昼夜节律钟通过 MetRS 介导的甲硫氨酸错误掺入调控翻译保真度

摘要

翻译保真度通常被认为是一种组成型过程，会在应激和衰老条件下降低。在此，我们发现，氨基酸掺入的保真度实际上受到昼夜节律钟的动态调控。在粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中，甲硫氨酸（Met）错误掺入蛋白质的水平呈现稳健的日节律，在夜间达到峰值，与活性氧（ROS）水平升高的时间一致。节律性Met错误掺入依赖于昼夜节律钟、ERK家族丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）MAK1，以及MAK1依赖的甲硫氨酰-tRNA合成酶（MetRS）磷酸化，从而将昼夜节律信号传导与受调控的、与氧化应激抗性相关的错误翻译联系起来。阻止MetRS磷酸化会消除Met错误掺入的节律性、损害生长并增加对氧化应激的敏感性，而模拟磷酸化的MetRS突变体则可提高氧化应激条件下的存活能力。蛋白质组范围的分析鉴定出数千个Met错误掺入事件，其中一部分呈节律性变化，其振荡独立于相应蛋白质的丰度变化，提示错误翻译可在一天之中动态重塑蛋白质组的组成。综上，这些发现确立了翻译保真度作为受调控的昼夜节律输出的地位，并支持这样一种模型：昼夜节律钟通过在时间上调控错误翻译，增强对氧化应激的抵御能力。重要性声明：生物钟可调控翻译终止的保真度，但其是否也控制蛋白质合成过程中氨基酸掺入的准确性，此前尚不清楚。我们发现，昼夜节律钟通过ERK家族MAPK信号传导及甲硫氨酰-tRNA合成酶的磷酸化，驱动甲硫氨酸以节律性方式错误掺入蛋白质。甲硫氨酸错误掺入在氧化应激水平升高的时段达到峰值，并且破坏这一调控会削弱细胞在氧化应激下的存活能力，而组成型激活则会增强其抵抗力。结合此前关于翻译终止保真性的研究，这些发现揭示了生物钟在多个层面调控翻译保真性，并确定适应性错译是促进细胞韧性的一种机制。

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昼夜节律时钟通过 MetRS 介导的甲硫氨酸错误掺入调控翻译保真度

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Griffin Best、Sidharth Mohan、Samuel Purvine、Deborah Bell-Pedersen

doi：

https://doi.org/10.64898/2026.06.30.735350

Griffin Best

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德克萨斯农工大学生物学系及生物钟研究中心

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Deborah Bell-Pedersen

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翻译保真度通常被视为一种组成型过程，会在应激和衰老过程中逐渐下降。在此，我们表明，氨基酸掺入的保真度实际上受昼夜节律……

生物钟。在粗糙脉孢菌（*Neurospora crassa*）中，甲硫氨酸（Met）误掺入蛋白质呈现明显的日节律，在夜间达到峰值，与活性氧（ROS）水平升高的时段相吻合。甲硫氨酸误掺入的节律依赖于昼夜节律钟、ERK家族MAPK MAK1，以及MAK1依赖的甲硫氨酰-tRNA合成酶（MetRS）磷酸化，这将昼夜节律信号与氧化应激耐受相关的受调控翻译错误联系起来。阻止MetRS磷酸化会消除甲硫氨酸误掺入的节律，损害生长并提高对氧化应激的敏感性；而磷酸模拟型MetRS突变体则能增强氧化应激下的存活能力。全蛋白质组分析鉴定出数千个甲硫氨酸误掺入事件，其中一部分呈节律性变化，且其振荡独立于相应蛋白质丰度，表明翻译错误会在一天之中动态重塑蛋白质组组成。综上，这些发现确立了翻译保真度是一种受调控的昼夜节律输出，并支持这样一种模型：昼夜节律钟通过对翻译错误进行时间性调控，增强机体对氧化应激的抵御能力。

意义陈述

生物钟能够调控翻译终止保真度，但它们是否也控制蛋白质合成过程中氨基酸掺入的准确性，尚不明确。我们发现，昼夜节律钟通过ERK家族MAPK信号传导及甲硫氨酰-tRNA合成酶磷酸化，驱动甲硫氨酸误掺入蛋白质呈节律性变化。甲硫氨酸误掺入在氧化应激升高时达到峰值；破坏这一调控会削弱氧化应激下的存活能力，而持续激活该调控则能增强抵抗力。结合此前关于翻译终止保真度的研究，这些发现揭示了生物 威尼斯人

生物钟调控翻译保真度的多个层面，并揭示适应性错译是促进细胞韧性的一种机制。

引言

昼夜节律是内源性的约 24 小时周期，使生物体能够预见并适应可预测的环境变化，包括光照、温度和营养物质可获得性的波动（1）。在真核生物中，这些节律由保守的分子振荡器产生，该振荡器由转录－翻译反馈环（TTFL）构成（2–4），可驱动基因组中相当大比例基因的节律性表达（5）。在粗糙脉孢菌（*Neurospora crassa*）中，核心 TTFL 包括白领复合物（WCC），它可激活其抑制因子 *frequency*（*frq*）的转录。FRQ 蛋白与 FRQ 相互作用解旋酶（FRH）及酪蛋白激酶 I（CK1）结合，形成抑制复合物，抑制 WCC 活性，从而完成这一循环。FRQ 逐步发生磷酸化后，抑制作用减弱，使循环得以重新启动（6，7）。通过这一机制，TTFL 产生节律性的时钟控制基因（ccg）表达，进而协调多种生理输出（8，9）。

尽管 TTFL 在转录层面发挥作用，越来越多的证据表明，昼夜节律调控还延伸至转录后过程。值得注意的是，约有一半节律性积累的蛋白质来源于非节律性 mRNA（10–13），这引出了一个问题：在不依赖转录的情况下，蛋白质丰度如何实现时间调控？其中一种机制是 mRNA 的节律性翻译，这一现象已在粗糙脉孢菌及其他系统中得到证实（11，14–22）。

在粗糙脉孢菌中，翻译起始受昼夜节律调控，其机制涉及必需起始因子 eIF2α 的节律性磷酸化（P-eIF2α），

……由CPC-3激酶（哺乳动物GCN2的同源蛋白）介导（15，17）。CPC-3的活性受未氨酰化tRNA调控；未氨酰化tRNA的水平会发生振荡，至少部分原因是氨酰化过程具有节律性。与此相符，包括ValRS、GlnRS和AspRS在内的多种氨酰-tRNA合成酶（aaRS）受生物钟调控，并在夜间达到峰值（17，23）。这些发现共同支持这样一种模型：aaRS活性的昼夜节律调控协调翻译起始与蛋白质生成。除调控翻译起始外，生物钟还控制翻译终止的保真度。核糖体蛋白eL31与翻译中核糖体的节律性结合，会在主观夜间抑制终止密码子通读，从而使翻译终止准确性呈现日节律（24）。这些发现提示，生物钟可能调控翻译保真度的多个层面，但它是否也控制氨基酸掺入的保真度，尚不明确。

aaRS是必需酶，负责将tRNA与其对应的氨基酸连接，确保翻译过程中对遗传密码的准确解码（25–34）。鉴于许多氨基酸与tRNA在化学性质和结构上相似，aaRS在底物特异性方面面临固有挑战，并已进化出校对机制以尽量减少错误（27，28，35，36）。尽管存在这些保障机制，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基础翻译错误率仍可达0.01%–0.1%（37），而某些特定的错误翻译事件发生频率则可能显著更高（38）。

尽管aaRS介导的翻译错误可能造成有害影响，并在多种模型系统中导致蛋白质错误折叠、聚集和神经退行性变（39，40），但新近证据表明，

某些错译事件可能具有适应性。在超嗜热古菌 Aeropyrum pernix 中，Met 错掺入可促进某些蛋白质适应低温生长条件（41）；在大肠杆菌（Escherichia coli）中，它可增强细菌对抗生素的耐受性（42）。在白色念珠菌（Candida albicans）中，经典的亮氨酸 CUG 密码子主要被重新指定为编码丝氨酸。这种独特的偏离由一种特殊的 Seryl-tRNA^CAG 驱动，该 tRNA 能与 CUG 密码子配对。该 tRNA 可被丝氨酰-tRNA 合成酶和亮氨酰-tRNA 合成酶同时识别，因此在标准生长条件下，CUG 大多被翻译为丝氨酸（约 97%），但仍有少部分被读取为亮氨酸（约 3%）（43）。表达酵母来源 Leucyl-tRNA^CAG 的工程化 C. albicans 菌株，在 CUG 位点的亮氨酸掺入率升高（最高可达 28%），这会改变细胞表面蛋白的组成，并与感染过程中逃避免疫防御有关（43–47）。这种不寻常的密码子模糊性被认为有助于形成表型变异，从而促进宿主适应和致病性。在哺乳动物细胞和酿酒酵母（S. cerevisiae）中，氧化应激会激活 ERK 家族 MAPK，进而促使 MetRS 磷酸化并降低其对 tRNA^Met 的特异性，导致非同源 tRNA 的错误氨酰化增加以及广泛的 Met 错掺入（48，49）。这些 Met 残基可通过发生可逆氧化发挥抗氧化作用，从而保护蛋白质和细胞免受活性氧（ROS）损伤（49）。这些数据表明，翻译保真度并非固定不变，而可能会根据生理需求和环境胁迫进行调节。

昼夜节律钟是细胞稳态的核心调节机制，使生物体能够预先应对每日的…

应对环境与代谢压力的波动。在粗糙脉孢菌（*N. crassa*）中，MAK1（ERK1 同源蛋白）的活性和细胞内 ROS 水平均呈现昼夜节律（50, 51）。基于这些观察，我们提出假设：昼夜节律钟通过 MAK1 依赖的 MetRS 磷酸化，在时间上调控翻译保真度，驱动蛋氨酸（Met）错掺的节律性变化，从而缓冲氧化应激的日常波动。

与这一假设一致，我们发现 Met 错掺受生物钟调控，在夜间达到峰值，并依赖于 MAK1 介导的 MetRS 磷酸化。该通路可调节细胞对氧化应激的抵抗力，并且其作用遍及蛋白质组：特定蛋白质会出现节律性的 Met 错掺，而这种变化独立于其丰度。综上，这些发现揭示了一种机制：昼夜节律钟通过动态调控翻译保真度，促进细胞适应。

结果

Met 错掺受粗糙脉孢菌生物钟调控

MetRS 是决定 Met 错掺的关键因子（48, 49, 52）；因此，我们首先考察粗糙脉孢菌 MetRS（NCU07451）的表达是否受昼夜节律钟调控。对已发表的核糖体测序（Ribo-seq）和 RNA 测序（RNA-seq）数据进行分析发现，MetRS 的翻译呈节律性变化，并在主观夜间达到峰值（17）。为独立验证这一结果，我们构建了 MetRS::LUC 翻译报告系统，并观察到 MetRS 水平呈昼夜振荡；在 Δ*frq* 细胞中，这种振荡消失（图 S1）。这些数据表明，MetRS 是受生物钟调控的翻译机制组分，并可能参与翻译保真度的节律性调控。

接下来，为检验昼夜节律钟是否驱动 Met 错掺的日节律，我们采用了一种 GFP-mCherry 双报告系统

该方法被改造用于 *N. crassa*（52）（图1A）。第71位的Met（M71）是mCherry荧光团形成所必需的，该位点发生替换会消除荧光（53）。在M71突变体中，第71位误掺入Met可恢复mCherry荧光，因此可作为翻译保真度的读出指标。先前在 *S. cerevisiae* 和人源细胞系中的研究表明，MetRS会错误氨酰化两种tRNA^Glu同受体（tRNA^Glu(CUC)和tRNA^Glu(UUC)）（48，52），因此可通过将M71位点的Met替换为Glu（mCherry^M71E）来测量MetRS介导的Met误掺入。在 *S. cerevisiae* 中，在所测试的六种tRNA^Leu同受体中的四种里，MetRS不会错误氨酰化tRNA^Leu(CAA)、tRNA^Leu(GAG)和tRNA^Leu(UAA)，而对tRNA^Leu(UAG)的错误氨酰化作用也较弱（48）。因此，mCherry^M71L报告系统可用于控制非特异性翻译错误。GFP荧光作为翻译的对照。

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图1.

mCherry^M71E中的Met误掺入受时钟调控。

A）双报告系统示意图。将M71位点的ATG突变为E（GAG）后，mCherry不发荧光（灰色）；只有当tRNA^Glu被错误氨酰化为携带Met，且Met发生误掺入时，才会产生荧光（左，红色）。M71突变为L（CTG）后产生的任何荧光，均反映Met的一般氨基酸误掺入（右，粉色），而非MetRS介导的误掺入（中，灰色）。B）图示在所示时间内、以LD 12:12周期培养的WT细胞中，Met误掺入mCherry^M71E的百分比（LD小时数）。如较佳的正弦曲线拟合所示（红色虚线；p < 0.0005），WT背景中的Met误掺入呈节律性，周期为23.5 ± 0.5小时；而Δfrq细胞中无节律，如较佳的直线拟合所示（红色虚线；p > 0.05）。C）在

mCherry_(M71L)中，Met 错误掺入在 WT 和 Δ_(frq) 中均处于较低水平且无节律（红色虚线；p > 0.05）。所有图中的误差线均表示均值 ± SEM（n = 12）。B 和 C 中的黄色阴影表示开灯时段，灰色阴影表示关灯时段。

我们构建了 WT 和时钟突变株 Δ_(frq)，并在铜响应型 <i>tcu1</i> 启动子控制下表达 GFP-mCherry_(WT)（mCherry_(WT)）、GFP-mCherry_(M71E)（ATG→GAG；mCherry_(M71E)）或 GFP-mCherry_(M71L)（ATG→CTG；mCherry_(M71L)）报告蛋白（图 1A）。选择 Glu 密码子 GAG，是基于此前在哺乳动物细胞中的研究，该研究显示 Met 会在此位点发生错误掺入（52）；选择 Leu 密码子 CTG，则是因为其在 <i>N. crassa</i> 基因组中的出现频率与 ATG 相近，从而最大限度地减少密码子稀有性对翻译效率的潜在影响，并确保替换背景具有相关性（54）。在 bathocuproine sulfonate（BCS）存在时，<i>tcu1</i> 持续处于活跃状态，使报告蛋白能够持续表达（图 S2A、B）。值得注意的是，用于荧光测量的激发波长不会对时钟功能产生负面影响；这一点通过 FRQ::LUC 翻译报告系统测得的节律得到验证（图 S2C）。

在 12:12 明暗（LD）周期（图 1）和持续黑暗（DD）条件下（图 S3），mCherry_(M71E) 报告系统中的 Met 错误掺入呈现每日节律，并在夜间早期达到峰值（图 1B、S3A）；此时 MetRS 水平也较高（图 S1）。在 Δ_(frq) 细胞中，这些节律消失，表明其受时钟调控。相比之下，mCherry_(M71L) 报告系统中的 Met 错误掺入在 WT 和 Δ_(frq) 细胞中均无节律，反映了延伸过程中的一般性错误（图 1B、S3B）。

总之，这些数据表明，昼夜节律时钟调控了氨基酸中……

非胁迫条件下的酸掺入保真度，并提示这些节律由 MetRS 错误氨酰化通路介导。

Met 错误掺入受氧化胁迫、MAK1 和 MetRS 调控

哺乳动物 ERK MAPK 可在体外直接磷酸化 MetRS；氧化胁迫诱导的 ERK 信号通路在体内激活后，会增加 MetRS 在 Ser209 和 Ser825 位点的磷酸化，从而促进 Met 错误掺入（49, 52）。由于 ERK1 同源蛋白 MAK1 在粗糙脉孢菌（*N. crassa*）中受生物钟调控（50），我们检测了 MAK1 活性是否会影响 MetRS 磷酸化和 Met 错误掺入。

为直接评估该通路，我们检测了氧化胁迫条件下 MAK1 的磷酸化情况。过氧化氢（H₂O₂）处理后，P-MAK1 水平显著升高，而 ERK 家族 MAPK 的 P-MAK2 水平未发生变化（图 S4），这支持 MAK1 是该条件下响应氧化胁迫的主要激酶。

我们使用 H₂O₂ 诱导氧化胁迫，该处理可激活 ERK 信号通路（49）。在表达 mCherry^M71E 报告蛋白的 MetRS WT 菌株中，100 mM H₂O₂ 显著增加了 Met 错误掺入（图 2A、S4C）；而在 MetRS WT mCherry^M71L 对照组中未观察到这一效应（图 2B、S4D）。这些结果与既往研究中 ERK 依赖性 Met 错误掺入增加的发现一致（52），并支持 MAK1–MetRS 信号通路参与调控翻译保真度。

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图 2.

氧化胁迫通过 MetRS 磷酸化增加 Met 错误掺入。

在 25 °C、恒暗（DD）条件下培养表达 A）mCherry^M71E 或 B）mCherry^M71L 的 WT、*metRS*^T108A（T108A）和 *metRS*^T108D（T108D）细胞，并分别给予 0 mM 或 100 mM H₂O₂ 以诱导氧化胁迫。Met 的测量】【。

在 H₂O₂ 处理后第 5 天（DD 114）测定错误掺入。误差线表示均值 ± SEM（n = 3；*p < 0.05，p < 0.005，*p < 0.0005）；ns 表示差异无统计学意义。

为鉴定粗糙脉孢菌（N. crassa）MetRS 上潜在的 ERK 家族 MAPK 依赖性磷酸化位点，我们制备了 MetRS 多克隆抗体用于免疫沉淀（图 S5），随后进行了磷酸化蛋白质组学分析。仅在 WT 细胞中检测到一个磷酸化位点，即苏氨酸 108（T108）；在 Δmak1 细胞中未检测到该位点（数据集 S1）。T108 后紧接着一个脯氨酸（T108-P109），符合 ERK 家族 MAPK 的最小识别基序（55）。值得注意的是，在 Δmak2 细胞中检测到了 T108 磷酸化，这支持 MAK1 是介导 MetRS 磷酸化的激酶。

为检验该位点的功能意义，我们构建了磷酸化缺失突变体（metRS^T108A）和磷酸模拟突变体（metRS^T108D）。两种突变体中的 MetRS 丰度均未发生变化（图 S6）。在 mCherry^M71E 报告菌株中，与 WT 对照（0 mM H₂O₂）相比，metRS^T108A 中 Met 错误掺入的总体水平降低，而 metRS^T108D 中则升高；两种突变体对氧化应激（100 mM H₂O₂）均不敏感（图 2A）。值得注意的是，无论是否存在氧化应激，这些突变对 mCherry^M71L 报告系统的影响都很小（图 2B）。这些结果表明，MAK1 依赖性地磷酸化 MetRS 的 T108 位点，可调节氧化应激条件下 Met 的错误掺入。

MetRS 磷酸化驱动 Met 错误掺入的节律性变化

为确定 MAK1 依赖的 MetRS 磷酸化是否构成 Met 错误掺入昼夜节律的基础，我们在 L 30 °C/D 25 °C 周期条件下，检测了 Δmak1 和 metRS^T108 突变体中的 Met 错误掺入。这些

由于光照和温度驯化会增强昼夜节律振幅及群体同步性，因此在这些条件下检测突变体的节律性，相较于在 DD、25 °C 条件下，可更可靠地检出 Met 错掺入节律。

使用 mCherry M71E 报告系统时，metRS T108A 突变体中的 Met 错掺入水平较低且无节律性，而 metRS T108D 突变体中的水平较高且无节律性（图 3A）。在 mCherry M71L 报告系统中，两种突变体均无节律性，其 Met 错掺入水平与 WT 相近（图 3B）。然而，Δmak1 菌株在 mCherry M71E 和 mCherry M71L 两种报告系统中均表现出较低且无节律性的错掺入（图 3A、B），这表明 MAK1 可调控 MetRS 依赖性及非依赖性机制，从而影响 Met 错掺入。综上，这些结果表明，MAK1 依赖的 MetRS T108 位点磷酸化是 Met 错掺入昼夜节律调控所必需的。

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图 3.

MAK1 依赖的 MetRS 磷酸化对 Met 错掺入节律至关重要。

WT（黑色）、metRS T108A（T108A，红色）、metRS T108D（T108D，蓝色）和 Δmak1（粉色）细胞中，A）mCherry M71E 或 B）mCherry M71L 的 Met 错掺入百分比图。这些实验与图 1B、C 所示实验同时进行，WT 数据在此重新绘出。图的说明同图 1。metRS T108A 和 Δmak1 细胞中 mCherry M71E 的 Met 错掺入水平显著低于 WT，而 metRS T108D 细胞中的水平显著高于 WT；所有 3 种突变体的 Met 错掺入节律均消失。metRS T108A 或 metRS T108D 细胞中 mCherry M71L 的 Met 错掺入水平与 WT 相比无显著差异；然而，Δmak1 细胞中的 Met 错掺入

显著降低。误差线表示均值 ± SEM（n = 12；p < 0.005，*p < 0.0005，****p < 0.0001）；ns 表示差异无统计学意义。

MetRS 介导的 Met 错误掺入可增强对氧化应激的抵抗力

研究表明，Met 错误掺入可保护 HeLa 细胞免受氧化损伤（49）。由于 *N. crassa* 中 ROS 水平在夜间达到峰值（51），且与 Met 错误掺入最为显著的时段相吻合，我们推测这一过程能够增强细胞的应激抵抗力。

细胞活力检测显示，在 DD 条件下培养的 WT、Δ*frq* 和 *metRS*^T108D 细胞暴露于 100 mM H₂O₂ 后（而非 0 mM H₂O₂ 条件下）逐渐死亡；相比之下，*metRS*^T108A 突变体的敏感性显著升高，活力迅速丧失（图 4A、B）。在中等强度应激条件下（50 mM H₂O₂），与 WT 和 Δ*frq* 细胞相比，*metRS*^T108D 突变细胞的存活率提高，而 *metRS*^T108A 突变体的活力则降低（图 4C），这与 Met 错误掺入增加可增强对氧化应激的保护作用相一致。在 10 mM H₂O₂ 条件下培养的 WT 细胞未出现活力缺陷（图 S7），这与该剂量下 Mak1 磷酸化和 Met 错误掺入仅轻微增加相符（图 S4）。值得注意的是，即使未施加氧化应激，阻断 MetRS 磷酸化也会显著降低生长速率，其中 *metRS*^T108A 突变体受到的影响最大（图 4D）。为确定这一表型是否反映了基因表达或蛋白质合成的一般性缺陷，我们对双报告系统中的 GFP 累积量进行了定量。整个时间过程中，WT、*metRS*^T108D 和 *metRS*^T108A 突变株的 GFP 水平相近（图 4E），表明破坏 MetRS 磷酸化并不会导致一种

记者蛋白表达或整体翻译能力未出现重大缺陷。这些结果表明，metRS^T108A和metRS^T108D细胞生长减慢，更可能是由于受调控的Met错误掺入缺失，而非蛋白质生成整体受损。综上，这些结果支持这样一种模型：MAK1依赖的MetRS磷酸化可促进适应性Met错误掺入，并以剂量依赖的方式增强细胞对氧化胁迫的抵抗力。此外，在非胁迫条件下，metRS^T108A和metRS^T108D突变细胞的生长也受到抑制，这表明即使不存在外源性氧化胁迫，MetRS错译通路的昼夜节律调控仍有助于维持细胞适应性；其潜在机制可能是预先应对内源代谢或氧化胁迫的日常波动。

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图4. 氧化胁迫后，metRS^T108A和metRS^T108D突变体的细胞存活率发生变化。

WT（黑色）、metRS^T108A（T108A，红色）、metRS^T108D（T108D，蓝色）和Δfrq（绿色）细胞分别在A）0 mM、B）100 mM和C）50 mM H₂O₂条件下培养后的细胞存活率曲线。分别在处理后第0、3、4、5和6天测定细胞存活率。在50或100 mM H₂O₂条件下培养时，metRS^T108A细胞的存活率低于所有其他组；在50 mM H₂O₂条件下培养时，metRS^T108D细胞的存活率高于所有其他组。D）阻止MetRS磷酸化会损害生长。图示为WT（黑色）、metRS^T108A（T108A，红色）和metRS^T108D（T108D，蓝色）突变细胞在DD条件下的生长速率。E）WT（黑色）、metRS^T108A（T108A，红色）和metRS^T108D（T108D，蓝色）菌株双报告系统中的GFP累积量。突变体的GFP水平与WT无显著差异，表明MetRS改变的……

磷酸化不会显著影响报告基因表达或总体蛋白质产量。误差线表示均值 ± SEM（n = 4；*p < 0.0005，**p < 0.0001，ns 表示无显著变化）。

N. crassa 蛋白质组呈现节律性 Met 错误掺入

为确定在恒定生长条件下，时钟对 Met 错误掺入的调控是否发生于体内，我们使用 Andromeda 分析了已发表的 N. crassa 昼夜节律蛋白质组学数据集（10，56）。总体而言，在所有时间点共鉴定出 2,637 个独特的 Glu→Met 替换和 1,278 个 Asp→Met 替换；与大多数其他 Met 错误掺入事件相比，这些替换显著富集（图 5；数据集 S2 和 S3）。例如，尽管 Leu 密码子的基因组丰度更高，Leu→Met 替换的出现频率却低得多（299 个事件）。这些发现与 Glu 和 Asp 密码子处 Met 错误掺入选择性富集的结果一致（48）。对 Met 替换事件所涉及的密码子进行分析发现，同义密码子的出现频率并不均一，尤其是在 Glu→Met 替换中（表 S1）。对于 Glu→Met 替换，检测到 GAG 的频率高于 GAA；而 Asp→Met 替换更常发生于 GAC 而非 GAT，这与此前在酵母中的研究结果一致（48）。Leu→Met 替换分布于全部六种 Leu 密码子中，其中 CTC 检出频率最高。这些发现提示，密码子身份、tRNA 丰度或局部序列/蛋白质环境可能影响 Met 错误掺入事件的积累或检出。

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图 5. 特定蛋白质在体内发生节律性 Met 错误掺入。

A) 与 Leu 相比，Glu→Met（蓝色）、Asp（绿色）和 Asn（橙色）错误掺入均有所富集。

Met（粉色）。基因组占比（第4列）通过将密码子数量（第3列）除以所有密码子总数（5,519,635）计算得出。Met替换的预期数量（第5列）通过将基因组占比（第4列）乘以观察到的Met替换数量（第2列）计算得出。B）两个代表性蛋白质中，在指定氨基酸位点发生的Met错误掺入随时间变化的ECHO拟合数据（黑色；横轴：DD小时）（左轴）。同一数据集中的总蛋白质水平（粉色；未拟合数据）也一并显示（右轴）。

为获得更可靠的Glu到Met肽段定量结果，我们使用MS-GF+（10）重新进行了Met错误掺入肽段搜索。在该分析中，Glu到Met替换（1,554次）较Leu到Met替换（203次）显著富集，从而验证了Andromeda搜索数据（Dataset S4）。随后，使用R程序ECHO（57）检测Glu到Met肽段的节律性；该分析在野生型（WT）粗糙脉孢菌（*N. crassa*）细胞中鉴定出236个存在振荡性Met错误掺入的肽段（Dataset S5）。排除同一已发表数据集（10）中丰度具有节律性的蛋白质后，剩余130个独特肽段，其错误掺入节律独立于相应蛋白质的节律；其中两个示例如图5B所示。在这些示例中，Met错误掺入在主观夜间达到峰值，与WT菌株中的mCherry M71E报告信号峰值相吻合（图1B）。总体而言，大多数（59%）具有节律性的Met错误掺入事件在主观夜间达到峰值（Dataset S5）。在核心时钟蛋白WC-1中鉴定到一个置信度较低的Met错误掺入事件，但在WC-2、FRQ或FRH中未发现此类事件（Dataset S3）。与其对核心振荡器影响有限相一致，metRS T108A突变体仅表现出轻微改变……

FRQ::LUC节律的周期，以及与野生型（WT）相比未检测到发育节律缺陷（图S8）。对发生Met错掺的蛋白质进行基因本体（GO）分析，发现与氧化应激响应、翻译和中心碳代谢相关的通路显著富集（数据集S5），这与节律性错译参与协调代谢和应激响应过程的作用相符。综上，这些结果表明，昼夜节律钟驱动蛋白质组范围内具有蛋白质特异性的Met错掺节律。

讨论

粗糙脉孢菌（*N. crassa*）的昼夜节律钟通过终止密码子通读（SCR）调控翻译终止保真度（24）。核糖体蛋白eL31以节律性方式与核糖体结合，并在主观夜间达到峰值，此时它会抑制SCR并提高终止保真度。因此，在eL31占据率降低的白天，SCR水平升高。与此同时，我们的研究结果表明，昼夜节律钟还通过Met错掺调节氨基酸掺入保真度。综合这些研究可知，昼夜节律钟能够协调调控翻译保真度的多个层面，根据一天中不同时段细胞需求和应激状态的变化，动态调节翻译准确性。

我们的数据揭示了昼夜节律钟通过节律性Met错掺调控氨基酸掺入保真度的机制。依赖MAK1的MetRS T108位点磷酸化驱动Met错掺的昼夜节律，其峰值出现在夜间（图1），与MetRS丰度升高的时段相吻合（图S1）。这些发现共同提示，MetRS表达和磷酸化的昼夜节律调控在时间上相互协调，从而调节翻译保真度。尽管我们未直接检验

尽管尚未通过体外实验确定 MAK1 是否会磷酸化 MetRS，但多项观察结果支持这一模型。在哺乳动物细胞中，ERK 家族 MAPK 可直接磷酸化 MetRS；该磷酸化会诱导构象变化，拓宽其对 tRNA 的识别范围，并促进非同源 tRNA 的错误氨酰化（49）。与机制保守这一观点一致，氧化胁迫后在 WT 和 Δmak2 细胞中检测到 MetRS T108 磷酸化，而在 Δmak1 细胞中未检测到；破坏 MAK1 或 MetRS T108 磷酸化位点，均会消除具有节律性的 Met 错误掺入。未来仍需开展生化研究，以确定 MetRS T108 磷酸化是否会以类似方式改变粗糙脉孢菌 MetRS 的底物特异性。

氧化胁迫会激活依赖 MAK1 的 MetRS 磷酸化，降低其保真度并增加 Met 错误掺入（图 2）；通过 T108 突变或删除 mak1 破坏该通路，均会消除具有节律性的 Met 错误掺入（图 3）。在功能层面，调节该通路会改变细胞对氧化胁迫的敏感性（图 4）：模拟磷酸化的 metRS T108D 细胞在中等氧化胁迫下存活率更高，而磷酸化缺失型 metRS T108A 细胞在中等和高强度氧化胁迫下的存活率均降低。值得注意的是，即使未施加氧化胁迫，metRS T108A 和 metRS T108D 细胞的生长也受到抑制（图 4）。由于 MetRS 突变细胞的存活能力和 MetRS 丰度均正常，且双报告系统中 GFP 的积累水平与 WT 相近（图 4E），因此这一表型不太可能反映转录、翻译起始或整体蛋白质合成存在普遍缺陷。相反，MetRS 依赖型错误翻译报告系统所呈现的选择性效应表明，

受调控的 Met 错误掺入减少会导致生长缺陷。这些发现表明，MetRS 依赖的错译受昼夜节律调控，有助于细胞在基础条件下维持适应性，这可能是通过生成蛋白质变体，使细胞能够预先应对内源性代谢压力和氧化应激。尽管目前尚不能排除 MetRS 突变体对 MetRS 活性的更广泛影响，但它们对 MetRS 依赖性错译报告系统的选择性作用，加之 MetRS 丰度未发生变化，表明这些 MetRS 突变体可能通过调节底物特异性发挥作用。节律性错误掺入对 MAK1 和 T108 磷酸化位点的依赖，强有力地支持了这种修饰受到时间调控的观点。综上，这些发现提示了一种模型：昼夜节律钟通过时间性调节氨基酸掺入保真度，以应对每日氧化应激水平的波动。

尽管我们的数据表明 MetRS T108 磷酸化是节律性 Met 错误掺入的关键调节因子，但与 metRS T108A 突变相比，删除 mak1 对 Met 错误掺入的降低作用更强，而且同时影响 MetRS 依赖性（mCherry M71E）和非依赖性（mCherry M71L）报告系统（图 3）。这些发现提示，MAK1 还通过 MetRS 磷酸化以外的机制调节 Met 错误掺入。一种可能性是对延伸动力学的调控。在哺乳动物系统中，ERK 信号调节 eEF2 激酶（eEF2K）；在秀丽隐杆线虫中，eEF2 磷酸化会减缓翻译延伸，并在某些条件下提高氨基酸选择的保真度（58，59）。与此相符，我们此前发现，eEF2 磷酸化受昼夜节律钟调控，并在白天达到峰值；此时翻译速率降低，且……

保真度（14）。总体而言，这些观察结果支持这样一种观点：MAK1 协调多个层面的翻译保真度调控，包括氨基酸选择和延伸动力学。然而，如果 MAK1 通过多种翻译保真度通路发挥作用，一个重要的问题是：为什么在 mCherry^M71L 报告系统中未观察到节律？一种可能的解释是，GFP-mCherry 双报告系统不够灵敏，无法检测到独立于 MetRS 活性的低振幅节律。这一局限凸显了采用更灵敏、稳健的方法，以全面解析蛋白质组范围内氨基酸掺入保真度的昼夜节律调控的必要性。

这些数据揭示的一个重要细节，是 ROS、MAK1 活性与昼夜节律时序之间的关系。尽管 ROS 能够激活 MAK1（图 S4），但它不太可能是 MAK1 节律性的主要驱动因素。ROS 水平在夜间达到峰值，而 P-MAK1 水平则在午后达到峰值（50，51），这表明 MAK1 的昼夜节律调控由上游的时钟控制通路驱动，ROS 则作为调节性输入发挥作用。这些观察结果提示，基础性的昼夜节律调控决定了 MAK1 活性的时间变化模式，而 ROS 则提供急性调节信号，在应激条件下进一步增强通路激活。由于 Met 残基可发挥 ROS 清除剂的作用，节律性 Met 错掺入本身也可能通过在一天中的特定时段增加易氧化 Met 残基的丰度，促成细胞 ROS 水平的日常波动。根据这一模型，MetRS 活性的昼夜节律调控不仅会响应氧化应激，也可能影响细胞氧化还原稳态的时间调控。

夜间 Met 错掺入增加的幅度

与白天相比，这一变化幅度较小（约 2%）（图 1B），但这可能低估了该通路的总体影响。我们的报告系统专门检测 GAG 密码子处 Glu 到 Met 的替换，而先前研究表明，MetRS 也可能错误地将氨酰基加载到 tRNA^Asp 和 tRNA^Lys 上（48）。因此，节律性 Met 错误掺入可能涉及多种氨基酸背景，从而扩大其对整个蛋白质组的影响。与这一观点一致，质谱分析还发现，在粗糙脉孢菌（N. crassa）中，Asp 到 Met 的替换有所富集，但 Lys 到 Met 的替换并未富集（图 5A）。将报告系统扩展至其他残基，对于全面捕捉氨基酸掺入保真度的昼夜节律调控至关重要。

GFP-mCherry 报告系统检测到的 Met 错误掺入频率，不能与质谱鉴定出的含 Met 替换肽段数量直接比较。该报告系统在受控表达条件下，对一种容许性较高的 Glu 到 Met 替换进行靶向检测；而通过蛋白质组学检测翻译错误事件，则受到肽段丰度、离子化效率、随机肽段采样以及严格筛选阈值的限制（60）。此外，部分错误翻译产生的蛋白质可能会被迅速降解，或低于检测限。因此，蛋白质组学数据集可能仅反映了整个蛋白质组中发生的 Met 错误掺入事件的一部分。目前尚不清楚哪些机制决定了哪些 Met 错误掺入事件会在蛋白质组中累积。一种可能是，如先前提出的那样，发生在溶剂暴露残基上的替换因能增强 ROS 缓冲作用而被选择性保留（49）。另一种可能是，Met 错误掺入发生得更为广泛，而这些替换

发生于结构敏感位点时，可能导致蛋白质错误折叠并被降解。根据这一模型，蛋白质组将代表一组经筛选、能够耐受甲硫氨酸错掺入事件的集合。同样，只有一部分发生甲硫氨酸错掺入的肽段表现出可检测的昼夜节律，这可能反映了蛋白质组采样深度、蛋白质周转，以及节律振幅必须足够大才能达到统计学支持的节律性的共同限制。未来研究的一项重要目标，是区分有益替换的选择性保留与蛋白质稳态机制介导的有害变体清除。

蛋白质组学分析表明，甲硫氨酸错掺入广泛存在于整个蛋白质组中，其中一部分蛋白质表现出昼夜节律，且这种节律独立于蛋白质丰度（图5和数据集S2–S5）。这些数据提示，节律性甲硫氨酸错掺入可能参与蛋白质功能的时间调控。与这一观点一致，发生节律性甲硫氨酸错掺入的蛋白质在与氧化应激反应和代谢相关的通路中显著富集。尽管我们尚未直接检验特定位点错掺入事件的功能后果，但即便发生频率较低，只要出现在调控性残基或结构敏感残基上，也可能产生显著影响。更广泛地说，由于甲硫氨酸残基能够影响蛋白质结构、稳定性和定位，并可充当可逆的氧化还原缓冲剂，在特定时间点发生的特定位点节律性替换，可能以依赖昼夜时间的方式调节蛋白质活性。

总而言之，我们的研究结果表明，翻译保真度本身就是一种受调控的昼夜节律输出。除甲硫氨酸错掺入和SCR外，其他保真度机制

可能受时钟调控。例如，氧化应激可通过其他氨酰-tRNA 合成酶（aaRS）诱导错译，例如 ThrRS 介导的 tRNA^Ser 错氨酰化（61）。此外，aaRS 与其对应 tRNA 的相对丰度会影响翻译保真度（62），且许多 aaRS 呈现昼夜节律性表达（15，23）。这些发现进一步丰富了相关证据：aaRS 不仅是核心翻译机器的一部分，也是响应信号、受动态调控并决定蛋白质组组成与翻译保真度的因子。

最后，这些发现对衰老研究具有重要意义。昼夜节律和翻译保真度均会随年龄增长而下降，并与蛋白质稳态缺陷及年龄相关疾病有关（63–67）。我们的结果提示，这些过程之间存在机制联系，并提出一种可能性：衰老相关的昼夜节律振幅减弱会导致翻译保真度调控降低。值得注意的是，ERK 信号也会随年龄增长而减弱（68，69），因此可能成为昼夜节律通路与蛋白质稳态通路的整合因子。未来研究应探究恢复昼夜节律振幅能否维持翻译保真度，并提升衰老过程中细胞的韧性。

总之，本研究揭示了一种机制：生物钟通过依赖 MetRS 的机制动态调节翻译保真度。通过按时间调节氨基酸掺入的保真度，生物钟可能调节蛋白质组组成与应激耐受能力，从而预先应对氧化状态可预测的每日波动。

材料与方法

粗糙脉孢菌菌株与生长条件

粗糙脉孢菌的营养生长条件、转化、杂交流程及 race tube 实验流程均如先前所述（70，71）。菌株构建的详细信息为彩票登录

具体方法见补充信息（SI Methods）；本研究所用的菌株、关键试剂和寡核苷酸引物列于表 S2。

用于诱导 ERK 家族 MAPK 磷酸化及双报告系统检测的氧化应激

为诱导氧化应激并检测 MAK1/2 磷酸化，在收获前用终浓度为 0、10 和 100 mM 的 H₂O₂ 处理组织（菌丝垫）5 min。组织在液氮中速冻并研磨，具体操作同前所述（19）。

为诱导双报告菌株（mCherryWT、mCherry^M71E^ 和 mCherry^M71L^）产生氧化应激，将萌发的分生孢子在恒光（LL）条件下、30 °C 培养 6 d，培养基为含 2% 葡萄糖（1X V2G）和 5 μM CuSO₄ 的 1X Vogel 最低培养基，以抑制双报告系统的基础表达。使用 1X V2G 收集分生孢子，并通过纱布过滤以去除多余菌丝体。随后，以 3000 rpm 离心 3 min 收集分生孢子，并重悬于 500 μL 1X V2G 中。使用分光光度计在 λ = 420 nm 处对 1:100 稀释液进行测定，并将细胞稀释至 1 × 10⁷ 个细胞/mL（假定 OD₄₂₀ = 1 时细胞浓度为 5 × 10⁶ 个细胞/mL）。在 Revvity Optiplate-96 板中预先加入 150 μL 1X V2G、BCS 和 H₂O₂。加入 100 μL 细胞悬液（1,000,000 个细胞），使终体积达到 250 μL，BCS 的终浓度为 200 μM，H₂O₂ 的终浓度分别为 0、10 或 100 mM。培养板覆盖 Breathe-Easy 膜后，转移至配备单色器的 EnVision 酶标仪中，在黑暗条件下（DD）、25 °C 培养。每 3 h 测定一次，连续测定 5 d；mCherry 和 GFP 的激发波长分别为 578 nm 和 484 nm，发射波长分别为 618 nm 和 517 nm。Met 错误掺入百分比通过计算 mCherry（mCherry^M71E^ 或】【。

将 mCherry_M71L 与 GFP 信号的比值除以 mCherryWT 与 GFP 信号的比值，再乘以 100，得到最终百分比。

双报告系统与 FRQ::LUC 的时间序列

双报告（GFP 和 mCherry）菌株在 LL 条件下、30 °C 培养六天，并按上述方法纯化（双报告系统氧化应激测试），但有一处例外：细胞在不含 5 μM CuSO₄ 的 1X V2G 培养基中生长。按照先前所述方法（15）制备含琼脂的 Revvity Optiplate-96 板，但有一处例外：以 200 μM BCS 替代 10 μM 荧光素。每块板接种 500 个细胞，并在 LL 条件下、30 °C 培养一天，随后将培养板转移至配备单色器的 EnVision 酶标仪中，在 L（30 °C）/D（25 °C）周期或 DD 条件下、25 °C 培养。FRQ::LUC 节律的测量按先前所述方法（15）进行。

抗 MetRS 抗体的制备

为通过蛋白质印迹检测 MetRS 蛋白，我们曾在 MetRS 上添加 V5 标签。然而，metRS::V5 菌株（DBP3953）存在生长缺陷，提示 MetRS 功能可能发生改变。因此，我们制备了针对粗糙脉孢菌（N. crassa）MetRS 的抗体。将全长粗糙脉孢菌 MetRS 蛋白与半胱氨酸蛋白酶结构域（CPD）融合，并连接至大肠杆菌（E. coli）表达载体 pET22b(+) 中。细菌蛋白的表达与纯化按先前所述方法（72）进行，但有一处例外：将结合蛋白的 Ni-NTA 珠子置于含植酸（InsP₆，833 μg/mL）的 600 μL 裂解缓冲液中，在冰上振荡孵育 1.5 小时，以切除 MetRS（NCU07451）上的 CPD 结构域。经快速蛋白质液相色谱（FPLC）纯化后，将纯化的 MetRS 送至 Pocono Rabbit Farm & Lab（宾夕法尼亚州卡纳登西斯），由其对兔进行免疫，随后采血制备抗 MetRS 抗体血清。

MetRS 与 P-MAK1/2 的蛋白提取及蛋白质印迹

蛋白质提取和蛋白质印迹实验方案如前所述（16）。抗-MetRS抗体以1:10,000的比例稀释于15 mL 1× TBST配制的5%脱脂奶粉溶液中。抗-P-MAK1/2（抗-P-p44/42）和抗-MAK2（抗-p44/42）抗体以1:1,000的比例稀释于15 mL 1× TBST配制的5%脱脂奶粉溶液中。抗-V5抗体以1:5,000的比例稀释于15 mL 1× TBST配制的5%脱脂奶粉溶液中。使用Odyssey-CLX红外成像系统（Li-Cor）分析蛋白质印迹结果。

含有Met替换的肽段鉴定

采用MaxQuant（v2.6.7.0）（73，74）及其集成的Andromeda搜索引擎（56），重新分析了从WT和Δ*csp1*细胞混合样品中分离的蛋白质在昼夜节律时间序列实验（10）中的质谱数据，以鉴定肽段中的Met替换。在数据库检索中，将氨基酸替换为Met设为可变修饰。为确保肽段与蛋白质之间的可靠匹配，检索时排除了长度短于7个氨基酸的肽段。为降低计算复杂度并减少假阳性，每种氨基酸在检索时每条肽段最多允许发生3次错掺入。位点定位采用MaxQuant报告的最高评分结果；所有替代位点对应的定位概率列于数据集S2中。对已表征的WT混合样品进行的MS-GF+分析采用此前描述的工作流程（10）。为鉴定Glu替换为Met和Leu替换为Met的肽段，检索时使用注释列表，其中将*N. crassa*编码序列中的每个Glu或Leu均替换为Met。特别注意确保所鉴定的替换肽段来自此前未通过筛选的串联质谱数据，且不替代先前数据中的任何鉴定结果。所有错掺入Met的肽段

通过 MS-GF+ 分析鉴定的结果见数据集 S4。ECHO 按照文献（57）所述方法，用于鉴定 WT 样品中具有节律性的 Glu→Met 替换。

细胞活力检测

菌株和 Revvity Optiplates-96 板按照氧化应激实验中的方法进行准备。接种后，将板置于 25 °C 的持续黑暗（DD）条件下培养，并于第 3、4、5 和 6 天测定细胞活力。将细胞重悬，并与 0.4% 台盼蓝按 1:1（8 μL）混合，随后在 DD 条件下孵育 5 min。之后，将 8 μL 混合液加至血细胞计数板中，通过光学显微镜分别计数存活细胞（透明）和死亡细胞（蓝色），以确定存活细胞的百分比。

统计分析

按照先前所述方法（50，70），采用 F 检验比较昼夜节律时间序列数据与正弦波或直线的拟合情况。采用 Student’s t 检验评估 P-MAK1 和总 MetRS 水平的差异。P-MAK1 水平以总 MAK-2 水平进行归一化，MetRS 水平以总蛋白水平（Amido Black 染色）进行归一化。采用 Student’s t 检验评估 *ras-1*^bd^ 周期的差异。对细胞活力数据采用简单线性回归分析。采用重复测量双因素方差分析评估氧化应激数据以及 WT、Δ*frq*、*metRS*^T108A^ 和 *metRS*^T108D^ 菌株之间的时间序列比较。所有统计分析均使用 GraphPad Prism 完成，并至少包含 3 个生物学重复。

作者贡献

概念设计：D.B.P. 和 G.B.；研究：G.B.、S.M. 和 S.P.；数据分析与可视化：G.B.；写作：G.B. 和 D.B.P.；经费获取：D.B.P.。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢 Teresa Lamb 博士以及

感谢 Christopher Weitzel 对本研究提出的宝贵意见，并感谢真菌遗传学资源中心提供本研究所用的菌株。本研究由 NIH R35 GM126966 基金资助，资助对象为 DBP。

已申报的资助机构信息

美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所（NIH NIGMS），R35 GM126966

脚注

PNAS 要求通讯作者在投稿时提供 ORCID 标识符，并强烈建议所有作者使用 ORCID ID。请勿在稿件文件中填写 ORCID；各作者必须将自己的 ORCID 账户关联至 PNAS 个人资料，网址为 www.pnascentral.org。为确保身份验证正确，作者不得在校样阶段添加 ORCID。

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关键词：昼夜节律钟 · 翻译保真度 · 甲硫氨酸错误掺入 · MetRS磷酸化 · MAPK信号通路 · 氧化应激抗性

原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.30.735350v1?rss=1