸 20 分钟，再于 4°C、16,000g（Eppendorf 5415）离心 3 分钟。将上清转移至新管，并于 −20°C 保存。取 35 μL 细胞裂解液上样至 4%–20% Tris-甘氨酸凝胶（Bio-Rad），并以 100 V 电泳转膜 1 小时，转至 0.45 μm 硝酸纤维素膜。转膜前，使用 5% 牛血清白蛋白溶液于室温封闭膜 1 小时；该溶液亦用于稀释一抗和二抗。在 Chemidoc 成像系统上加入 Western Lightning ECL 试剂进行成像。一抗和二抗及
浓度如下所列。
抗体
用于蛋白质印迹的抗体包括：hCGβ（1:1000；Abcam，ab53087）、ZBTB10（Bethyl，A303-257A，兔）、β-肌动蛋白（1:5000；Sigma，A2228-100UL）、抗兔HRP二抗（1:5000；Invitrogen，31462）以及抗小鼠HRP二抗（1:5000；Invitrogen，31430）。用于免疫荧光的抗体包括：HLA-G（Cell Signaling，79769，兔）、SDC1（R&D，AF2780，山羊）、ZBTB10（Thermo，PA5-54448，兔）、TFAP2A（Santa Cruz，sc-12726，小鼠）、KRT7（Abcam，ab183344，兔）、GATA3（Invitrogen，MA1-028，小鼠）、hCG（Abcam，ab53087，小鼠）、F-肌动蛋白（鬼笔环肽-Alexa594）（1:500，Invitrogen，A12381）、驴抗小鼠Alexa-647（Invitrogen，A31571）、驴抗兔Alexa-488（Invitrogen，A21206）以及驴抗山羊Alexa-594（Invitrogen，A11058）。
免疫荧光及定量分析
细胞使用含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS（PBS++）配制的4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定30分钟。使用PBS++洗涤3次后，将样品置于封闭缓冲液中封闭30分钟；封闭缓冲液由3%正常驴血清（Jackson ImmunoResearch，#017-000-121）和0.3% Triton X-100（溶于PBS）组成。将一抗以1:200的比例稀释于封闭缓冲液中，并在室温下孵育1–2小时。随后，使用IF洗涤缓冲液（含0.3% Triton X-100的PBS++）洗涤3次，每次5分钟；之后，将样品置于含二抗（1:1000稀释）和DAPI（100 ng/ml；Invitrogen，#D1306）的封闭缓冲液中，在室温避光孵育30分钟。完成最后3次洗涤后，使用ProLong抗淬灭封片剂（R&D Systems，#4866-20）和1.5H玻璃盖玻片进行封片，并使用ECHO Revolution（BICO）宽视野显微镜搭配10X空气物镜进行成像。
滋养层类器官在4°C下于PBS++配制的4% PFA中固定过夜。
随后在室温下用 PBS 洗涤 3 次，每次至少 30 分钟。滋养层类器官（TO）在 CUBIC-L 透明化液（TCI，T3740）中于 37°C 孵育 2 天进行透明化；贴壁型 EVT-TO 不进行透明化。类器官在封闭液中封闭 3 小时，随后于 4°C 与一抗孵育过夜。样本在 IF 洗涤液中洗涤 3 次，每次至少 30 分钟；随后在避光条件下，于 4°C 在封闭液中与二抗及 DAPI（100 ng/ml；Invitrogen #D1306）孵育过夜。样本再次在 IF 洗涤液中洗涤 3 次，每次至少 30 分钟，之后转移至 Ibidi 玻底培养皿中，加入 CUBIC-R+，并使用配备 20X 空气物镜的 Zeiss 扫描共聚焦显微镜成像。
为定量具有核内 ZBTB10 信号的细胞比例，使用 Cellpose 3.0.10 版对多通道共聚焦图像进行分析，并基于 DAPI 通道分割细胞核（模型 = cyto2，直径 = 30 像素，流场阈值 = 0.4，细胞概率阈值 = 0.0）。为将胞质 GFP 信号与核内信号进行比较，对每个细胞核计算定义其核周环形区域。对二值细胞核掩膜应用欧氏距离变换，生成距细胞核边界的距离图。胞质环定义为从细胞核边界外 3 个像素处开始、厚度为 5 个像素的区域（即距核边界 3–8 个像素）。根据距离变换索引，将环形区域中的像素分配给最近的细胞核。对于因细胞拥挤或接近图像边缘而无法获得有效环形区域的细胞核（环形区域面积 = 0），将其排除在分析之外。分别计算每个细胞的核区及对应胞质环区的 GFP 平均荧光强度。The file ended mid-thought at “The”; please send the remaining text to continue the translation.
核质富集比通过核内平均荧光强度除以环形区域平均荧光强度计算。若核内 GFP 强度 > 胞质环形区域强度的 1.2 倍，则将细胞判定为 GFP 阳性（核富集）。核内 ZBTB10⁺ 信号阳性细胞的百分比按 GFP 阳性（核富集）细胞核数量除以细胞核总数计算。
为定量分析 hTSC 中的荧光强度，使用 FIJI（2.16.0）分析图像，并采用自定义宏脚本半自动定义感兴趣区域（ROI）并定量荧光强度。对于 STB，使用 hCG 作为区域分割通道；对于 EVT，使用 Phalloidin 作为区域分割通道。对分割通道进行高斯模糊滤波（σ = 2），再通过手动检查确定的用户自定义强度阈值分割标记阳性区域，并生成二值掩膜。使用“Analyze Particles”功能识别二值掩膜中的阳性区域，并设置 100 像素的最小尺寸阈值以排除小碎片。通过在 ROI 管理器中对所有 ROI 应用 ImageJ 的“Measure”功能，定量测量每个 ROI 内的平均荧光强度。随后，在细胞外手动选取 4 个方形 ROI 测量背景强度。计算背景平均值并从所有 ROI 的测量值中扣除，继而计算每幅图像中各 ROI 经背景扣除后的平均荧光强度。每种条件采集 4–6 张图像，拼接后取平均值。每项成像实验均进行 3 次独立生物学重复。
胎盘组织染色
从胎盘采集全层活检样本，并用……清洗。
1× PBS。将这些活检组织包埋于 Tissue-Tek OCT 包埋剂（Sakura Finetek）中，在液氮（LN₂）蒸气相中冷冻，并储存于 −80°C。使用冷冻切片机（Leica CM1850）切取厚度为 10 μm 的组织切片，并贴附于 Superfrost Plus 显微镜载玻片（Fisherbrand）上，干燥后储存于 −80°C。染色前，将载玻片解冻至室温 10 分钟，随后在室温下用 PBS++ 孵育 20 分钟以溶解 OCT。使用防水笔（Thermo Fisher）勾画组织切片边界，并在封闭缓冲液（PBS 中含 3% 正常驴血清和 0.3% Triton X-100）中于室温封闭 1 小时。上述免疫荧光（IF）方案针对组织样本略作调整：一抗在湿润孵育盒中于 4°C 孵育过夜，二抗于室温孵育 1 小时。每次洗涤时间延长至 15 分钟。洗涤后，用 PBS 冲洗载玻片，并按照制造商说明使用 TrueBlack 脂褐素自发荧光淬灭剂（Biotium）降低背景信号，随后以 ProLong Gold 抗淬灭封片剂和玻璃盖玻片封片。使用配备 20× 空气物镜的 Zeiss 共聚焦显微镜对组织成像。
所有图像处理和定量分析均使用 Python 3.11.5，以及 scikit-image（版本 0.20.0）、NumPy（版本 1.24.3）和 SciPy（版本 1.11.1）库完成。使用 Cellpose 3.0.10 对细胞核进行分割（模型 = cyto2，直径 = 30 像素，流场阈值 = 0.4，细胞概率阈值 = 0.0）。通过人工设定 SDC1、HLA-G 或 TFAP2A 的强度阈值生成二值掩膜，并经目视检查，以准确识别背景中的阳性细胞。随后使用二值形态学方法将这些掩膜膨胀 2 个像素。
在标记边界处进行形态学运算，以计入边界处的细胞核。若细胞核面积中至少 20% 与 SDC1 或 HLA-G 掩膜重叠，则分别将其归类为 SDC1 阳性或 HLA-G 阳性。随后测量各细胞核内 ZBTB10 的平均荧光强度，并在 4 份独立患者样本中，分别计算每份胎盘样本内各细胞类型的平均值。
单核 RNA 测序（snRNA-Seq）分析
早孕期和晚孕期胎盘 snRNA-Seq 处理后 RDS 对象直接取自原论文提供的 Figshare 存储库，因此分析方法与其方法部分所述相同。
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在 R 中，将 RDS 文件载入 Seurat 对象（v5.3.0），并根据已知的 STB、CTB、融合中 STB 和 EVT 标记基因的 FeaturePlot 分布，对细胞进行人工注释（R 版本 4.5.2）
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,
93
。使用 Seurat 中的 DimPlot 绘制带注释的细胞簇。统计各簇中 ZBTB10 对数标准化计数非零的细胞数，并除以该簇的细胞总数，以获得表达 ZBTB10 的细胞百分比；随后使用 ggplot2（v4.0.2）作图。
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通过计算各簇对数标准化计数的中位数，获得 ZBTB10 的表达中位数，并使用 ggplot2 作图。
伪时间分析
基于 Wang 等人 2024 年的 8 周人胎盘 snRNA-seq 对数标准化数据，推断 STB 分化伪时间（Seurat v5.5.0；R 版本 4.5.3（2026 03-11））。
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从 .rds 文件中保留 6 个 STB 簇用于伪时间分析：eCTB_fusion（簇 8；n = 535）、eSTB_nascent（簇 7；n = 1,535）、成熟分支 1（簇 0 + 5；n = 7,350）以及成熟分支 2（簇 1 + 3；n = 7,233）。用于排序的基因通过……计算。
在四个细胞类型组之间进行 Seurat FindAllMarkers 分析（Wilcoxon 秩和检验，最小检测率为 0.1，log-fold-change ≥ 0.25，同时纳入正向和负向标志物，Benjamini–Hochberg 校正后的 p < 0.05；n = 4588 个基因）。采用 Monocle2（v2.38.0）基于对数归一化矩阵 [log(1 + 每 10,000 个计数)] 构建伪时间轨迹，使用带有估计大小因子的高斯（uninormal）表达族，并通过 DDRTree（v0.1.6）结合 reduceDimension 学习轨迹骨架，参数设置为 max_components = 2、norm_method = “none”；K = 136 个节点。使用 Monocle2 的标准 orderCells 函数，基于完整的细胞矩阵分配细胞水平的伪时间和状态；轨迹根节点设定为包含最多 eCTB_fusion 细胞核的状态。使用 ggplot2（v4.0.3）对 DDRTree 降维结果进行可视化。
单核 ATAC-Seq 分析
基序活性评分
将 Wang 等人于 2024 年发表的公开可用的 8 周人胎盘单核 ATAC-seq peak-by-cell 计数数据加载至 Seurat/Signac 对象中，并与已发表的细胞元数据进行匹配，包括 SnapATAC2 聚类标签、供体信息、质量控制指标和 UMAP 坐标。使用 Signac 通过 chromVAR 估计基序活性。将峰转换为基因组区间，并筛选保留存在于 hg38 参考基因组中的染色体。使用 RegionStats 计算区域序列统计信息。将来自 JASPAR2020 的人类转录因子位置频率矩阵与从 BeWo ZBTB10 ChIP 中鉴定的 HOMER 基序相结合，其中包括 NRF 相关基序和序列偏倚基序。将组合后的基序集合添加至 ATAC assay，并计算每个细胞的 chromVAR 偏差 Z 分数。将这些 chromVAR 分数映射至已发表的 snATAC-seq UMAP 嵌入图中，以比较滋养层细胞状态之间的基序活性。
按测序深度校正的 NRF1 残差分析
为评估 NRF1 基序活性是否独立于测序深度，我们采用线性模型，将 NRF1 chromVAR 偏离评分对每个细胞的片段计数进行回归，其中以经过对数转换的片段计数作为预测变量。模型残差被解释为经文库大小校正后的 NRF1 活性。随后，按已发表的 snATAC-seq 聚类标签对残差值分组，并以箱线图展示，以比较各聚类中经深度校正的 NRF1 活性。
多物种 scRNA-seq 比较
数据集
我们分析了 Stadtmaurer 等人于 2025 年发表的单核（人）和单细胞 RNA-seq（负鼠、小鼠、鼩猬、豚鼠、猕猴）数据集，涵盖六种哺乳动物。
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非人类真兽类及有袋类数据来自 Stadtmaurer 等人（GEO：GSE274701）：负鼠（*Monodelphis domestica*；6,761 个细胞，26 种细胞类型）、鼩猬（*Echinops telfairi*；29,652 个细胞，35 种细胞类型）、豚鼠（*Cavia porcellus*；18,131 个细胞，23 种细胞类型）和小鼠（*Mus musculus*；11,452 个细胞，33 种细胞类型）。人类（*Homo sapiens*）数据来自生殖细胞图谱（Reproductive Cell Atlas）（Arutyunyan 等，2023；325,665 个细胞，42 种细胞类型）。猕猴（*Macaca fascicu
关键词：表型CRISPR筛选 · 滋养层细胞分化 · ZBTB10 · 胎盘发育 · 细胞融合
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.29.734890v1?rss=1