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背景 代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种系统性免疫代谢性疾病，其全球患病率正迅速上升，累及近38%的成年人。肠道菌群失调及宿主遗传因素（如PNPLA3 I148M变异）可调节疾病的发生与进展。肠道通透性增加使微生物得以通过肠–肝轴移位至肝脏，促进炎症反应和代谢紊乱。然而，肝脏微生物组的组成及功能潜能尚未得到充分表征。阐明其与组织学损伤及遗传易感性的关系，可能为疾病机制提供新的见解。我们假设，在该疾病中，肝脏微生物组的组成和功能与组织学严重程度及PNPLA3基因型相关。目的 表征肝脏微生物组，并评估其与组织学严重程度及PNPLA3基因型的关联。方法 本横断面观察性研究纳入了一家三级医院的30例MASLD患者。对肝组织进行鸟枪法宏基因组测序。采用非酒精性脂肪性肝病活动度评分（NAS）评估组织学严重程度。通过PCR确定PNPLA3基因型。使用MaAsLin2进行差异丰度分析和功能富集分析。使用Mutect2鉴定体细胞变异。基于Spearman相关系数构建相关性网络。结果 组织学损伤较重（NAS≥5）的患者及PNPLA3 I148M携带者表现出体细胞突变负荷升高的趋势，同时微生物丰度显著降低。分析显示，细菌、真菌、病毒及真核生物类群均存在广泛的组成变化，涉及共生微生物谱系以及在特定条件下具有致病潜能的微生物谱系。在晚期疾病患者和PNPLA3 I148M携带者中，假单胞菌属（Pseudomonas）物种呈富集，而Siphoviridae科噬菌体呈耗竭。功能分析显示，与营养物质转运和代谢应激适应相关的通路呈富集；而TonB相关功能在晚期肝损伤中呈富集，但在PNPLA3 I148M携带者中呈耗竭。网络分析鉴定出少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas leidyi）为与己糖胺代谢相关的关键节点。肠沙门氏菌（Salmonella enterica）的丰度与体细胞变异负荷呈正相关，提示微生物特征可能与基因组不稳定性存在联系。组织学进展和PNPLA3风险基因型均伴随着显著的网络拓扑简化，反映出微生物群落结构的韧性降低。结论 MASLD中的肝脏微生物组是一个低生物量、多微生物界共存的生态系统，其组成受宿主遗传背景影响。其功能活性、分类组成和系统架构均与肝脏DNA不稳定性及组织学损伤严重程度呈双向关联。核心提示 本研究利用基于FFPE样本的宏基因组学技术，对MASLD中的多界肝脏微生物组进行了表征。我们证实，随着组织学严重程度增加以及PNPLA3风险基因型的存在，微生物丰度显著下降，其中包括细菌、真菌、原生生物和病毒。研究结果并未显示整体多样性发生普遍性变化，而是表明疾病进展可能与特定的功能适应及微生物网络连接的简化相关。此外，我们还描述了特定分类群与体细胞突变负荷之间的关联，提示微生物信号可能与基因组不稳定性存在联系。这些发现表明，肝脏微生物组整体的变化，而非特定分类群的改变，影响代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的病理生理过程。
代谢功能障碍相关脂肪变性肝病中，肝脏微生物组组成与组织学严重程度及 PNPLA3 基因型相关 | bioRxiv
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代谢功能障碍相关脂肪变性肝病中，肝脏微生物组组成与组织学严重程度及 PNPLA3 基因型相关
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Julieta
Trinks
DOI：
https://doi.org/10.64898/2026.06.30.735597
Maria F Mascardi
1
转化医学与生物医学工程研究所（IMTIB）—国家科学技术研究委员会（CONICET）—意大利医院大学—布宜诺斯艾利斯意大利医院，阿根廷布宜诺斯艾利斯自治市 C1199
2
国家科学技术研究委员会（CONICET），阿根廷布宜诺斯艾利斯自治市 C1425
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Rosario Taussig
3
澳大利亚大学工程学院，LIDTUA-CIC，阿根廷布宜诺斯艾利斯省皮拉尔 B1630FHB
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Ivan Privitera Signoretta
2
国家科学技术研究委员会（CONICET），阿根廷布宜诺斯艾利斯自治市…
布宜诺斯艾利斯自治市 C1425，
阿根廷
4
化学工程试验工厂（PLAPIQUI），国家科学技术研究委员会（CONICET），南方国立大学
，布兰卡港 B8000，布宜诺斯艾利斯省，
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Barbara Suarez
1
转化医学与生物医学工程研究所（IMTIB）——国家科学技术研究委员会（CONICET）——意大利医院大学——布宜诺斯艾利斯意大利医院
，布宜诺斯艾利斯自治市 C1199，
阿根廷
2
国家科学技术研究委员会（CONICET）
，布宜诺斯艾利斯自治市 C1425，
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Sebastian Marciano
2
国家科学技术研究委员会（CONICET）
，布宜诺斯艾利斯自治市 C1425，
阿根廷
5
布宜诺斯艾利斯意大利医院内科临床服务部肝病科
，布宜诺斯艾利斯自治市 C1199，
阿根廷
6
布宜诺斯艾利斯意大利医院研究部
，布宜诺斯艾利斯自治市 C1199，
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Paola Casciato
5
布宜诺斯艾利斯意大利医院内科临床服务部肝病科
，布宜诺斯利市 C1199，
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Adrian Narvaez
5
布宜诺斯艾利斯意大利医院内科临床服务部肝病科
，布宜诺斯艾利斯自治市 C1199，
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Leila Haddad
5
肝病科，内科临床服务部，布宜诺斯艾利斯意大利医院
，阿根廷布宜诺斯艾利斯自治市 C1199，
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Adrian Gadano
5
肝病科，内科临床服务部，布宜诺斯艾利斯意大利医院
，阿根廷布宜诺斯艾利斯自治市 C1199，
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Alberto Penas-Steinhardt
6
研究部，布宜诺斯艾利斯意大利医院
，阿根廷布宜诺斯艾利斯自治市 C1199，
阿根廷
7
基础科学系，计算基因组学实验室（GEC-UNLu），卢汉国立大学
，阿根廷布宜诺斯艾利斯省卢汉 B6700，
阿根廷
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Juan P Bustamante
2
国家科学技术研究委员会（CONICET）
，阿根廷布宜诺斯艾利斯自治市 C1425，
阿根廷
3
工程学院，澳大利亚大学，LIDTUA-CIC
，阿根廷布宜诺斯艾利斯省皮拉尔 B1630FHB，
阿根廷
8
工程学院，恩特雷里奥斯国立大学
，阿根廷恩特雷里奥斯省奥罗贝尔德 CP3260，
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Julieta Trinks
1
转化医学与生物医学工程研究所（IMTIB）——国家科学技术研究委员会（CONICET）——大学医院——布宜诺斯艾利斯意大利医院
，阿根廷布宜诺斯艾利斯自治市 C1199，
阿根廷
2
国家科学技术研究委员会（CONICET）
科学技术研究委员会（CONICET）
阿根廷布宜诺斯艾利斯自治市 C1425
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摘要
背景
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种在全球范围内迅速增加的全身性免疫代谢性疾病，影响近38%的成年人。肠道菌群失调以及宿主遗传因素（如 PNPLA3 I148M 变异）可调节疾病的发生与进展。通过肠-肝轴，肠道通透性增加使微生物易位至肝脏，进而促进炎症和代谢紊乱。然而，肝脏微生物组的组成及其功能潜力仍缺乏充分表征。了解其与组织学损伤及遗传易感性之间的关系，可能为疾病机制提供新的认识。我们假设，在该疾病中，肝脏微生物组的组成和功能与组织学严重程度及 PNPLA3 基因型相关。
目的
表征肝脏微生物组，并评估其与组织学严重程度及 PNPLA3 基因型之间的关联。
方法
本横断面观察性研究纳入了来自一家三级医疗医院的30例 MASLD 患者。对肝组织进行鸟枪法宏基因组测序。采用非酒精性脂肪性肝病活动度评分（NAS）评估组织学严重程度。通过 PCR 测定 PNPLA3 基因型。采用 MaAsLin2 进行差异丰度分析和功能富集分析。使用 Mutect2 鉴定体细胞变异。采用 Spearman 相关系数构建相关网络。
结果
组织学进展期患者……
损伤（NAS ≥5）患者及 PNPLA3 I148M 携带者的体细胞突变负荷呈升高趋势，微生物丰度则显著降低。分析显示，细菌、真菌、病毒和真核生物类群的组成均发生广泛变化，涉及共生菌以及随环境变化而具有致病潜能的菌群谱系。晚期疾病患者及 PNPLA3 I148M 携带者中，假单胞菌属（Pseudomonas）富集，而 Siphoviridae 科噬菌体减少。功能分析显示，营养物质转运和代谢应激适应相关通路富集；TonB 相关功能在晚期肝损伤中富集，但在 PNPLA3 I148M 携带者中减少。网络分析鉴定出 Sphingomonas leidyi 为与己糖胺代谢相关的关键节点。肠沙门氏菌（Salmonella enterica）的丰度与体细胞变异负荷呈正相关，提示微生物特征可能与基因组不稳定性相关。组织学进展和风险型 PNPLA3 基因型均伴随显著的网络拓扑简化，反映出群落结构的韧性降低。
结论
MASLD 肝脏微生物组是一个低生物量、多微生物类群构成的生态系统，其特征受宿主遗传背景影响。其功能活性、分类组成和系统结构与肝脏 DNA 不稳定性及组织学损伤严重程度呈双向关联。
核心要点
本研究利用基于 FFPE 样本的宏基因组学，对 MASLD 中的多界肝脏微生物组进行了表征。我们发现，随着组织学严重程度增加及 PNPLA3 风险基因型的出现，微生物丰度（包括细菌、真菌、原生生物和病毒）显著下降。结果显示，疾病进展可能与特定功能适应及群落结构简化相关，而非整体多样性变化。
微生物网络连通性。此外，我们描述了特定分类群与体细胞突变负荷之间的关联，提示微生物信号与基因组不稳定性之间可能存在联系。这些发现表明，影响 MASLD 病理生理过程的是肝脏微生物组整体的变化，而非特定分类群的改变。
引言
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是系统性免疫代谢紊乱在肝脏的表现，临床定义为存在肝脂肪变性，同时至少伴有一项心脏代谢危险因素 [1]。这一更新后的命名更准确地反映了该疾病与系统性代谢失调的内在联系，并将其与此前称为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的疾病名称区分开来 [2]。MASLD 带来的全球健康负担沉重且日益加剧：其患病率已从十年前估计的 14%–27% 飙升至目前成年人口的 38%，这与肥胖和 2 型糖尿病患病率的上升相呼应 [3]。MASLD 的临床意义在于其可能进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）。MASH 是一种具有强烈炎症反应的疾病状态，可导致纤维化、肝硬化和肝细胞癌，因此 MASLD 已成为肝移植的主要病因之一 [4]。
MASLD 的发病机制具有多因素性，涉及遗传易感性与环境因素之间的复杂相互作用 [5]。全基因组关联研究已发现若干宿主基因变异与该疾病相关，其中含 patatin 样磷脂酶结构域蛋白 3（PNPLA3）的 I148M 变异（rs738409）是 MASH 和晚期纤维化最强的遗传风险因素之一 [6]。然而，近期研究认识到 MASLD
作为一种生态生物学疾病，肝病风险不仅受到宿主遗传因素和环境的影响，还受到肠道微生物组的生态构成及其功能性产出的影响。这一观点将疾病易感性重新界定为部分具有情境依赖性，并由微生物群介导
[
7
]
。
从这一角度来看，MASLD发病过程中的一个核心要素是肠-肝轴，该轴描述了肠道、肠道微生物组与肝脏之间双向的生理和解剖学联系
[
8
]
。在MASLD中，肠道屏障的完整性通常受到破坏，导致肠道通透性增加。这使得微生物相关分子模式（MAMPs）能够从肠腔移位至门静脉循环。到达肝脏后，这些分子会启动并维持慢性炎症和纤维化进程，扰乱肝脏脂质和葡萄糖稳态，或诱导直接的肝毒性
[
9
]
。这种关系是双向的，因为肝脏通过向肠道分泌胆汁、IgA和抗菌肽，主动塑造肠道微生物组。反过来，患病肝脏的环境以胆汁流动改变和组织缺氧为特征，也可进一步重塑肠道微生物群落，通常促成致病性构型，并形成推动疾病进展的自我维持性循环
[
9
,
10
]
。值得注意的是，携带PNPLA3风险等位基因GG的个体已被证实具有独特的肝脏微生物组特征，这反映了MASLD的复杂性，并提示宿主遗传因素、局部微生物组与代谢性炎症之间存在复杂的相互作用，共同推动疾病发生发展
[
11
]
。
尽管相关证据日益增多，肝组织的组成及其功能潜能♀♀♀♀♀♀
肝脏微生物组本身，尤其是其非细菌组分，仍未得到充分表征。探讨人类微生物组对 MASLD 病理生理影响的大多数研究，仅关注肠道微生物组，或采用 16S rRNA 基因测序分析肝脏微生物组；这类方法在分类学上存在局限，且仅考察了微生物组中的细菌组分[11, 12]。因此，我们旨在全面表征 MASLD 患者的肝脏宏基因组。此外，我们还评估了其与组织学损伤严重程度及 PNPLA3 风险基因型之间的关联，从而为肝内微生物生态系统在 MASLD 进展中的作用提供新的见解。
材料与方法
本研究为横断面分析性观察研究，遵循《赫尔辛基宣言》的原则开展，并经布宜诺斯艾利斯意大利医院伦理委员会批准。
参与者筛选与样本采集
本研究回顾性选取了 30 例成年 MASLD 患者；这些患者此前由本研究团队在 MASLD 相关研究中招募[13]，本次根据肝损伤程度进行筛选。30 名受试者中，一半组织学肝损伤程度较低，归入低 NAS 组（NAS 评分≤4）；其余 15 例患者损伤程度较高，归入高 NAS 组（NAS 评分≥5）。所有患者均在布宜诺斯艾利斯意大利医院肝病科招募。通过肝活检确诊 MASLD，并结合标准医疗实践排除其他肝病[14]。MASLD 患者的排除标准包括：血吸虫病、除 MASLD 外的任何肝病、预期的…
一年内需要进行肝移植或出现终末期肝病并发症、合并其他疾病以及存在肝活检禁忌证。此外，所有MASLD患者均通过采用Architect Abbott系统（Abbott Diagnostics，德国威斯巴登）检测HBsAg、抗-HBc IgG和抗-HCV IgG，排除了乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染。
在超声引导下经皮获取肝活检标本。根据肝活检组织条的长度和直径评估标本的充分性。因此，使用16号穿刺针获取的长度为15至25 mm的标本被认为是充分的。由医院病理科的肝脏病理学专家依据NAFLD活动性评分（NAS评分）的组成部分，对标本组织学损伤的严重程度进行评估。组织样本经福尔马林固定，随后以石蜡包埋（FFPE组织），并在室温下保存。
此外，每位参与者均提供空腹血样，并接受人体测量学评估。同时记录人口学资料和病史。血样采集于三钾-EDTA管中，随后立即进行处理，以分离血浆并分离外周血单个核细胞（PBMC），并储存于−80°C。
DNA提取及PNPLA3 SNP rs738409的测定
按照生产商的操作规程，使用QIAamp® DNA Mini Kit（QIAGEN GmbH，德国希尔登）从分离的PBMC中提取基因组DNA。采用引物对5′-CGA TCT AGC CCC TTT CAG TC-3′（正向）和5′-GCA GAT TAA GTG AAC CAG CC-3′（反向），通过PCR对PNPLA3-SNP进行部分扩增。PCR程序包括40个循环，每个循环包括94°C变性30秒，退火】【。
在 62°C 下退火 30 秒，并在 72°C 下延伸 1 分钟。PCR 产物长度为 668 个碱基对。电泳在 TBE 缓冲液中以 100 V/min 进行，随后用溴化乙锭染色，并在紫外光下通过 2% 琼脂糖凝胶观察产物。
使用 Big-Dye Terminator 化学测序系统（Applied Biosystems，Life Technologies Corp.，美国加利福尼亚州福斯特城）对 PCR 片段进行双向测序，并使用 BioEdit Sequence Alignment Editor（版本 7.1.3.0）分析测序色谱图。
FFPE 组织 DNA 提取、鸟枪法宏基因组测序及 DNA-seq 数据处理
随后从每个 FFPE 组织块切取 10 张厚度为 10 μm 的切片，并使用 QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit（QIAGEN®）提取 DNA。鸟枪法宏基因组测序文库按照 Illumina DNA Prep 方案（Illumina®）制备。所有操作均在无菌条件下进行，以避免污染。文库构建完成后，使用 Qubit® 4.0 和 Qubit® dsDNA 高灵敏度检测试剂（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）分别定量。随后将所有文库按等摩尔比例混合，并使用 High Sensitivity DNA kit（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）在 Bioanalyzer 2100 上进行评估。DNA 测序采用 Illumina® NextSeq 550 测序仪，以 2×150 bp 双端模式进行。
共获得 189,696,188 条测序读段。使用 Trimmomatic v.0.39 对原始读段进行处理，以去除接头序列并修剪低质量碱基。质量控制后，保留 162,838,445 条读段（占原始数据的 85.84%）。随后使用 Bowtie2 将这些读段比对至扩展的人类参考基因组（db GRCh38），以过滤宿主来源序列。
最终，共有1,206,693条序列（占去除接头及低质量序列后序列的0.74%）通过了过滤步骤，并用于后续分析。
肝脏宏基因组的分类学与功能表征
使用DIAMOND将短序列比对至NCBI RefSeq非冗余蛋白质数据库（2022年2月版本）
[
15
]
，随后使用MEGAN6-C.E进行分类学和功能分箱（LCA参数：最小比特评分为87，top percent为5，最少分配序列数为3）
[
16
]
。为减少错误分类，被归类于后口动物（Deuterostomia）、泛节肢动物（Panarthropoda）和绿色植物（Viridiplantae）的序列被排除在后续分析之外。采用这一步骤是因为DIAMOND–MEGAN工作流程具有如下特性：单条短序列可能会在亲缘关系较远的多个分类单元中产生多个显著比对结果。MEGAN在进行LCA计算时会纳入所有此类匹配结果，并将每条序列沿所有祖先节点逐级向上传播，从而使低频的伪影匹配结果扩大在生物学上不合理的真核生物类群。考虑到FFPE肝活检样本中的微生物生物量较低，且此类样本易受到宿主序列残留和环境污染的影响，前述较高阶真核生物分类单元通常反映的是错误分类或外源DNA，而非真实的肝脏微生物组成员。该方法遵循MEGAN针对人类相关微生物组数据集所推荐的污染过滤实践，即允许排除完整的分类谱系
[
17
]
。
在科、属和种水平上评估分类学组成。在功能表征方面，将预测的蛋白质结构域映射至InterPro蛋白质家族数据库
[
18
]
；同时，通过映射至eggNOG数据库
[
19
]
，基于直系同源关系推断其功能。
所有获得的肝脏微生物组
分别按 NAS 评分（NAS≥5 vs. NAS≤4）和 PNPLA3 基因型（GG 基因型 vs. CC/CG 基因型）对组间数据进行比较。采用 MaAsLin2 软件[20]进行差异丰度分析和功能富集分析。为校正样本间测序深度的差异，采用“累积和尺度”（CSS）标准化方法。组间统计比较采用“负二项”模型；该模型尤其适用于宏基因组计数数据，因为能够处理微生物数据集中常见的过度离散现象[20]。当某一变量（分类学或功能特征）至少在 10 个样本中被观察到，且显著性阈值为 q<0.01 时，认为差异具有统计学意义。
采用 Shannon 指数和 Chao1 指数计算物种 α 多样性，并使用 Wilcoxon 检验比较组间差异。计算 Chao1 指数时，通过随机无放回抽样将测序读数标准化至测序深度最低的样本。基于 Bray-Curtis 距离评估 β 多样性，并使用 PERMANOVA 进行统计比较。所有多样性分析均在 R 中使用 vegan 软件包完成[21]。两种情况下均将显著性阈值设为 p<0.05。
FFPE 肝活检组织体细胞突变负荷分析
由于宏基因组分析与体细胞变异分析的目标不同，我们采用了针对各自分析流程优化的不同质量控制流程。宏基因组分析流程旨在去除人源序列并保留微生物 DNA，而体细胞变异分析则要求将序列高精度比对至人类参考基因组。因此，用于体细胞变异检测的原始读段经过了以下处理：
KneadData v.0.6.1（包含于 bioBakery3 平台中）
[
22
]
集成了 Trimmomatic v0.39
[
23
]
，用于去除接头序列和低质量碱基，并集成了 Bowtie2
[
24
]
，用于利用 SILVA 数据库
[
25
]
过滤污染微生物序列。
随后，使用 BWA-MEM
[
26
]
将高质量测序读段比对至人类参考基因组（GRCh38，获取自 https://storage.googleapis.com/gcp-public-data--broad-references/hg38/v…）。使用 Samtools
[
27
]
将生成的 SAM 文件转换为 BAM 格式，并使用 GATK v4.2
[
28
]
进行下游处理。处理步骤包括使用 AddOrReplaceReadGroups 添加读段组信息、使用 SortSam 排序，以及使用 BuildBamIndex 为 BAM 文件建立索引。
使用 Mutect2
[
29
]
以仅肿瘤模式进行体细胞变异检测，并采用 af-only-gnomad.hg38.vcf.gz 数据库作为胚系变异资源（下载自 https://www.bcgsc.ca/downloads/morinlab/reference/af-only-gnomad.hg38.v…）。使用 FilterMutectCalls 对初始变异检测结果进行过滤。为确保变异检测结果具有较高置信度，随后使用 bcftools
[
27
]
进行严格的二次过滤，仅保留测序深度（DP）≥20、等位基因频率（AF）≥0.05 且肿瘤对数几率评分（TLOD）≥6 的变异。
使用 Ensembl 变异效应预测工具（VEP）网页界面
[
30
]
对过滤后的变异进行功能注释。为对各样本中检出的体细胞变异数量进行归一化，我们使用 samtools
[
27
]
计算高质量且唯一比对的读段数量。首先，使用 GATK 的 MarkDuplicates 工具标记重复读段。随后，为生成的 BAM 文件建立索引，并使用 samtools view -c -F 0x904 -q 20 进行处理；该命令统计比对质量（MAPQ）≥20 的初级比对记录，
同时排除未比对 reads、次级比对和 PCR 重复序列。每个样本的最终变异数通过将变异总数除以高质量比对 reads 数量，再乘以一百万进行标准化。随后使用标准化后的变异数估算每个样本的体细胞突变负荷。
在进行统计比较前，依据 Tukey 标准（数值高于 Q3 + 1.5×IQR）评估标准化体细胞突变负荷值的分布是否存在离群值。识别出的离群样本不纳入后续统计分析。使用 R 进行统计比较，采用双样本 t 检验评估按 NAS 评分和 PNPLA3 基因型分层的组间差异。
相关网络分析
为探究与 MASLD 肝损伤及遗传相关风险有关的微生物分类群、功能特征和体细胞改变之间的潜在相互作用，分别针对所有研究组进行相关网络分析，并按 NAS 评分（NAS≥5 和 NAS≤4）及 PNPLA3 基因型（GG 和 CC/CG）分层。输入数据集包括：(i) 根据所有肝脏宏基因组中物种水平的 reads 计数确定的宏群落组成；(ii) 每个样本中检测到的体细胞变异标准化数量（以每百万高质量比对 reads 的变异数表示）；(iii) 与 NAS 评分或 PNPLA3 基因型显著相关的 InterPro 蛋白家族（q<0.01，且至少存在于 10 个样本中）；以及 (iv) 按相同纳入标准筛选出的具有统计学显著性的 eggNOG 直系同源组。
相关性分析使用 Hmisc R 软件包[31]进行，依据 Spearman 相关系数。仅纳入显著的
相关性分析中，保留满足 |ρ|>0.75 且 p<0.01 的相关关系用于构建网络。采用 R 软件包 igraph v.1.2.7 [32] 生成加权相关网络，并使用 Cytoscape v.3.71 [33] 进行网络可视化。为推断这些网络所表示系统中各变量或节点的调控相关性并识别潜在关键节点，使用 igraph 软件包 [32] 计算拓扑参数，包括度中心性（即节点在网络中的连接数）和特征向量中心性得分（即节点参与连接其他节点路径的程度，并根据其他节点的度得分进行加权）。在计算条件允许时，采用最优聚类算法进行模块度分析（即网络划分为相互独立的组或模块的程度）；否则采用 Louvain 聚类算法 [34, 35]。
统计分析
描述性统计结果以均值和标准差（SD）表示，或以绝对数及相应百分比表示。分类变量采用列联表和 Fisher 精确检验进行分析，连续变量采用 Mann–Whitney U 检验进行评估。统计分析使用 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) v.18.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）完成，以 p 值<0.05 为差异具有统计学意义的判定标准。
其他统计分析使用 RStudio（版本 1.3.193；RStudio Team，2020）完成，图形输出使用 ggplot2 软件包 [36] 生成。
结果
招募队列的临床、流行病学和遗传学数据
30 名入组受试者的主要特征见表 1。如图所示，
在该表中，两组在任何可被视为混杂因素的变量方面均表现出高度同质性，从而最大限度地降低了其对肝脏宏基因组分析的潜在影响。
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表1.
受试者特征
肝组织宏基因组特征
首先，评估了每组肝脏宏基因组中各微生物域所占的比例，结果显示，细菌基因丰度最高，其次依次为真菌、原生动物、病毒和古菌（表2）。比较两组中分别属于各微生物域的测序读段数量后发现，低 NAS 组患者中的细菌（p<1.00E-5）、真菌（p<1.00E-5）、原生动物（p<1.00E-5）和古菌（p=0.03）丰度均显著更高（表2）。
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表2.
根据 NAS 评分划分的各微生物域宏基因组测序读段数量分布
研究人员进一步根据受试者的 PNPLA3 基因型开展了相同类型的分析。在这一分析中，尽管细菌在两组受试者的肝脏微生物组中均占主导地位，但 GG 基因型受试者微生物组中的真菌测序读段比例高于原生动物，而在另一组中则低于原生动物（表3）。在根据受试者基因型对宏基因组各微生物域的测序读段数量进行统计学比较时发现，与另一组相比，GG 基因型组中的细菌（p<1.00E-5）、真菌（p=6.68E-4）和原生动物（p=0.03）丰度均显著降低（表3）。
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表3.
各微生物域宏基因组测序读段数量分布
依据 PNPLA3 基因型
随后，对肝组织样本中的宏基因组多样性进行分析，以评估其是否与组织学及遗传因素相关。
按 NAS 评分和 PNPLA3 基因型分组后，Shannon 指数和 Chao1 指数均未显示组间具有统计学显著差异的 α 多样性差异（图 1）。
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图 1.
按组织学严重程度和 PNPLA3 基因型划分的 MASLD 研究组的 α 多样性。
箱线图展示了按 NAS 评分（A）和 PNPLA3 I148M 基因型（B）分层的肝脏宏基因组在物种水平上的 Shannon 指数和 Chao1 指数。Chao1 值是在将读数计数稀释至最低样本测序深度后，通过不放回随机抽样计算得到（vegan::rrarefy）[21]；Shannon 指数则根据原始物种丰度表计算。散点代表单个样本；箱线图显示中位数和四分位距。组间比较采用 Wilcoxon 检验，统计学显著性定义为 p < 0.05。
与 α 多样性结果一致，按任一标准分组，β 多样性均未观察到具有统计学显著性的组间差异。
组成与差异丰度分析
在科、属和种水平上分析了肝脏微生物群落的分类组成。各分类单元对应的读数数量详见补充表 1；描述性分析中检出的优势物种相对丰度见图 2。在这些优势微生物中（定义为任一组中相对丰度超过 0.5% 的微生物），细菌占主导地位。然而，也检测到了原生动物（Plasmodium
卵形疟原虫（Plasmodium ovale）、真菌（烟曲霉 Aspergillus fumigatus、限制马拉色菌 Malassezia restricta）、病毒（未分类的 Siphoviridae 物种、Mycolicibacterium 噬菌体 J1）以及其他真核生物（巴布亚旋毛虫 Trichinella papuae、Diploscapter pachys）也以较高的相对丰度存在（图2）。
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图2。
按 NAS 评分和 PNPLA3 基因型分层的肝脏宏基因组物种水平分类组成。
堆叠柱状图显示了肝组织宏基因组中检测到的微生物物种相对丰度（%），并分别按照（A）依据 NAS 评分确定的组织学疾病严重程度（低 NAS 与高 NAS）以及（B）PNPLA3 基因型（CC/CG 基因型与 GG 风险基因型）进行分层。仅纳入至少在 10 个样本中出现，且在至少一个比较组中的相对丰度超过 0.5% 的微生物物种。
在评估各样本间的物种流行率时，我们发现，在所鉴定的 1411 个物种中，仅有 40 个物种在至少三分之一的队列样本中被检测到（补充表1）。这表明该队列的宏基因组组成具有高度异质性。尽管整体群落结构存在显著的个体间差异，但在不同疾病阶段和遗传背景下，仍持续存在一组核心优势分类单元。不同组织学分层和基因型分层中最丰富物种的组成保持一致，其中痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）均位居首位（低 NAS=17.57%，高 NAS=17.54%；CC/CG 基因型=17.59%，GG 基因型=17.53%），其次为卵形疟原虫（Plasmodium ovale）（低 NAS=7.72%，高 NAS=7.17%；CC/CG 基因型=8.90%，GG 基因型=6.38%）和限制马拉色菌（Malassezia restricta）（低 NAS=4.53%，高 NAS=3.63%；CC/CG 基因型=4.52%，GG 基因型=3.95%）（图2）。
为表征肝脏的组成模式，
为探讨肝脏宏基因组与MASLD肝组织学损伤程度之间的关联，在不同分类学层级开展了差异丰度分析。
补充表2列出了组间存在统计学显著差异的分类单元的完整清单，而图3展示了各分类学层级中倍数变化系数最高的前10个分类单元。
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图3.
根据MASLD组织学严重程度分析肝脏微生物组的分类学差异丰度。
对低NAS评分组（绿色）与高NAS评分组（红色）患者的肝脏宏基因组进行差异丰度分析。该图展示了按组织学严重程度分层后，各分类学等级中倍数变化系数最高的前10个分类单元的相对丰度。各面板分别显示科（A）、属（B）和种（C）水平的结果。
总体而言，低NAS组与高NAS组之间共有23个种、24个属和23个科表现出显著差异。尽管大多数变化涉及细菌分类单元，但真菌（Aspergillus fumigatus）、病毒（Mycolicibacterium噬菌体J1、Siphoviridae、Podoviridae）以及真核生物（Diploscapter pachys、Rhabditidae）也受到影响（补充表2）。高NAS组中富集最为显著的分类单元包括Pseudomonas sp. 43_2001、Rhodococcus、Marmoricola、Caulobacteraceae以及线虫科Rhabditidae；而Staphylococcus epidermidis、Acinetobacter、Roseomonas、Moraxellaceae、Bifidobacteraceae和Siphoviridae则表现出明显耗竭（图3）。
按照PNPLA3基因型进行分层的类似分析显示出显著的组成差异（补充表3；图4）。总体而言，共有22个种、39个属和36个科……
在GG组与CC/CG组之间存在丰度差异，且总体上以GG基因型携带者中分类单元的减少为主。尽管细菌占丰度发生变化的分类单元的大多数，但真菌（烟曲霉，Aspergillus fumigatus）、病毒（分枝杆菌属噬菌体J1，Mycolicibacterium phage J1；短尾噬菌体科，Podoviridae）及真核生物（巴布亚旋毛虫，Trichinella papuae；Diploscapter pachys；小杆线虫科，Rhabditidae；旋毛虫科，Trichinellidae）谱系也受到显著影响（补充表3）。在最显著的基因型相关变化中，GG基因型携带者的肠沙门菌（Salmonella enterica）和烟曲霉丰度明显降低，而假诺卡菌属（Pseudonocardia）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）、赤杆菌科（Erythrobacteraceae）及草酸杆菌科（Oxalobacteraceae）则呈富集。相比之下，不动杆菌属（Acinetobacter）、泛菌属（Pantoea）、莫拉菌科（Moraxellaceae）、巴斯德菌科（Pasteurellaceae）及旋毛虫科在GG基因型组中的丰度降幅最大（图4）。
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图4.
MASLD患者中不同PNPLA3基因型对应的肝脏微生物组分类单元丰度差异。
对携带PNPLA3 CC/CG基因型（蓝色）与GG基因型（橙色）的患者进行肝脏宏基因组差异丰度分析。图中按PNPLA3基因型分层，展示了各分类等级中倍数变化系数最高的前10个分类单元的相对丰度。各面板分别展示科（A）、属（B）和种（C）水平的结果。
功能富集分析
在评估肝脏组织学损伤程度及宿主PNPLA3基因型对肝脏宏基因组分类组成的影响后，我们通过功能富集分析，评估了与这些特征相关的功能基因潜能变化。为获得更稳健的功能表征，这些比较分别基于InterPro和eggNOG两个不同的数据库进行。
根据组织学损伤程度比较受试者的功能潜能时，我们发现，属于22个InterPro蛋白质家族（高NAS组中18个富集、4个减少）和16个eggNOG直系同源组（高NAS组中11个富集、5个减少）的基因丰度存在显著差异。在观察到的最显著变化中，高NAS组中属于TonB依赖性受体样蛋白家族（回归系数=2.33）、RND外排泵（回归系数=1.91）和HTH AraC型转录调节因子家族（回归系数=1.71）的基因丰度明显增加。
此外，与ABC型甘油-3-磷酸转运系统（回归系数=2.52）和ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基（回归系数=1.70）相关的eggNOG直系同源组也显著富集（图5）。
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图5.
MASLD中与组织学严重程度及PNPLA3基因型相关的肝脏宏基因组功能富集模式。
富集谱比较了高NAS评分与低NAS评分受试者，以及PNPLA3 GG基因型与CC/CG基因型携带者。功能注释来源于两个互补数据库：InterPro和eggNOG。点的颜色表示统计学显著性水平，以−log10（q值）表示。三角形标记对应InterPro数据库注释的功能特征，圆形标记代表eggNOG注释的功能特征。点的大小反映检测到各功能特征的样本数量。仅展示在超过10个样本中观察到且组间富集差异具有统计学显著性的功能。
根据PNPLA3基因型评估受试者的功能潜能时，我们
鉴定出与24个InterPro蛋白家族（风险基因型组中16个富集、8个减少）和10个eggNOG直系同源组（同组中6个富集、4个减少）相关的基因丰度存在显著差异。值得注意的是，GG基因型组中，与InterPro家族中的细菌型DNA依赖性RNA聚合酶β′亚基（回归系数=1.64）和HAD超家族IIB亚家族水解酶（回归系数=1.60），以及eggNOG直系同源组中的ABC型多药转运系统（回归系数=1.46）相关的基因显著增加。相比之下，属于InterPro家族中的TonB依赖性受体样蛋白（回归系数=-1.76）和eggNOG直系同源组中的转录-修复偶联因子（回归系数=-0.84）的基因显著减少（图5）。
体细胞突变负荷分析
为评估体细胞突变负荷与疾病严重程度或遗传背景之间的潜在关联，我们比较了不同NAS评分亚组和PNPLA3基因型亚组之间的标准化体细胞变异数量。各样本体细胞突变负荷分析的详细列表见补充表4。
根据Tukey准则，两个样本被判定为离群值，并被排除在统计分析之外。在评估体细胞突变负荷与疾病严重程度的关系时，高NAS组患者的平均标准化变异数量高于低NAS组患者（148.85比132.65）；但这一差异无统计学意义（t=1.92，p=0.067）。同样，按PNPLA3基因型分层时，与未携带风险相关等位基因的个体相比，携带者的体细胞突变负荷呈升高趋势（144.14比134.32），但差异未达到统计学
显著性（t = -1.08，p = 0.293）。
相关性网络分析
在NAS评分较高的患者中，所构建的网络包含114个节点，由151条显著相关的边连接，平均连通度（即平均节点度）为每个节点2.64条边（图6）。在这些关联中，仅有一条为负相关，表明该网络整体呈协同结构。度中心性得分最高的节点为Shinella fusca、Sphingomonas leidyi、Acidobacteria bacterium RIFCSPLOWO2_12_FULL_67_14b和Sphingomonas sp. 67-41。特征向量中心性得分显示，Sphingomonas leidyi是最具影响力的节点，其次为Shinella fusca、Acidobacteria bacterium RIFCSPLOWO2_12_FULL_67_14b和Sphingomonas sp. 67-41。所有这些节点均属于同一模块。其较高的特征向量中心性值凸显了这些分类单元与网络核心的高度整合，以及它们对其他节点的共同影响，证实S. leidyi在整体网络声望方面是排名首位的关键物种。群落结构分析将网络划分为25个簇（模块度得分 = 0.78），其中一个占主导地位的簇（模块3）包含了大多数高度数和高声望节点。此外，还识别出若干中心性较低的小型外围群落，这些群落可能代表特化的或依赖于特定情境的关联，对整体网络凝聚性的贡献很小。在功能组分中，InterPro家族IPR005855（氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸氨基转移酶）表现出较高的连通度，提示其在主要微生物簇中发挥功能枢纽作用。值得注意的是，发现了Salmonella enterica与体细胞
肝组织中的变异负荷，将特定微生物谱与宿主中检测到的基因组不稳定性信号联系起来。
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图6.
高 NAS MASLD 患者肝脏微生物、功能及体细胞变量的 Spearman 相关网络。
加权 Spearman 相关网络表示组织学活动度较高（NAS ≥5）患者中微生物分类群、功能特征与体细胞突变负荷之间的显著关联。网络基于物种水平的微生物读数、归一化体细胞突变负荷（每百万条高质量比对读数中的变异数），以及与 NAS 评分显著相关的 InterPro 和 eggNOG 功能特征构建（q<0.01，至少存在于10个样本中）。仅保留 |ρ|>0.75 且 p<0.01 的相关性。绿色连线表示正相关，红色连线表示负相关。具有相同颜色的节点属于同一网络簇。节点形状表示变量类型：细菌（圆形）、病毒（箭头形）、原生动物和真核寄生虫（菱形）、真菌（三角形）、eggNOG 功能注释（方形）、InterPro 蛋白家族（八边形）以及体细胞突变负荷（六边形）。
低 NAS 网络规模更大且连接更为密集，由132个节点和335条显著连边组成，平均连接度为5.08，显著高于高 NAS 网络（
图7
）。该网络中未观察到负相关。度中心性最高的节点包括 Brevibacterium sp. CS2、InterPro 家族 IPR020449（AraC 型转录调控因子）、Cutibacterium avidum 和 Hymenobacter sp.。特征向量中心性分析显示，Cutibacterium avidum 是影响力最大的节点。由于
由于该网络的节点和边数量较多，在现有计算资源下，聚类最优社区检测算法未能收敛，因此在计算上无法应用于该网络。为此，采用 Louvain 算法推断社区结构，该算法能够对大型高连接度网络的模块化组织提供高效且可扩展的近似估计[37]。低 NAS 网络呈现出 15 个簇（模块度得分 = 0.62），且未检测到与体细胞变异负荷的显著相关性。
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图 7.
低 NAS 的 MASLD 患者肝脏微生物、功能及体细胞变量的 Spearman 相关网络。
加权 Spearman 相关网络展示了组织学活动度较低（NAS ≤4）的患者中微生物分类单元、功能特征与体细胞突变负荷之间的显著关联。网络基于物种水平的微生物组成、标准化体细胞变异计数，以及符合预设显著性和检出频率标准（q<0.01，且在 ≥10 个样本中存在）的 InterPro 和 eggNOG 功能注释构建。仅纳入满足 |ρ|>0.75 且 p<0.01 的相关关系。正相关以绿色表示，负相关以红色表示。颜色相同的节点表示属于同一簇。节点形状代表变量类别：细菌（圆形）、病毒（箭头形）、原生动物及真核寄生虫（菱形）、真菌（三角形）、eggNOG 注释（正方形）、InterPro 特征（八边形）以及体细胞突变负荷（六边形）。
按 PNPLA3 基因型分层进一步揭示了不同的网络构型。PNPLA3 GG 基因型携带者对应的网络由 79 个节点和 107 条显著相关边组成，产生了
在所有组中，其平均连接度最低（1.71）（图8）。该网络中的所有关联均为正相关。度中心性最高的节点包括嗜热氢杆菌（Hydrogenophilus thermoluteolus）、厄氏不动杆菌（Acinetobacter ursingii）、短杆菌属菌株CS2（Brevibacterium sp. CS2）和鞘氨醇单胞菌属菌株67-41（Sphingomonas sp. 67-41），而特征向量中心性始终将嗜热氢杆菌和厄氏不动杆菌识别为最具影响力的节点。该网络被划分为16个簇，模块度为0.71。
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图8. PNPLA3 GG基因型携带者肝脏微生物、功能及体细胞变量的Spearman相关网络。
加权Spearman相关网络展示了PNPLA3 GG基因型受试者中微生物类群、功能特征与体细胞突变负荷之间的显著关联。网络构建采用物种水平的微生物测序读段计数、标准化体细胞变异负荷，以及与PNPLA3基因型显著相关的InterPro和eggNOG特征（q<0.01，且在≥10个样本中存在）。仅保留|ρ|>0.75且p<0.01的相关关系。绿色边表示正相关，红色边表示负相关。颜色相同的节点属于同一簇。节点形状表示变量类型：细菌（圆形）、病毒（箭头形）、原生动物及真核寄生虫（菱形）、真菌（三角形）、eggNOG功能注释（正方形）、InterPro蛋白质家族（八边形）和体细胞突变负荷（六边形）。
相比之下，PNPLA3 CC/CG基因型网络规模最大，异质性也最高，包含149个节点和288条显著相关边，平均连接度为3.87（图9）。该网络呈现出21个负相关关系，为所有网络中最多
所有组之间的拮抗关联数量。度中心性最高的节点包括 Corynebacterium kroppenstedtii、Mycobacteroides chelonae、Paracoccus sanguinis、Pseudomonas balearica 和 Pseudomonas urumqiensis，以及功能节点 COG1309（AcrR 家族 DNA 结合蛋白）。特征向量中心性分析显示，一组高度互联的节点集中于一个主导性簇中，其中 Mycobacteroides chelonae、Pseudomonas balearica 和 Pseudomonas urumqiensis 的网络声望最高。该网络被划分为 20 个簇，并表现出最高的模块度得分（0.80）。在 Streptococcus gordonii 与肝脏体细胞变异负荷之间检测到显著的跨层关联。
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图 9.
PNPLA3 CC/CG 基因型携带者肝脏微生物、功能及体细胞变量的 Spearman 相关网络。
加权 Spearman 相关网络展示了携带 PNPLA3 CC/CG 基因型受试者中，微生物分类单元、功能特征与体细胞突变负荷之间的显著关联。网络基于物种水平的微生物组成、经标准化的体细胞变异计数，以及 InterPro 和 eggNOG 功能注释构建，并满足预先设定的统计学和流行率阈值（q<0.01，在≥10 个样本中存在）。仅纳入 |ρ|>0.75 且 p<0.01 的相关性。正相关以绿色表示，负相关以红色表示。相同颜色的节点表示其属于同一簇。节点形状反映变量类别：细菌（圆形）、病毒（箭头形）、原生动物和真核寄生虫（菱形）、真菌（三角形）、eggNOG 注释（方形）、InterPro 特征（八边形）以及体细胞突变负荷（六边形）。
讨论
关于MASLD病理生理机制的研究大多主要聚焦于肠道细菌菌群失调[38]。然而，我们的研究着眼于肝脏生态位，强调非细菌组分作为肝脏微生物组生态系统不可或缺的参与者的重要性。比较分析显示，组织学损伤较轻患者的细菌、真菌、原生动物和古菌的相对丰度显著较高。同样，与GG基因型携带者相比，CC/CG基因型患者的细菌、真菌和原生动物丰度显著较高。这些结果支持以下观点：MASLD的疾病进展和遗传易感性可能与微生物丰度的逐步下降有关，这可能反映出肝脏微环境变得更不利于微生物生存，其特征包括炎症、氧化应激或代谢组成改变。在NAS较高及GG基因型患者中观察到的多个微生物域丰度下降，与既往研究结果一致：晚期纤维化或MASH患者的肠道微生物组分类多样性和功能多样性降低[39]，肝硬化患者的真菌多样性亦有所下降[40]。尽管这一关系的因果方向尚不明确，但上述患者肝脏中微生物定植减少，可能是由于微生物经肠道屏障的易位受到更多限制，或者更有可能是由于肝脏免疫激活增强，损害了微生物的存活能力。
在分析微生物组结构时，患者组间的α多样性指数和β多样性均未见显著差异。这些结果表明，尽管特定微生物域和分类群的丰度存在差异，
总体而言，个体内及个体间的丰富度和多样性分布仍相对稳定。这一表面上的悖论此前已在MASLD相关肠道微生物组研究中有所报道[41]；在这些研究中，与疾病相关的微生物变化主要由特定分类单元或功能通路驱动，而非由整体多样性指标所反映。因此，我们的结果进一步支持这样一种观点：仅凭微生物群落结构可能无法充分捕捉具有功能意义的微生态失调，并凸显了开展整合性分析的必要性，以识别肠-肝轴上微生物活性与疾病进展之间的机制性联系。
肝脏宏基因组的分类学分析揭示了一个高度多样但分布稀疏的微生物生态景观，其中大多数物种仅在少数样本中被检测到。在鉴定出的1411个物种中，仅有40个物种出现在30个样本中的三分之一以上。这种有限且高度个体化的分布特征与低生物量肝脏微生物组受选择性压力塑造的概念相一致[42]。这可能反映了肠-肝轴上受限的微生物转移过程：门静脉主要携带脂多糖和代谢物等微生物产物，而非活的微生物[9, 43]。这些成分进入肝脏后，会被驻留免疫细胞迅速识别并中和，其中包括库普弗细胞和肝窦内皮细胞；这些细胞有助于维持肝脏免疫耐受，并防止微生物定植。此外，肝脏还通过分泌胆汁酸和产生IgA，积极参与塑造肠道微生物群落，构成维持肠-肝稳态所必需的双向反馈系统的一部分[44]。总而言之，这些高度复杂的机制可能俺去也
导致在MASLD患者肝脏微生物群落中观察到的大多数分类群的普遍存在率较低。
在肝脏样本中检出率最高的微生物分类群中，若干非细菌生物在基于NAS评分和PNPLA3基因型的各项比较中均持续出现，包括真核生物（真菌和原生动物）以及病毒。这些发现进一步证实了肝脏微生物组的多微生物特征，并提示非细菌分类群在MASLD病理生理过程中的作用可能尚未得到充分认识。既往研究已发现，局限马拉色菌（Malassezia restricta）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）等真菌物种与慢性炎症及组织纤维化有关。值得注意的是，马拉色菌属（Malassezia spp.）被认为可通过免疫激活及与胆管的相互作用加重肝脏炎症性疾病，且已在肝细胞癌和原发性硬化性胆管炎患者的肠道及肝脏中检出[45,46]。
同样，线虫Trichinella papuae和Diploscapter pachys是丰度最高的真核生物分类群，并且在基于组织学严重程度和基因型的比较中均表现出差异丰度。尽管肝脏样本中检出的蠕虫来源序列可能部分反映了环境暴露或膳食来源，但这些分类群在多名个体中持续存在，提示它们可能对肝脏微环境发挥功能性作用。值得注意的是，已知D. pachys能够产生靶向丝状真菌的抗真菌肽[47]，提示其可能参与调节真菌定植或免疫状态。这些分类群可在条件致病共生菌的框架下加以理解，即通常与宿主共生、但在宿主
免疫功能障碍或生态失衡。这一概念在黏膜微生物学领域正得到越来越多的认可，在该领域中，情境依赖性毒力在疾病结局的形成过程中发挥着核心作用[
48
]
。
病毒序列，尤其是属于 Siphoviridae 科和 Mycolicibacterium 噬菌体 J1 物种的序列，在 MASLD 患者的肝脏宏基因组中也较为丰富。近年来的诸多研究结果表明，病毒组是宿主-微生物群相互作用中一个关键但尚未得到充分研究的调节因素[
49
]
。噬菌体，例如 Siphoviridae 科的噬菌体，已知能够塑造细菌群落的结构与功能，并可能通过影响细菌抗原的可利用性、溶原性或裂解释放内毒素，间接调节免疫反应[
50
]
。在 MASLD 背景下，此类噬菌体-细菌动态可能促成 NAS 评分较高患者中富含 LPS 的肠杆菌（例如 Salmonella enterica）的富集现象。
为更好地理解 MASLD 进展过程中肝脏微生物组的生态动态，我们开展了差异丰度分析。本研究鉴定出的若干差异丰度分类群此前已被证实与代谢及免疫调节过程相关。
在 NAS 评分较高组中显著减少的表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）是一种共生性皮肤及黏膜细菌，以其免疫调节特性而闻名，包括调节 TLR 信号传导以及促进上皮屏障完整性。其耗竭与炎症性疾病易感性增加有关[
51
,
52
]
。
相反，NAS 评分较高组中 Pseudomonas sp. 丰度增加可能具有一定意义，因为某些假单胞菌（Pseudomonas）物种能够显著调节炎症反应，在
其影响遍及多种组织，主要通过细胞因子产生和群体感应通路发挥作用，凸显了其在加剧炎症状态中的作用[53,54]。这些类群可强烈激活肝细胞和库普弗细胞中的 TLR4 信号通路，促进炎症反应、谷氨酰胺酶 1 的表达及高氨血症；这些过程被认为与 MASLD 向 MASH 的进展有关[41]。这些发现与既往研究相呼应：既往研究在肥胖个体中发现了以变形菌门（Proteobacteria）为主的肝脏微生物特征，并指出这种变化与代谢性炎症及肝损伤相关，尤其见于非重度肥胖的 MASLD 患者[55,56]。
类似地，放线菌门中红球菌属（Rhodococcus）和大理石菌属（Marmoricola）的富集，可能表明脂质代谢和免疫激活发生了变化；这是因为已知这些菌属具有降解烃类的能力，并可与宿主脂质通路相互作用[57,58]。
在病毒层面，组织学损伤晚期患者及 PNPLA3 风险基因型携带者中均持续观察到长尾噬菌体科（Siphoviridae）丰度降低。这种减少可能产生免疫学影响，因为有研究提出，部分噬菌体可通过捕食细菌塑造肠道和肝脏微生物群，进而可能影响宿主免疫稳态。此类病毒种群减少，可能反映了与肝损伤相关的广泛微生态失衡[59,60]。此外，在组织学损伤晚期患者及 PNPLA3 风险基因型携带者肝脏中，该病毒科丰度降低，这与我们此前的肠道宏转录组分析结果一致：与健康队列相比，该病毒科在 MASLD 患者肠道中的转录活性较低，在 MASH 患者中也如此。
与单纯性脂肪变性患者相比，患者中亦观察到这一现象[13]。这些观察结果可通过以下假说加以理解：在疾病较为严重的状态下，肠道生态系统中的长尾噬菌体科（Siphoviridae）噬菌体发生功能性耗减，这可能限制其持续存在、发生移位或选择性定植于肝脏生态位的能力[9]。这一信号在不同生物学区室及不同方法学研究中均可重复观察到，凸显了长尾噬菌体科在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）相关微生物群失调中的潜在核心作用。鉴于该科噬菌体被认为可通过捕食作用调节细菌种群，其减少可能破坏细菌群落平衡，促进促炎类群扩增，进而影响宿主免疫应答[50]。此类改变可能促成MASLD特征性的免疫代谢紊乱，从而将噬菌体动态变化与微生物生态及宿主病理生理过程联系起来。
值得注意的是，在PNPLA3风险等位基因携带者中，许多通常被视为条件致病共生微生物的物种显著减少，包括烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）、肠沙门菌（Salmonella enterica）或巴布亚旋毛虫（Trichinella papuae）。尽管这一结果乍看似乎有悖常理，但它符合条件致病共生微生物的致病潜能具有情境依赖性这一观点[48,61]。Jochum等人强调，被归类为条件致病共生微生物的微生物，也可根据宿主免疫状态和微生物群构成发挥有益作用或维持稳态的功能。从这一角度来看，PNPLA3 GG基因型携带者中条件致病共生微生物丰度的降低，可能反映了基因型驱动的肠—肝生态系统转变，使其炎症程度更低、屏障限制性更强
表型。事实上，我们此前对MASLD患者肠道转录组和代谢组的整合分析表明，PNPLA3 GG基因型与TLR信号通路下调，以及先天免疫激活和噬菌体介导的炎症反应受到抑制相关[13]。已知PNPLA3风险等位基因可改变肝脏脂质代谢和免疫基调，并可能通过改变胆汁酸谱、抗菌肽分泌或免疫监视机制影响微生物定植[12,62]。因此，观察到的丰度降低未必意味着微生物多样性的丧失，而可能反映了一种选择性生态平衡，即PNPLA3所塑造的代谢和免疫环境限制了潜在致病共生菌的致病作用。
倍数变化系数分析表明，与MASLD进展和PNPLA3基因型相关的最显著变化主要体现在功能层面，而非分类组成层面。这提示，肝脏微生物生态系统的适应能力更多地取决于代谢多样性，而非组成变化。在NAS评分较高的患者中，观察到编码TonB依赖性受体样蛋白（IPR039423）和铁摄取调节蛋白（IPR002481）的基因富集，这与微生物对铁获取和转运的需求增加相一致。铁过载是进展期MASLD的一个公认特征，可促进氧化应激和肝细胞损伤[63,64]。TonB系统是关键的毒力决定因子，可通过促进对铁载体结合的三价铁离子及包括维生素B12在内的咕啉类化合物的摄取，使细菌能够在富铁微环境中繁衍，这或许可以解释其选择性
在促氧化性肝脏条件下扩增
[
65
,
66
]
。对于这些 TonB 系统，在 PNPLA3 GG 基因型携带者中检测到相反的模式，这提示该遗传背景下 MASLD 的致病机制可能涉及独立于肝脏铁代谢的通路。事实上，已知 PNPLA3 驱动的脂肪变性主要由脂质重塑异常介导，而非由代谢紊乱性铁蓄积所致
[
67
]
。
此外，在基于 NAS 和 PNPLA3 的两类比较中，与营养物质转运和能量代谢相关的基因均占优势，这表明随着纤维化进展，肝脏微生物群可能对营养限制和氧化应激产生了功能性适应。这些发现与肠–肝轴中所描述的“代谢应激适应”范式一致：菌群失调有利于能够 scavenging 稀缺底物，并抵抗胆汁酸和 ROS 介导毒性的微生物
[
10
]
。相反，高 NAS 肝脏中转录和翻译相关基因的减少，可能反映了代谢适应能力较低的物种发生丧失，从而导致肝脏微生物组内生物合成活性降低
[
68
]
。这些结果支持这样一种观点：MASLD 的疾病进展伴随着肝脏微生物群的代谢重编程，而非主要的分类学改变；同时，PNPLA3 相关疾病涉及不同的发病机制通路，并施加特异性的生态压力。
尽管我们的分析未发现不同组织学或遗传学亚组之间体细胞突变负荷存在统计学显著差异，但某些趋势可能提示其潜在的生物学相关性。具体而言，我们观察到，组织学严重程度更高的患者以及……中具有更高的平均突变负荷。
PNPLA3风险等位基因携带者，这与以下观点一致：随着代谢性肝损伤的进展，以及在具有遗传易感性的个体中，局部基因组不稳定性和微环境应激会加剧[69]。
这些观察结果与日益积累的证据相吻合，表明慢性肝病伴随着肝细胞显著的体细胞多样化。Brunner等[70]发现，包括NAFLD相关肝硬化在内的肝硬化肝脏，其突变负荷显著高于正常肝脏。在此基础上，Ng等[71]在包括NAFLD在内的慢性肝病患者的肝活检样本中，鉴定出代谢调控因子（如FOXO1、CIDEB、GPAM）的反复出现的体细胞突变。这些发现提示了一种模型：在慢性损伤和脂毒性应激所形成的恶劣环境驱动下，肝细胞经历某种形式的克隆选择，从而获得代谢优势。
在疾病谱的恶性肿瘤端，仅在罕见的肝细胞癌病例中记录到极高的肿瘤突变负荷，这突显出突变负荷的大幅变化最容易在晚期疾病和肿瘤背景下被检测到[72]。
相比之下，未观察到突变负荷存在统计学显著差异，可能是多种因素共同作用的结果。首先，我们的队列仅涵盖肝硬化前期的MASLD患者，且我们比较的是同一疾病内部的不同亚组，而非健康肝脏与肝硬化或癌变肝脏。因此，MASLD内部各分层之间的预期效应量小于正常组织与肝硬化或肿瘤组织之间的效应量。其次，样本量，尤其是PNPLA3非风险组的样本量（n = 10），限制了统计效能；此外，使用低起始量的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）材料，
结合旨在尽量减少伪影的严格过滤，可能降低了对低变异等位基因频率事件和小规模克隆的检测灵敏度。此外，我们对突变负荷的估计基于整个活检样本，而克隆分辨率的全基因组测序方法能够检测单个突变谱系的扩增，这些谱系在组织整体测量中可能被稀释。这些因素可能解释了为何观察到的趋势未达到统计学显著性。未来需要开展采用更大规模队列、更深度测序及克隆分辨率方法的研究，以阐明体细胞突变负荷在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）进展中的作用。
相关性网络分析表明，疾病阶段与宿主遗传背景共同塑造了肝组织微环境中的微生物相互作用模式，各组在网络总体规模、边密度和连通性方面呈现显著差异。从概念上讲，相关性网络捕捉的是具有统计稳健性的共同变化模式（正边）和相互排斥模式（负边），这些模式可能反映共同生境筛选、代谢耦联和/或拮抗相互作用的综合影响，而非直接因果关系[73]。
在按NAS分层的网络中，组织学进展伴随着显著的拓扑结构简化。低NAS组的网络规模更大、连通性更高，这与早期MASLD中更具异质性且更有利于微生物生存的肝脏环境相一致。相比之下，高NAS与网络收缩相关，这可能反映了由炎症、氧化应激、胆汁酸信号传导改变及代谢限制驱动的更强环境筛选作用，这些因素降低了生态异质性，并限制了稳定的微生物相互作用[73–75]。
基因型
分层分析揭示出更显著的差异。CC/CG网络表现出更高的连通性和模块度，且唯独该网络包含多个负相关关系，这些特征通常与复杂生态系统中的生态位分化和竞争动态相关[68]。这可能表明，在不存在风险变异的情况下，MASLD的进展可能涉及更多因素参与的微生物–宿主相互作用，其中竞争和相互排斥关系仍可被检测到[74]。
相比之下，PNPLA3 GG网络始终规模最小、连通性最低，表明其拓扑结构受到限制。鉴于I148M变异在肝细胞脂质重塑中的作用，基因型驱动的代谢决定作用可能降低肝脏环境的异质性，并缩小微生物相互作用的范围，从而在一定程度上凌驾于更广泛的生态动态之上[6]。新近研究证据支持这一解释，表明PNPLA3会影响肝脏的空间和代谢格局，并塑造MASLD中与微生物组相关的功能信号[75]。
在高NAS网络中，由Sphingomonas leidyi、Sphingomonas sp. 67-41、Shinella fusca和Acidobacteria bacterium RIFCSPLOWO2_12_FULL_67_14b组成的结构紧密的簇具有最高的度中心性和特征向量中心性得分，表明它们是关键节点。在微生物网络理论中，此类节点对生态系统结构和稳定性的影响远超其自身所占比例[73,76]。它们共同位于一个高连通性模块中，支持晚期MASLD中存在协同功能单元这一观点[73]。在功能上，该模块与InterPro家族IPR005855相关，该家族编码的氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸氨基转移酶（GFAT）是限速酶
己糖胺生物合成途径。GFAT活性升高可增强UDP-N-乙酰氨基葡萄糖的生成，而UDP-N-乙酰氨基葡萄糖是细菌肽聚糖合成的前体。肽聚糖周转加快及胞壁肽释放增加，可能激活肝细胞和肝脏驻留免疫细胞中的NOD1、NOD2等胞内模式识别受体；这些通路被认为参与肝脏炎症、胰岛素抵抗及脂肪性肝炎的发生[
77
–
79
]。因此，该主要模块可能反映了微生物对受损肝脏微环境的适应，也可能表明其主动参与代谢功能障碍和炎症的放大过程，其中包括在
Sphingomonas
属细菌中归因于细菌鞘脂的相关机制[
80
]。
最后，将网络拓扑结构与体细胞突变负荷相结合后发现，微生物信号与基因组不稳定性之间存在基因型特异性和疾病严重程度特异性的关联。在高NAS网络中，
Salmonella enterica
基因丰度与体细胞变异负荷呈正相关。实验证据表明，产生基因毒素的
S. enterica
能够诱导组织特异性的DNA损伤反应，其中以氧化应激介导的DNA损伤在肝脏中占主导地位[
81
]。这为所观察到的关联提供了生物学合理性，并支持这样一种观点：具有基因毒性或促氧化潜能的微生物组分可能参与MASLD中的基因组不稳定性[
82
]。在CC/CG网络中，
Streptococcus gordonii
丰度与突变负荷之间也观察到类似的正相关。尽管该菌通常被视为共生微生物，
S. gordonii
仍可通过其细胞壁组分和黏附素激活先天免疫通路，促进低度炎症[
83
]。长期暴露于此类炎症刺激可能促进一种、】【
促氧化的肝脏微环境，其特征是活性氧和活性氮增多、氧化还原平衡受损以及持续性免疫激活——这些均是公认的驱动DNA损伤累积的因素[84]。在此背景下，这种关联可能反映了一种间接机制，即免疫介导的氧化应激为突变发生创造了有利条件，而非直接的遗传毒性效应。
在解读这些结果时，必须考虑本研究的一些局限性。其中，基于组织的微生物组研究的主要问题之一涉及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本的使用，因为其保存过程可能导致检测到的部分微生物DNA源自石蜡块或包埋和提取过程中所用试剂引入的污染。这一问题在实体器官组织等低生物量样本中尤为突出，因为外源DNA在此类样本中相对更易被检出[85]。然而，多项研究表明，采取适当的方法学防范措施后，污染对生物学结论的影响有限。例如，对FFPE组织块、周围石蜡及提取空白对照进行比较的16S rRNA分析显示，细菌污染物主要来源于DNA提取试剂，而非石蜡或组织本身[86]。同样，其他研究发现，仅含石蜡的对照中16S扩增结果为阴性，支持石蜡对微生物信号的贡献可忽略不计这一观点[87]。在本研究中，所有肝活检标本均采用新购置的、专为FFPE组织微生物组提取设计的商业试剂盒进行处理，且所有样本均来自同一病理
中心，并在相同的实验室条件下同时进行处理。在这些标准化条件下，任何背景污染预计都会均匀分布于各样本中，从而最大限度地降低其对组间比较的影响。因此，尽管无法完全排除痕量污染的可能性，但其不太可能影响本研究观察到的差异模式。
此外，生物信息学分析流程中设置了多层严格控制，以进一步减少潜在伪影并提高结果的可靠性。分类学与功能注释采用 DIAMOND–MEGAN6 流程[88]，并使用保守的最低共同祖先（LCA）参数，包括最低比特得分为 87、最高得分百分比阈值为 5%，以及每项特征的归属至少需要 3 条读段支持。此外，所有比对至后口动物类群（Deuterostomia）、泛节肢动物类群（Panarthropoda）或绿色植物类群（Viridiplantae）的读段均被系统性地排除在下游分析之外，以避免宿主或环境 DNA 导致的错误分类。这些过滤步骤显著降低了假阳性风险，并提高了分类学和功能层面微生物谱分析的可信度。
同样，差异丰度和功能富集分析也采用了严格的统计学标准。使用 MaAsLin2 框架[20]，通过累积和缩放（CSS）标准化校正测序深度的差异，并选择负二项模型，以妥善处理宏基因组计数数据中常见的过度离散性。仅将在至少三分之一的样本中检出且校正后 q 值低于 0.01 的特征保留为显著特征。总体而言，这些限制条件确保了所报告的差异
组间差异反映了稳健的生物学信号，而非随机变异或方法学噪声，从而增强了我们研究结果的可重复性和可解释性。
最后，关于体细胞变异检测分析，缺乏针对每个样本的匹配“正常样本集合”（Panel of Normals，PoN）构成了另一项方法学局限。在没有PoN的情况下，区分真正的体细胞突变、胚系变异与测序伪影变得更加困难，尤其是在肿瘤纯度较低的样本中，例如FFPE肝组织。为解决这一问题，本研究采用了双重过滤策略，以最大限度地提高变异检测的特异性。首先，使用Mutect2以“仅肿瘤”（tumor-only）模式进行变异检测，并结合胚系参考数据库，进一步排除常见的人群变异[29]。随后，使用GATK流程中的FilterMutectCalls模块对变异进行过滤[28]，并进一步采用bcftools[27]，依据保守阈值实施严格的额外过滤。尽管缺乏匹配的正常样本参考对体细胞变异的解读施加了固有限制，但这些保守的过滤参数与高可信度胚系数据库的联合使用，有效降低了假阳性检测结果，并提高了本研究所获得突变谱的可靠性。
结论
总之，本研究证明了将肝脏微生物组作为真正的多界生态系统进行表征的可行性与价值，并整合了来源于FFPE样本的鸟枪法宏基因组数据中的细菌、真菌、原生动物、古菌、蠕虫和病毒信号。通过建立一套针对低生物量肝组织、经过严格控制且具有良好可重复性的生物信息学分析流程——包括保守的
通过分类学分类、多层次污染控制、跨界差异丰度检验、功能富集分析和网络推断，我们构建了一套在保持分析严谨性的同时最大限度挖掘生物学信息的方法学框架。研究结果表明，肝脏微生物群的功能改变较整体分类学变化更为显著；来自每个微生物界的特定微生物在不同组织学和遗传学分层之间存在差异，进一步凸显了多界分析对于理解MASLD的重要性。这些研究成果不仅揭示了肝脏生态位的生物学复杂性，也强调了开展全面、以功能为导向的宏基因组学研究对于未来沿肠-肝轴进行生物标志物发现和机制研究的重要意义。
利益冲突声明
所有作者声明，不存在任何已知的竞争性经济利益或可能被认为影响本文所报告研究工作的个人关系。
数据可用性声明
支持本研究发现的数据集已以序列读取档案（SRA）格式存储于NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA1457056），登录号为PRJNA1457056。
作者贡献
Trinks J、Bustamante JP和Penas-Steinhardt A负责研究设计与协调；Gadano A负责获取研究经费；Marciano S、Casciato P、Narvaez A、Haddad L和Gadano A负责患者招募；Mascardi MF、Taussig R、Suarez B和Bustamante JP负责样本处理与测序；Mascardi MF、Privitera Signoretta I和Trinks J负责数据分析与结果解读；Mascardi MF和Trinks J负责撰写稿件；所有作者均批准了文章的最终版本。
经费支持
PUE-CONICET
基金项目编号 22920200100009CO；IMTIB（CONICET-HIBA-IUHI）资助；布宜诺斯艾利斯意大利医院研究委员会资助；PIP-CONICET 2021–2023 项目（11220200100875CO）；PICT-2020-Serie A-00788 项目及“Florencio Fiorini Foundation”资助，以上经费均授予 Julieta Trinks 博士；澳大利亚大学资助用于微生物群分析样本的处理与测序。
脚注
机构审查委员会声明
本研究经布宜诺斯艾利斯意大利医院伦理委员会审查并批准。
知情同意声明
所有参与者均已阅读并签署本研究的知情同意书。
利益冲突声明
所有作者均声明，本文不存在相关利益冲突。
STROBE 声明
作者已阅读 STROBE 声明核对清单，且本稿件的撰写与修订均遵循 STROBE 声明核对清单的要求。
补充材料
补充表 1. 肝脏宏基因组在科、属和种水平上的样本级分类组成
肝组织宏基因组在科、属和种水平上的详细分类组成。该表报告了逐个样本中归属于各分类单元的测序读数数量。
补充表 2. 根据组织学严重程度（NAS 评分）划分的差异丰度肝脏微生物分类单元
低 NAS 组与高 NAS 组患者之间丰度存在统计学显著差异的肝脏微生物分类单元完整列表。差异丰度分析在多个分类层级上进行，并列出各分类单元对应的倍数变化系数及统计学显著性指标。
补充表 3. 根据 PNPLA3 划分的差异丰度肝脏微生物分类单元
基因型。
携带 PNPLA3 CC/CG 基因型与携带 GG 基因型的患者之间，丰度存在统计学显著差异的肝脏微生物分类单元的完整列表。结果涵盖多个分类层级，包括倍数变化估计值及相应的统计学显著性值。
补充表4. MASLD 患者 FFPE 肝活检样本的体细胞突变负荷指标。
对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肝活检样本进行体细胞突变负荷分析的逐样本汇总。该表报告了每个样本中鉴定出的高置信度体细胞变异总数、测序覆盖度指标以及标准化突变负荷估计值。变异数量按高质量、唯一比对至人类基因组的测序读段数（MAPQ ≥20）进行标准化，并以每百万条读段中的变异数表示，以便进行样本间比较。样本根据组织学严重程度（低 NAS 与高 NAS）及 PNPLA3 基因型（GG 与 CC/CG）进行标注，构成了“结果”部分所述体细胞突变负荷比较所依据的完整数据集。
致谢
作者感谢患者的配合。
已声明的资助方信息
PUE-CONICET，22920200100009CO
转化医学与生物医学工程研究所（IMTIB）
布宜诺斯艾利斯意大利医院研究委员会
PIP-CONICET 2021–2023，11220200100875CO
PICT-2020-Serie A–00788
Florencio Fiorini 基金会，
南方大学
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