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豆科植物根瘤通过形成特化细胞，使固氮细菌能够在细胞内定殖并支持其固氮酶活性，从而实现共生固氮。在本研究中，我们构建了蒺藜苜蓿根瘤和侧根的四维（3D空间与时间）空间转录组图谱，揭示了特化的共生细胞类型；这些细胞类型与一个保守的、源自侧根并支撑维管组织形成的发育程序同步发育。对植物和细菌转录本进行空间分析，解析出不同的转录状态以及此前未识别的细胞状态。对发育调控因子突变体的空间分析，揭示了根瘤成熟过程中一系列逐级发生、具有细胞类型特异性的程序。LSH1/LSH2是这些程序的核心调控因子；lsh1/lsh2突变体表现出激素梯度和根瘤身份的崩溃。值得注意的是，根瘤身份丧失后，组织状态转向初生根身份，而非侧根命运。本研究揭示，组织复杂性如何通过层叠的发育程序逐步形成，并由不同细胞区室维持，从而产生适于容纳固氮细菌的特化细胞类型。研究亮点- 对超过136,000个细胞进行分析，构建根瘤和侧根的四维空间图谱。- 三维空间分析与双物种分析解析出动态变化的宿主和根瘤菌细胞状态。- 共同分生组织产生三种在空间上协调的细胞程序：共生、非共生和维管程序。- LSH1/LSH2是根瘤发育及身份维持所依赖调控程序的关键因子。- 根瘤身份丧失后，组织状态转向与初生根相关的状态，而非侧根命运。
4D 空间转录组学揭示：根瘤身份通过叠加的并行发育程序形成 | bioRxiv
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4D 空间转录组学揭示：根瘤身份通过叠加的并行发育程序形成
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Katharina
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Giles E. D.
Oldroyd
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.06.23.733685
Min-Yao Jhu
1
剑桥大学植物科学系作物科学中心，
英国剑桥
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myj23{at}cam.ac.uk
Jo Heffer
2
剑桥大学英国癌症研究中心剑桥研究所，
英国剑桥
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Chongjing Xia
1
剑桥大学植物科学系作物科学中心，
英国剑桥
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Thiago Alexandre Moraes
1
剑桥大学植物科学系作物科学中心，
英国剑桥
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Novonesis，Gammel Venlighedsvej 14，
2970 Hørsholm，
丹麦
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Claire M. Mulvey
2
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Dario Bressan
2
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Chen Liu
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Jin-Peng Gao
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慕尼黑工业大学（TUM）生命科学学院植物遗传学系，德国弗赖辛 85354
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Philip Poole
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英国牛津大学生物学系，牛津
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Katharina Schiessl
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英国剑桥大学塞恩斯伯里实验室
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英国
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Giles E. D. Oldroyd
1 剑桥大学植物科学系作物科学中心，剑桥，英国
6 唐纳德·丹福思植物科学中心，美国密苏里州
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摘要
豆科植物根瘤通过发育出能够在细胞内容纳固氮细菌并支持细菌固氮酶活性的特化细胞，实现共生固氮。在本研究中，我们构建了蒺藜苜蓿根瘤和侧根的四维（3D 空间与时间）空间转录组图谱，揭示了特化的共生细胞类型；这些细胞类型与一个保守的侧根来源发育程序同步形成，而该程序支撑了维管组织的发育。对植物和细菌转录本进行空间分析，解析出了不同的转录状态以及此前未被认识的细胞状态。对发育调控因子突变体进行空间分析，揭示了根瘤成熟过程中一系列连续发生的、具有细胞类型特异性的程序。
LSH1/LSH2 是这些程序的核心调控因子；lsh1/lsh2 突变体表现出激素梯度和根瘤身份的崩溃。值得注意的是，根瘤身份的丧失最终导致的是初生根身份，而非侧根命运。这项研究揭示了组织复杂性如何通过叠加在不同细胞区室中维持的发育程序而产生，并由此形成适于容纳固氮……
细菌。
要点
超过 136,000 个细胞构建了根瘤和侧根的四维空间图谱。
三维空间分析与双物种分析解析了动态变化的宿主和根瘤菌细胞状态。
一个共同的分生组织产生了三个在空间上协调的细胞程序：共生、非共生和维管组织程序。
LSH1/LSH2 对根瘤发育和身份形成所依赖的调控程序至关重要。
根瘤身份丧失后，细胞状态趋向于初生根相关状态，而非侧根命运。
引言
豆科植物的共生固氮作用发生在根瘤中。根瘤是主要位于根部的特化器官，能在受控的细胞环境中促进微生物定殖和固氮¹˒²。在蒺藜苜蓿（*Medicago truncatula*）中，无限生长型根瘤具有持续存在的分生组织和纵向分区，包括侵染区、过渡区、固氮区和衰老区³–⁶。遗传学研究已确定许多结瘤所必需的核心信号节点和转录调控节点²˒³˒⁷–⁹。根瘤器官发生通常被认为是侧根发育程序在进化过程中的共选¹˒¹⁰–¹²。然而，成熟根瘤会形成高度特化的组织结构和共生细胞身份，而这些特征在侧根中并不存在，因此引出了一个尚未解决的核心问题：在器官发生过程中，保守的根发育程序如何被重新编排，以建立并维持根瘤身份？具体而言，根瘤原基发育过程中，不同的根瘤细胞身份何时、何处出现？它们如何与共生细菌状态协调？当根瘤身份调控因子失效时，会产生哪些发育状态？
根瘤器官发生受一个调控网络控制，该网络将共生信号与保守的根发育……
程序。结瘤的核心是转录因子 NODULE INCEPTION（NIN）¹³–¹⁶。NIN 位于共生信号及细胞分裂素受体 CRE1¹⁷˒¹⁸介导的细胞分裂素信号下游¹³。
NIN 可激活结瘤特异性发育调控因子以及与侧根相关的发育调控因子，包括经典的侧根调控因子 Lateral Organ Boundaries Domain 16（LBD16）¹⁰˒¹⁹，以及核心根分生组织调控因子，如 PLETHORAs（PLTs）²⁰、WUSCHEL-related homeobox 5（WOX5）和 SHORTROOT–SCARECROW（SHR–SCR）²¹模块，体现出根瘤与侧根之间共享的发育程序。然而，根瘤发育还需要器官身份调控因子，包括 NF-YA1¹⁰˒¹⁴和 LSH1/LSH2–NOOT1/NOOT2 模块²˒²²˒²³，并依赖生长素、细胞分裂素和赤霉素信号的协调作用⁷˒²⁴˒²⁵。这些研究表明，根瘤的形成源于根部发育程序的重构，但这些调控程序如何在时空上协调，并在细胞分辨率下建立起来，目前仍知之甚少。
近期的单细胞和单核转录组图谱揭示了以往整体 RNA 测序方法所掩盖的转录异质性²⁶–²⁹。早期时间点的数据集揭示了根瘤菌诱导的表皮及内部组织响应之间的协调性，以及结瘤相关信号的细胞类型特异性²⁶˒²⁸。成熟根瘤的单细胞图谱厘清了固氮区内的功能分工，并推断出连接分生组织状态与受侵染及未受侵染细胞命运的发育轨迹²⁷。然而，原生质体或细胞核解离可能引入细胞和转录层面的偏差³⁰˒³¹，并导致稀有、脆弱或结构上嵌入组织中的细胞群体代表性不足。
，并消除空间背景
32
、
33
。因此，空间关系和谱系进程必须通过标记基因及转录相似性间接推断。这一局限在植物中尤为重要，因为基因复制和功能分化可能改变空间表达域，即便是保守直系同源基因也不例外
34
、
35
，这使得标记在不同物种和发育背景之间的迁移更加复杂。因此，混合或无法解析的细胞簇仍是当前单细胞图谱中的常见现象。由此可见，我们需要一个具有空间分辨率的发育框架，以确定结瘤细胞身份何时出现，以及这些细胞在其原生组织背景中的空间组织方式。
在此，我们采用 Xenium
原位
36
技术，构建结瘤的四维空间转录组图谱（3D 空间加时间），将亚细胞分辨率的基因表达与发育时序分析相结合。通过在结瘤发育过程中分析 405 个与蒺藜苜蓿结瘤相关的基因，并在成熟根瘤中分析 50 个根瘤菌基因，我们绘制了涵盖根瘤形成、成熟以及宿主—微生物转录状态的空间图谱。该框架揭示了转录相似的前体细胞何时、何地分化为不同的根瘤相关和根相关命运，以及多个发育程序如何在同一原基内协调进行。进一步的靶向遗传扰动（
cre1、nf-ya1、lsh1/lsh2、noot1/noot2
和
lbd16
）表明，关键根瘤身份调控因子的受损并不会导致细胞转变为侧根。相反，身份缺失的根瘤会转向与主根相关的转录状态，但该状态仍不同于典型的侧根发育程序。总之，这一四维空间……
转录组资源为理解保守的根发育模块如何在不定型根瘤和侧根器官发生过程中重新分配，并形成共生固氮所需的细胞复杂性，提供了一个框架。
结果
空间定位解析根瘤转录组中的细胞身份
为建立具有空间依据的成熟根瘤细胞身份参照图谱，我们采用 Xenium *原位*空间转录组工作流程³⁶，对接种后 14 天（DPI）的野生型蒺藜苜蓿（*M. truncatula*）根瘤进行分析，使用了两种探针面板设计：包含 50 个基因的试验面板，以及扩展至 405 个基因的面板（350 个核心基因加 55 个扩展基因）（图 1）。该面板涵盖激素信号组分、细胞类型标记，以及依据已发表的蒺藜苜蓿单细胞和单核数据集²⁶˒²⁷及时间序列整体 RNA-seq 数据集¹⁰˒²³选取的代表性侧根和根瘤发育相关基因。
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图 1.
空间转录组学改进了成熟蒺藜苜蓿根瘤的细胞类型注释
（A）左图：野生型蒺藜苜蓿 *Medicago truncatula* A17 和 R108 在接种后 14 天（DPI）根瘤的细胞壁分割空间转录组图谱的 UMAP 图，聚类依据为空间基因表达和组织学背景。共鉴定出 15 种主要细胞类型：根内皮层和内层皮层（REndo_RIC，0）、根瘤薄壁细胞和根内层皮层（NPC_RIC，1）、根和根瘤维管组织（内皮层；RNV_Endo，2）、根皮层（RC，3）、根瘤外层皮层和根皮层（NOC_RC，4）、根瘤维管组织（内皮层；NV_Endo，5）、固氮区未感染细胞（UninNF，6）、根瘤顶端皮层和中央分生组织（NAC_CM，7）、固氮区感染细胞（InNF，8）、感染区特异的……
R108（IF_R108，9）、结瘤表皮和薄壁组织（NEP，10）、A17 中的侵染区及过渡区（IF_IZ_A17，11）、根中柱鞘（RPeri，12）、根和根瘤维管组织（中柱鞘；RNV_Peri，13），以及 R108 特有的过渡区（IZ_R108，14）。完整的细胞簇注释见表 SS3。右侧为空间图，显示代表性 A17 和 R108 根瘤切片中已注释细胞类型的定位。
（B）将已发表的 14 DPI 单细胞 RNA 测序图谱标签转移至 Xenium 细胞和组织空间后的 UMAP 图及空间图。缩写：NA1/NA2（根瘤顶端）、PI（侵染前区）、IF（侵染区）、NF1/NF2（固氮区）、NP（根瘤薄壁组织）、VA（维管组织）、UiC1/UiC2（未侵染细胞）、UN1–3（未知）、MIX（混合身份）。
（C）共享单细胞 RNA 测序基因与 Xenium 基因之间的归一化表达相关性。每个点代表一个基因；对角线表示表达量相等。
（D）按标签转移置信度评分着色的 UMAP 图。
（E）空间定义的细胞类型与转移所得单细胞标签的比较。
（F）点图显示定义（A）中空间细胞类型的标记基因表达。
（G）代表性标记转录本（MtLEC4、Lb1、MtUMAMIT14）的 Xenium 可视化。另见图 S1-2 和表 S1。
基于细胞壁的分割可 delineate 单个植物细胞，从而开展定量空间转录组分析（图 1）。对空间基因表达进行无监督聚类，识别出 15 个细胞簇，对应于主要解剖区域，包括侵染区、固氮区、皮层和维管组织；这些区域在野生型蒺藜苜蓿 A17 和 R108 生态型之间总体上保持保守（图 1A）。R108 中的侵染区和过渡区细胞群被分别识别（簇 9 和 14），但】【。
在 A17（cluster 11）中仍保持合并，提示不同生态型之间存在分区差异（Figure 1A）。空间定位使我们能够对转录特征相似、且难以通过基于解离的单细胞数据集加以区分的皮层和维管细胞群进行解剖学注释（Figure 1A）。
为评估这些注释，我们将已发表的 A17 14-DPI 单细胞 RNA 测序图谱²⁷中的标签转移至本研究的 A17 和 R108 Xenium 14-DPI 数据集（Figure 1B）。转移后的细胞标签既显示在同一 UMAP 嵌入中，也映射回 Xenium 组织切片（Figure 1B）。尽管感染区和固氮区的细胞身份大多得以恢复，但皮层、维管组织及过渡区细胞群存在显著混杂，且标签置信度较低（Figure 1B、D）。值得注意的是，单细胞图谱中先前注释为“unknown 1²⁷”的一个大型细胞群，被映射至多个解剖学上不同的空间区域，包括根瘤皮层、根皮层和维管组织。这表明该细胞群是多个细胞身份的复合体，而非一种独立的细胞类型（Figure 1B、E）。总体而言，这些分析表明，空间背景显著提升了对转录特征相似的根瘤细胞状态的分辨能力；同时也提示，部分由单细胞分析界定的“细胞类型”实际上由空间上不同的调控状态混合而成，这可能既反映了空间信息的丢失，也反映了组织解离相关的转录变化。
尽管 Xenium 分析的是一组目标基因，而非全转录组，但标准化后，对于大多数共有基因，其相对灵敏度更高；与单细胞 RNA 测序结果总体呈中等程度的一致性（R² ≈ 0.537；Figure 1C）。标签转移置信度在以下区域最高：
转录特征各异的固氮区细胞群体，以及在周边组织和维管组织中较低的表达水平（图 1D、E，图 S1），进一步凸显了空间背景信息对于区分解剖位置相邻的细胞状态的价值。
利用空间定义的细胞簇，我们鉴定了全部 15 个细胞簇中表达量最高的 3 个标记基因（图 1F），为后续细胞类型鉴定和注释提供了具有空间定位依据的标记资源。在植物生物学中，细胞类型注释通常依赖通过启动子报告系、原位杂交，或从拟南芥等模式物种转移而来的直系同源标记基因所鉴定的标记基因。然而，启动子活性不一定能反映内源性转录本的定位，而且不同物种间标记基因的空间表达域并非总是保守的。尽管原位杂交能够提供可靠的空间验证，但这一方法耗时费力，难以在大量基因和发育阶段中大规模应用。空间转录组学通过直接测定完整组织中的转录本定位，为建立纳入空间信息的标记基因资源提供了更高分辨率且系统化的框架。例如，先前作为单细胞标记使用的三个基因¹⁰²⁷——凝集素（MtLEC4）、豆血红蛋白 1（MtLb1）和通常多酸进出转运蛋白（MtUMAMIT14）（图 1G）——此前是通过基于启动子 GUS 的报告系统发表的²⁷；空间转录组学则以更清晰的细胞分辨率揭示了它们的定位：MtLEC4 与未受感染的固氮细胞相关，MtLb1 与受感染的固氮区细胞相关；而先前与“未知 1”簇²⁷相关的 MtUMAMIT14，经空间转录组学分析发现定位于维管内皮层的。
物种特异性注释，解决了此前含糊不清或尚未解决的注释问题（图 1G）。
基于细胞壁和基于细胞核锚定的分割方法得到的细胞簇及标记基因表达谱总体一致，但两种方法对不同区域的敏感性有所差异（图 S2、S3）。基于细胞壁的分割更利于解析扩大的皮层细胞和固氮区细胞，而平行采用的细胞核锚定分割则提高了对密集分布的分生组织和维管组织的检测能力（图 1、S1）。因此，分割策略会影响对不同区域的检测敏感性，可根据研究的生物学重点进行优化，同时保留核心细胞状态结构。
三维空间分析揭示晚期成熟根瘤的结构及细胞多样化
为全面解析单张二维切片难以分辨的晚期结构，包括周边维管组织（图 S4）和稀疏分布的细胞状态，我们对石蜡切片进行连续 Xenium 分析，构建了 49-DPI 根瘤的三维空间转录组图谱（图 2），并依据组织学特征进行配准（图 S5A-B）。同时，连续双光子断层成像（STPT）提供了根瘤整体结构及其内源性自发荧光的三维可视化结果（图 S5C-D、视频 S1）。STPT 揭示了根瘤周边维管组织的三维组织结构，以及固氮区内具有代谢活性的根瘤菌所产生的自发荧光（图 S5C-D）；这些信号向基部逐渐减弱，与存在一个代谢活性降低的衰老相关区域相一致（图 S5C-D、视频 S1）。由此，我们得以重建晚期根瘤的三维表型（图 2、图 S5）。
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图 2.
双物种三维空间转…
转录组学解析晚期根瘤结构及根瘤菌的转录状态
（A–B）49 DPI 三维空间转录组图谱的代表性 Xenium 切片及 UMAP。共解析出 19 个簇，注释如下：根瘤分生组织及根瘤上部内皮层（NM_NIC_U，簇 0）、根内皮层（RIC，簇 1）、根瘤下部内皮层（NIC_L，簇 2）、根皮层（RC，簇 3）、固氮区未感染细胞（UninNF，簇 4）、根和根瘤外皮层及表皮（RNOC_Epi，簇 5）、根瘤上部内皮层（NIC_U，簇 6）、固氮区感染细胞（InNF，簇 7）、根和根瘤皮层（RN_Ctx，簇 8）、根瘤维管束内皮层（NV_Endo，簇 9）、侵染区未感染细胞（UninIFZ，簇 10）、固氮区下部未感染细胞（UninNF_L，簇 11）、根瘤上部外皮层及表皮（NOC_U_Epi，簇 12）、根瘤分生组织（NM，簇 13）、根外皮层及表皮（ROC_Epi，簇 14）、根和根瘤维管束（RNV，簇 15）、侵染区感染细胞（InIFZ，簇 16）、间区感染细胞（InIZ，簇 17）以及侵染前区细胞（PreIFZ，簇 18）。
（C–D）侵染区和间区中感染与未感染细胞群的空间分布及标记基因表达。感染细胞（InIFZ，16；InIZ，17）与侵染区未感染细胞（UninIFZ，10）彼此分离。与侵染相关的细胞群表达 MtNodGRP1B、MtLOG1 和 MtENOD12，而未感染细胞表达 MtLEC4。
（E–F）固氮区细胞群的空间分布及标记基因表达。除感染细胞（InNF，7）外，还有两个未感染细胞群分别为
解析得到 UninNF（4）和 UninNF_L（11）。感染细胞表达 MtLb2，而未感染细胞群则差异表达 MtAS2 和 MtNR2。（G–I）整合双物种数据集的空间图谱和 UMAP，该数据集包含 350 个蒺藜苜蓿基因和 50 个根瘤菌基因。共鉴定出 21 个簇：根瘤内皮层（上部；NIC_U，簇 0）、根瘤内皮层（下部；NIC_L，簇 1）、根内皮层（RIC，簇 2）、根瘤中皮层（下部；NMC_L，簇 3）、固氮区未感染细胞（UninNF，簇 4）、侵染区（IFZ，簇 5）、根瘤外皮层及表皮（NOC_Epi，簇 6）、固氮区感染细胞（InNF，簇 7）、根外皮层（ROC，簇 8）、根瘤未感染细胞及表皮（NUnin_Epi，簇 9）、根瘤外皮层及表皮（下部；NOC_L_Epi，簇 10）、侵染区感染细胞（InIFZ，簇 11）、侵染区未感染细胞（UninIFZ，簇 12）、侵染前区（PreIFZ，簇 13）、根瘤外皮层及表皮（上部；NOC_U_Epi，簇 14）、根瘤维管组织内皮层（NV_Endo，簇 15）、根瘤分生组织及根瘤内皮层上部（NM_NIC_U，簇 16）、过渡区未感染细胞（UninIZ，簇 17）、过渡区感染细胞（InIZ，簇 18）、跨越过渡区和固氮区的感染细胞（InIZ_NF，簇 19），以及衰老区（SenZ，簇 20）。
（J–M）根瘤菌基因在成熟根瘤中的空间表达。nifH 在过渡区富集，而 nifA 在固氮区富集，在与衰老相关的区域中表达降低。
另见图 S5-7 和表 S1。
对三维空间转录组数据集进行聚类，解析出涵盖根瘤分生组织等区域的主要细胞类型，
皮层区、维管区、感染区和固氮区，以及晚期未感染细胞群（图 2A-B）。与 14-DPI 根瘤不同，晚期 49-DPI 根瘤沿纵轴呈现出显著的空间分层，包括不同的皮层细胞群和维管相关细胞群；通过三维重建，这些细胞群得以更清晰地解析（图 2A-B，图 S3）。这种分层组织结构表明，沿顶端至基部轴的功能特化逐步增强，也凸显了三维分析对于解析单个二维切片无法完整呈现的结构的重要性。
三维图谱解析了 49-DPI 根瘤感染区、间区和固氮区中转录特征不同的感染细胞群与未感染细胞群（图 2C–F）。感染区内的感染细胞（cluster 16）和间区感染细胞（cluster 17）表达早期结瘤素 12（Early Nodulin 12，MtENOD12）、孤儿细胞分裂素合成酶 1（LONELY GUY 1，MtLOG1）和结瘤特异性富甘氨酸蛋白 1B（Nodule-specific Glycine-rich Protein 1B，MtNodGRP1B）；与其相邻的未感染细胞（cluster 10）则表达凝集素 4（Lectin 4，MtLEC4）（图 2C–D；图 S4）。
在固氮区内还解析出两个转录特征不同的未感染细胞群，而这些细胞群在 14 DPI 时并未被解析出来（图 2A–F）。除表达 MtLb2 的感染细胞（cluster 7）外，上部未感染细胞群（cluster 4）表达天冬酰胺合成酶 2（Asparagine synthetase 2，MtAS2）和硝酸还原酶 2（Nitrate reductase 2，MtNR2），与其参与活跃的氮同化和运输相符；而另一个位于下部和基部的细胞群（cluster 11）则表现出这些标记基因表达降低，表明沿纵轴存在功能分化（图 2E–F）。与感染区和间区相关的未感染细胞（cluster 10）也……
尽管在解剖学上难以区分，这些群体在转录特征上仍与固氮区未感染细胞群体明显不同（图 2A–F）。
将 14-DPI 单细胞图谱中的标签转移至 49-DPI Xenium 数据集后发现，固氮区细胞群体之间存在部分对应关系；但许多皮层、维管组织和晚期细胞群体的对应关系有限。这凸显了 14-DPI 之后根瘤发育的分化，以及根瘤成熟过程中转录谱的变化；这些变化导致标签转移能力有限（图 S5）。基于细胞壁和细胞核的分割方法得到的聚类及标记基因总体一致，差异主要体现在区域敏感性上（图 2，图 S5–7）。总体而言，这些分析表明，成熟根瘤的细胞身份具有空间组织性、动态维持，并且在发育晚期仍持续分化。然而，从宿主转录组层面看，固氮区的受感染细胞仍大多无法彼此区分，因此需要开展双物种空间分析，以解析原位宿主–微生物功能状态。
双物种空间转录组学解析固氮区内根瘤菌的转录状态
为解析受感染细胞内部的功能异质性，我们在双物种空间分析面板中纳入 50 个根瘤菌靶标，对植物宿主及其细菌共生体同时进行 Xenium 分析（表 S1）。整合植物与根瘤菌转录本后，我们在受感染组织中发现了额外的转录状态；仅使用蒺藜苜蓿（*M. truncatula*）靶标无法检测到这些状态（图 2G–I）。根瘤菌转录本参与了受感染细胞群体的聚类，表明形态相似的宿主细胞内部存在不同的细菌转录状态（图 2G–M）。
空间定位分析揭示了成熟根瘤中细菌转录状态的转变。固氮酶结构基因
nifH
在间区富集，该区域与类菌体分化的启动相关；而固氮调控因子
nifA
则在成熟固氮区域富集（
Figure 2J–K
），标志着成熟感染细胞中固氮所需的厌氧状态已完全建立。
双物种分析还揭示了 49 DPI 时不同根瘤之间存在异质性。一些根瘤表现出明显的间区活性和较强的
nifH
表达；另一些则含有范围扩大的
nifA
表达降低区域，对应于衰老区，提示根瘤菌活性正在下降（
Figure 2L–M
）。这些模式与 STPT 成像观察结果一致（Figure S5C-D, Video S1）。共表达分析鉴定出连接宿主与细菌基因的模块。其中一个模块显示
MtLb2
与根瘤菌基因（包括
gltA
、
nifA
和
fixK1
）在空间上的共表达，这与氧缓冲、细菌呼吸和固氮的协同调控相符。该模块还包含与二羧酸利用和中心碳代谢相关的基因，表明固氮区内存在协同的宿主—微生物转录程序。
总体而言，这些结果表明，双物种空间转录组学能够解析宿主细胞内的细菌转录状态，并揭示仅凭宿主分析无法观察到的宿主—微生物协同基因表达。
时间分辨的空间转录组图谱揭示根瘤与侧根发育过程中共有及器官特异性的细胞身份
根瘤发育建立在预先存在的侧根发育程序之上，但
逐步分化，最终形成不同的器官身份和形态。为界定这一转变所依赖的共同及器官特异性发育轨迹，我们构建了涵盖连续发育阶段和两种生态型（A17 和 R108）的野生型侧根与根瘤数据集（图 3，图 S8–S9）。侧根通过重力诱导，在五个发育阶段（诱导后 1–6 天，DPI）进行分析；根瘤则通过根瘤菌点接种，在覆盖器官发生完整过程的九个阶段（1–49 DPI）进行分析（图 S8–S9；表 S1），从而能够直接比较这两种器官。整合分析采用以细胞核为锚点的分割方法，以确保在细胞密集的早期原基组织中可靠地检测细胞（图 3，图 S8–S9）。
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图 3.
四维空间参照图谱界定成熟侧根与根瘤中的共同及器官特异性细胞身份
(A) 基于 405 基因面板构建的整合四维空间转录组图谱的 UMAP，涵盖不同发育时期和生态型（A17 和 R108）的全部野生型侧根与根瘤样本。共鉴定出 21 个空间定义的细胞群；簇 0，根内皮层（REndo）；簇 1，根皮层（RCx）；簇 2，根与根瘤维管组织（中柱）（RNV_St）；簇 3，根表皮层与皮层（REpiCx）；簇 4，固氮区未感染细胞（UninfNF）；簇 5，根皮层与根瘤上部外皮层（RCx_UOC）；簇 6，根皮层与根瘤下部外皮层（RCx_LOC）；簇 7，根与根瘤维管组织（内皮层）（RNV_Endo）；簇 8，根瘤与根分生组织/原基（NRMerPr）；簇 9，感染前区（PIF）；簇 10，根与根瘤周鞘（RNP_Pc）；
簇 11，感染区（IF）；簇 12，根内皮层（RIC）；簇 13，固氮区感染细胞（InfNF）；簇 14，根表皮 + 外皮层（REpiOC）；簇 15，根内皮层 + 中柱鞘（REndoPc）；簇 16，侧根尖端皮层（LRTipCx）；簇 17，侧根冠（LRCap）；簇 18，根维管组织（中柱）（RV_St）；簇 19，侧根表皮 + 皮层（伸长区）（LR_EpiCx_EZ）；簇 20，根分生组织（RMer）。右侧为按器官显示簇组成的条形图。
（B）按组织类型着色的 UMAP，突出显示器官富集簇。
（C–D）侧根细胞（D）和根瘤细胞（E）的 UMAP，以及显示不同发育阶段细胞类型组成的条形图。根瘤富集簇以蓝色轮廓标示，侧根富集簇以红色轮廓标示。
（E–H）按细胞类型身份着色的 A17 组织空间图：6 DPI 的侧根（E），以及 14、28 和 49 DPI 的根瘤（F–H）。
（I–K）成熟根瘤区域放大图，分别显示基部维管组织（I）、与分生组织相关的维管组织（J），以及分生组织至感染区的过渡区域（K）。
（L–N）按相同细胞类型身份着色的 R108 组织空间图：4 DPI 的侧根（L），以及 14 和 28 DPI 的根瘤（M–N）。
另见图 S8–9 和表 S1。
对所有野生型侧根和根瘤样本进行联合嵌入，生成统一的 UMAP，其中包含 90,389 个经过筛选的细胞和 21 个依据空间位置定义的簇，涵盖共有及器官特异性细胞身份（图 3A；表 S1）。尽管许多簇均包含来自两种器官的细胞（图 3B），但与感染相关的细胞群（簇 9、11）和固氮区细胞（簇 4、13）仅来源于根瘤。相比之下，侧根尖端皮层（簇 16）、侧根###
根冠（簇 17）以及伸长区表皮和皮层（簇 19）仅见于侧根（图 3A–D）。时间分析揭示了不同的发育动态（图 3C–D）：侧根身份在较短时间内（4–6 天）迅速建立，而根瘤则经历渐进且依赖发育阶段的重塑，其特征是前感染区、感染区和固氮区细胞群依次出现。尽管存在这些差异，大多数细胞类型在侧根和根瘤之间呈现重叠的转录组特征，凸显了这两种发育结构的共性；特定细胞群中独特的转录程序则驱动了二者的分化（图 3A–D）。
空间定位解析出不同的侧根、感染区和固氮区细胞群，并揭示了器官发育过程中共有及器官特异性细胞身份的组织方式（图 3E–H）。高分辨率图像进一步显示，侧根与根瘤维管组织具有共有的转录特征；靠近根瘤基部的中柱和内皮层细胞群（簇 2、7）表现出与主根组织密切相关的身份特征（图 3E、I）。在根瘤顶端附近、毗邻共有的根—根瘤分生组织/原基细胞群（簇 8）的位置，也始终检测到维管组织相关细胞群（图 3J）。在不同发育阶段和生态型中，该细胞群均见于侧根根尖和根瘤顶端（图 3E–N）。在成熟根瘤（接种后 14–49 天）中，分生组织细胞群（簇 8）始终毗邻前感染区和感染相关细胞群（簇 9、11）、维管组织相关的内皮层细胞（簇 7），以及外层皮层和未感染的
固氮区细胞群（cluster 5、6、4）（Figure 3J–K）。这些细胞类型在空间上的相邻分布表明，结瘤组织具有有序的结构，其核心是一个单一的分生组织区域，并由此衍生出多种谱系发育程序。
为确定成熟根瘤中观察到的谱系关系最早何时出现，我们分析了侧根和根瘤原基的早期发育阶段，以比较其初始空间组织和转录组织（Figure 4）。侧根早期发育（1–4 DPI）表现出相对均一的组织结构（Figure 4A–E），原基主要由共同的分生组织细胞群（cluster 8）以及与维管组织相关的细胞类型（cluster 7、10、2）构成（Figure 4A–E）。至 6 DPI，侧根逐渐分化出侧根特异性的皮层和根尖身份（cluster 16），同时仍保有显著的维管相关细胞群。总体而言，侧根发育遵循相对线性的轨迹：核心细胞身份早期建立，而后续分化有限。
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图 4.
根瘤原基的早期空间分化揭示了根瘤器官发生所涉及的多种发育程序
(A–E) A17 侧根在 1、2、3、4 和 6 DPI 时的空间分布图，按 Figure 3 中定义的细胞类型身份着色。
(F–J) A17 根瘤在 1、2、3、4 和 7 DPI 时的空间分布图，显示分生组织（8）、皮层（4）、感染前区（9）和感染区（11）细胞群的出现。
(K) 7 DPI 根瘤尖端的放大图，显示分生组织组织（8）、感染前区（9）、感染区（11）以及周围皮层细胞群的空间组织。
(L–O) 早期根瘤和侧根发育过程中代表性发育调控因子的空间表达。
发育。
SCR 和 SHR 标记内胚层、皮层及血管相关区域；WOX5、PLT1 和 PLT4 标记分生组织细胞群；NF-YA1 在根瘤感染前组织和感染相关组织中富集，但在侧根原基中缺失。
(P) 按真实发育时间（1–49 DPI）着色的 UMAP 图，并显示相应分期的细胞类型组成。
(Q) Slingshot 伪时间轨迹，展示共享原基/分生组织细胞群向血管、皮层/未感染及感染相关谱系的分化。细胞按伪时间着色。
(R) 概念模型，总结共享根瘤分生组织中形成的三种主要发育程序：感染谱系、未感染谱系和血管谱系。
另见图 S10。
相比之下，早期根瘤原基从所分析的最早阶段（1–4 DPI）起便表现出显著更高的异质性（图 4F–I）。共享原基/分生组织周围（cluster 8）出现多个转录特征各异的细胞群，包括感染前细胞、感染相关细胞（cluster 9、11）、皮层细胞（cluster 5）和血管相关细胞（cluster 7、10），这些细胞群预示了成熟根瘤的组织结构。尽管这些阶段在形态上无法区分，这些细胞群已呈现出不同的转录特征，表明谱系分化早于明显的解剖分区。至 7 DPI 时，这些区域已形成有序的分生组织结构，其周围分布着感染相关、皮层及血管相关组织（图 4J–K）。总之，这些观察结果表明，与侧根不同，根瘤在早期原基形成过程中会并行启动多种发育程序。
标记基因的表达进一步支持了这些差异（图 4L–O）。
SCR 和 SHR
该表达模式在侧根原基中标记了内胚层和周鞘区域，而在根瘤中，SCR的表达扩展至皮层及与根瘤原基相关的区域（图4L、N），这与既往关于结瘤过程中SCR在皮层中表达范围扩大的报道一致^21。与分生组织相关的调控因子（WOX5、PLT1和PLT4）在根瘤原基中呈不对称分布，不同于侧根原基中紧凑且居中的表达区域（图4L、N；图S10）；这反映了发育中的根瘤维管组织位于周边，而非围绕单一中央轴分布。NF-YA1在侧根原基中不表达，但在根瘤原基中富集，定位于根瘤原基邻近细胞，并与新出现的预感染及感染相关细胞群重叠（图4L–O）。这些模式表明，根瘤原基中的不同细胞群共存着类侧根和根瘤特异性的转录程序。
为将空间组织与发育进程联系起来，我们整合了真实发育时间与Slingshot拟时序推断（图4P–Q；图S9D）。在侧根中，从原基/分生组织细胞（簇8）出发的轨迹主要指向侧根尖端（簇16）和维管内胚层细胞身份（簇7）。在根瘤中，原基/分生组织细胞同样与维管内胚层细胞身份（簇7）相连，表明根瘤维管组织的发育可能采用源自根的发育程序。根瘤原基还产生了其他轨迹，分别指向皮层及未感染的固氮区细胞（簇4）、感染区细胞（簇11）和已感染的固氮区细胞（簇13）；这些轨迹在侧根中未见。
根。整合空间、时间和发育轨迹分析后，我们提出这样一种模型：共同的原基/分生组织细胞群产生三种协调的发育程序，即维管、非共生皮层和共生感染相关程序（图 4R）。总之，这些结果表明，结瘤细胞类型的多样化在原基形成的最早阶段便已建立，并形成多条并行发育的细胞谱系，以支持共生功能；与此同时，还存在一个与侧根保守的发育程序，最终形成维管组织。重要的是，根据成熟根瘤推断出的细胞谱系结构，也反映了早期形成且持续存在的模式化决定，为解读发育轨迹提供了概念框架。
结瘤调控因子在根瘤发育建立和细胞类型指定中的作用
根瘤与侧根的比较揭示了独特的细胞发育轨迹，这些轨迹产生了根瘤的关键功能：既有能够容纳固氮细菌的细胞，也有未受感染、似乎参与氮同化的细胞。已有研究证实，成熟的遗传调控因子对于根瘤功能至关重要，包括 NIN、CRE1、NF-YA1、LSH1/LSH2 和 NOOT1/NOOT2；此外，还有一些调控因子在侧根和根瘤中具有重叠功能，包括 LBD16 和 STY。为更深入地了解这些调控因子的功能，我们首先绘制了它们在早期发育阶段（4 和 7 DPI）的表达模式（图 5A–B；图 S11）。
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图 5.
关键结瘤调控因子及细胞分裂素信号的扰动会改变根瘤早期细胞类型的出现及其空间组织
(A–B) CRE1、NIN、LBD16、NF-YA1 的空间分布，
LSH1/LSH2
和
NOOT1/NOOT2
在 4 DPI（A）和 7 DPI（B）的代表性 A17 根瘤中的表达。
（C）野生型和突变体组织中按簇划分的细胞类型组成。颜色对应于图 3 所示的空间定义簇。
（D–E）早期发育阶段野生型（D）和突变体（E）数据集的整合 UMAP 图及簇组成。
（F–G）按簇身份着色的野生型和突变体根瘤空间图。（F）7 DPI 时的 A17、
cre1、nf-ya1、lsh1/lsh2、noot1/noot2
和
lbd16
。（G）4 DPI 时的 A17、
cre1、nf-ya1
和
lsh1/lsh2
。
另见图 S11–S12。
在 4 DPI 时，与细胞分裂素感知在根瘤早期起始中的既定作用一致¹⁷˒¹⁸，
CRE1
和
NIN
在原基的内皮层、内皮和周鞘区域共同富集（图 5A，图 S11），并伴随
NF-YA1
、
LSH1/LSH2
和
NOOT1/NOOT2
的表达，形成一条核心调控轴，将根瘤身份与周围根组织区分开来。
NF-YA1
在感染前细胞和感染相关细胞中富集，但在维管前体细胞中不表达（图 5A），进一步印证了维管谱系与感染谱系在早期即发生分化（图 4）。相比之下，
LBD16
的表达局限于外层皮层（图 5A），这提示一种类似侧根的皮层程序在根瘤起始过程中被部分重新启用，但在空间上仍与细胞分裂素–
NIN
调控轴相互分隔。
至 7 DPI，这些调控区域逐渐得到进一步精细化（图 5B，图 S11）。
CRE1
仍广泛分布，但在分生组织和维管相关区域附近相对富集。
NIN
和
NF-YA1
集中分布于感染前区和感染区，与其在协调感染和共生分化中的既定作用相符，其中
NF-YA1
其富集最显著的区域为感染前区和感染区（图 5B），这与既往观察结果一致：随着根瘤成熟，NF-YA1 的表达局限于与感染相关的组织中^14。相反，LBD16 的表达降低，并局限于邻近发育中维管组织的一处狭窄顶端区域，这支持其主要在原基早期建立过程中发挥作用，而非参与后期分区（图 5B）。值得注意的是，根瘤身份调控因子 LSH1/LSH2 和 NOOT1/NOOT2 在分生组织以及发育中的感染区和固氮区周围未受感染的外围细胞中富集（图 5B、图 S11），这提示维持根瘤身份需要来自外围区域的协同调控，而非仅依赖受感染细胞或分生组织。总之，这些数据揭示了一种模块化结构，包括以细胞分裂素–NIN 为核心的轴、感染相关模块以及外围身份维持模块；这些模块共同决定根瘤早期的模式形成。
为检验这些模块如何调控器官发生，我们将其功能缺失突变体整合至空间图谱中，重点分析了 cre1^18 和 nf-ya1^37,38（A17 遗传背景），以及 lsh1/lsh2^23、noot1/noot2^39 和 lbd16^10（R108 遗传背景）（图 5C–G）。我们未将 nin 纳入这些分析，因为我们已知 nin 功能缺失突变体几乎完全丧失结瘤相关基因的表达，且不发生根瘤起始^40。cre1 和 nf-ya1 保留了大多数根瘤早期相关细胞簇，但各簇的相对丰度有所不同。cre1 根瘤中，感染前及早期感染相关细胞群（细胞簇 9、11）的比例增加（图 5C–G），这与既往报道以及我们的观察一致，表明……
早期阶段，cre1 突变体表现出超感染表型（图 5F–G；图 S12A）¹⁸。相比之下，nf-ya1 根瘤中与感染相关的细胞簇以及与原基/分生组织相关的细胞（簇 8）均减少，这与既往观察一致：nf-ya1 突变体的感染受限（图 5F–G；图 S12A），且分生组织活性降低或缺失¹⁴˒³⁷。
在较晚的时间点，cre1 根瘤逐渐变得组织紊乱（图 6A–D）。尽管早期阶段感染增强，但成熟的 cre1 根瘤大小差异显著，部分根瘤无法维持结构完整的感染区（图 6D）。部分 cre1 根瘤无法维持持续存在的分生组织结构域，其表面上类似于具有限定生长型根瘤：中央为固氮区，但缺乏野生型 *M. truncatula* 根瘤所具有的明显分区。整合分析显示，与侧根相关的细胞群富集；然而，空间定位分析表明，这些细胞源自邻近侧根，而非根瘤本身（图 6A–D），说明 cre1 并未将根瘤组织重编程为侧根命运。相反，未受感染的皮层细胞群和维管相关细胞群有所扩增，而共生细胞谱系未能稳定形成。这表明，依赖 CRE1 的细胞分裂素信号对于强化根瘤分化并维持根瘤分生组织至关重要。
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图 6.
较晚阶段的突变体分析显示，细胞状态向初生根相关状态崩解
（A）野生型 A17/R108 根瘤、cre1、nf-ya1 和 lsh1/lsh2 根瘤，以及不同发育时期野生型 A17/R108 侧根的整合 UMAP 图，按图 3 所示细胞类型标识着色。
（B）相同的 UMAP 图，按发育阶段着色。
时间。
（C–F）14 和 28 DPI 时突变体根瘤的空间分布图：（C）A17、（D）cre1、（E）nf-ya1 和（F）lsh1/lsh2。下方为 28 DPI 时 lsh1/lsh2 根瘤的放大图，显示其中央组织结构。
（G）4 DPI 时 R108 侧根和主根的空间分布图，用于与 lsh1/lsh2 根瘤进行比较。另见图 S12。
类似地，nf-ya1 根瘤表现出感染受限、分生组织活性丧失以及根瘤整体尺寸减小的特征（图 6A–C、E）。在成熟过程中，与感染和分生组织相关的细胞群（簇 9、11、8）逐渐减少（图 6A–C、E）；而未感染的固氮区细胞类型（簇 4）以及与主根相关的皮层细胞群（簇 3、1、6）则在根瘤结构中扩增。至 28 DPI 时，nf-ya1 根瘤尺寸较小，且常缺乏连贯的分生组织区域，感染区和固氮区均严重缩减。真实时间嵌入和拟时序分析显示其发育停滞，只有少数细胞能够进展至成熟共生状态（图 6B、图 S12）。这些发现表明，NF-YA1 对感染进程以及成熟过程中根瘤身份的稳定至关重要。缺失 NF-YA1 时，皮层细胞在一定程度上保留了类似主根的转录状态。因此，cre1 和 nf-ya1 根瘤均表现为分生组织程序减弱，以及与根瘤成熟功能相关的细胞群减少（图 6A–E），但所有主要根瘤细胞类型仍可检测到。
表型最严重的是 lsh1/lsh2 突变体，其根瘤特异性细胞群几乎完全丧失，包括受感染和未受感染的固氮区谱系（簇 13、4）、感染前细胞群和感染细胞群，以及……
原基/分生组织细胞群（图5C–G）——这些细胞类型决定了根瘤的功能性。该细胞群的减少伴随着根组织相关转录状态（簇3）的占比增加（图5F），这与此前的报道一致：lsh1/lsh2突变体无法维持根瘤身份，并呈现异常的类根形态^23。值得注意的是，尽管根瘤身份崩解，lsh1/lsh2根瘤并未获得侧根特异性的皮层身份（簇16）（图5C–E）；相反，在整个类根瘤原基结构中，lsh1/lsh2根瘤均以类主根转录身份（簇3）为主（图5F）。在晚期时间点，lsh1/lsh2突变体形成的结构缺乏野生型中观察到的任何发育结构：根瘤相关细胞类型的组织化及其存在均告崩解，同时通常仅限于主根的细胞类型侵入这些结构（图6A–B、F–G）。这表明，根瘤身份的丧失反映的是从主根身份向根瘤身份的转变未能完成或维持，而非细胞命运被重编程为侧根命运。
相比之下，noot1/noot2和lbd16突变体仅表现出非常轻微的表型：大多数早期根瘤细胞类型得以保留，但特定簇受到选择性扰动，使细胞类型比例发生适度变化，而非根瘤身份整体崩解（图5C–F；图S12A）。
综合这些分析，可以区分不同调控因子的功能：维持并扩展根瘤分生组织（CRE1和NF-YA1）、启动根瘤身份及其功能性（LSH1/2），以及促进新生根瘤组织/细胞的增殖（NOOT1/2和LBD16）。
根瘤发育过程中的激素信号
器官发生
生长素、细胞分裂素和赤霉素（GAs）正逐渐被认为是调控根瘤发育的关键因子¹˒²˒²³˒²⁴。因此，我们将控制这些激素或响应这些激素的相关组分纳入所选基因探针，并在野生型和突变体根瘤中进行检测（图7；图S13）。在野生型根瘤中，分生组织标记基因与激素信号基因共同构成连贯且逐步精细化的空间表达格局（图7；图S13）。在接种后4天（4 DPI），WOX5广泛标记原基，而PLT1的表达则局限于与维管组织相关的区域（图S13A）。至接种后14天（14 DPI），二者均集中于一个紧凑的分生组织内（图7A；图S13A–B）。生长素相关基因呈现互补的表达特异性：STY4广泛标记早期原基，并在分生组织和维管组织中持续富集；YUC8的表达则逐渐局限于与分生组织和维管组织相关的区域（图7A；图S13A–B）。细胞分裂素活化基因LOG1起初表达广泛，随后集中于分生组织和维管组织附近（图7A；图S13A–B）；而细胞分裂素响应基因RR4的表达则在间区更为显著（图7A；图S13A–B），这与其协调由侵染阶段向固氮阶段过渡的作用相符。赤霉素生物合成和响应基因沿与分区相一致的纵轴分布：GA3ox1和GA3ox2在侵染区富集，而GASA8和GASA22则标记未受侵染、与固氮相关的区域（图7A；图S13A–B）。总体而言，这些表达模式共同构成一个空间整合的分生组织—激素调控框架：生长素在分生组织区占主导，细胞分裂素在侵染区和间区占主导；至少就未受侵染的细胞而言，赤霉素在固氮区占主导。
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图 7.
协调的激素–分生组织程序崩解及 lsh1/lsh2 根瘤中基因共表达结构的重构
(A–B) 野生型 R108 在 14 DPI 时的根瘤（A）以及 lsh1/lsh2 在 28 DPI 时的根瘤（B）中，分生组织相关和激素相关转录本的空间可视化。基因按功能类别分组：发育调控转录因子（PLT1、WOX5、SCR1、SHR1）；生长素生物合成与调控（YUC8、STY4）、响应（Small Auxin Upregulated DNA、SAUR-like）及运输（PINOID-like、PID2）；细胞分裂素生物合成与响应（LOG1、RR4、RR2、CKX1）；赤霉素代谢与响应（GASA8、GASA22、GA3ox2、GA2ox15）；以及根瘤身份调控因子（LSH1、LSH2、NOOT1、NOOT2）。
(C) 以 LSH1 为中心的有符号基因共表达网络，展示调控结构在发育阶段和基因型依赖方面的变化。网络使用从野生型 R108 根瘤参考网络中选取的基因构建，并采用固定网络布局，以便直接比较不同条件。所示网络包括早期和晚期 R108 根瘤、R108 侧根，以及早期和晚期 lsh1/lsh2 根瘤。节点大小表示与 LSH1 相关性的绝对值，节点颜色表示 hdWGCNA 模块归属。红色和蓝色连线分别表示正向和负向基因间相关性，连线粗细与 Pearson 相关系数的绝对值成正比。配套的模块特征向量（ME）热图显示相应条件下各共表达模块在不同细胞簇中的平均表达量。列表示 hdWGCNA 模块，行表示细胞簇，其定义见图 3A。
(D) 展示 Pearson 相关性的热图。
LSH1与其在不同发育阶段、基因型和器官中关联度最高的基因之间的相关系数。所选基因集来自野生型 R108 根瘤参考网络，并与野生型和突变体根瘤（R108、lsh1/lsh2、nf-ya1 和 cre1）以及侧根进行比较。
(E) 根瘤发育过程中以 LSH1/2 为中心的网络动态模型。早期根瘤具有高度整合的调控网络；随着根瘤成熟，该网络逐渐分化为细胞类型特异性模块。LSH1/2 始终与这些模块保持连接，这与其协调多种发育程序的作用相符。在 lsh1/lsh2 突变体中，网络连通性在早期阶段降低，并在后期阶段大幅崩解，表明 LSH1/2 对建立并维持协调的细胞类型特异性调控网络至关重要。
另见图 S13。
如先前所述，cre1 突变体的成熟根瘤中缺乏分生组织，因此也缺少分生组织标记基因 WOX5、PLT1，以及与分生组织相关的 STY4 和 GA2ox15 的表达；但与生长素相关的维管表达模式仍然存在（图 S13C）。与赤霉素相关的基因失去了正常的区域化表达，表明依赖 CRE1 的细胞分裂素感知对于稳定分生组织身份至关重要，并可能协调下游激素的表达模式。相比之下，nf-ya1 根瘤保留了整体激素表达格局，但其表现有所减弱。根瘤顶端仍保留一个较小的分生组织区域，其特征是 WOX5 和 PLT1 的表达局限于该区域；与生长素相关的基因仍在维管组织中富集，而 RR4 则局限于固氮区附近的狭窄区域（图 S13D）。相比之下，lsh1/lsh2 突变体的激素调控程序完全崩解（
图 7A-B）中，lsh1/lsh2结瘤器官的激素分布未呈现连贯的模式。值得注意的是，尽管部分细胞中仍可检测到激素相关转录本，但其表达大多局限于维管组织和根样组织，未能形成野生型结瘤器官中观察到的连贯空间域（图 7A-B）。
综上，这些数据表明，结瘤器官发生与分生组织身份和激素信号之间精确的空间耦联相关。细胞分裂素感知或LSH1/LSH2受到扰动后，这些调控程序逐渐失去耦联，进而导致分生组织消失、激素梯度瓦解，以及结瘤器官身份和结构崩溃。
动态网络分析揭示结瘤器官发生过程中依赖LSH1/LSH2的发育调控程序协调
上述研究表明，LSH1/LSH2是决定结瘤器官身份和功能的关键组分。为探究LSH1如何参与结瘤器官发育，我们构建了以LSH1为中心的有符号基因共表达网络，并比较不同发育阶段、基因型及器官中的网络结构（图 7C-D，图 S12）。通过区分早期（4–7 DPI）和晚期（7–28 DPI）发育阶段，该分析框架得以直接比较结瘤器官成熟过程中的网络重构。
在野生型R108结瘤器官中，早期发育阶段的特征是形成高度互联的共表达网络，连接结瘤调控因子（LSHs、NOOTs、NIN、NF-YA1）、激素信号组分（STYs）、分生组织维持因子（WOX5、PLTs）及发育模式建成因子（SCR）（图 7C-D）。这些基因大多在同一模块中共表达，反映出早期结瘤器官发育过程中运行的整合调控程序。
器官发生过程中，随着根瘤成熟，这一整合网络逐渐分化为与特定细胞类型和发育区域相关的不同共表达模块（图 7C）。尽管网络的特异性不断增强，LSH1 仍与多个模块保持连接，这表明它可能在整个根瘤发育过程中协调多种发育程序（图 7C）。这一解释与 LSH1 广泛的周边表达模式相符：其表达分布于多个根瘤区域，包括分生组织、侵染区、皮层以及固氮区中的未受侵染细胞（图 7A）。
lsh1/lsh2 根瘤中的网络结构受到显著扰乱。在突变体发育早期，野生型根瘤中存在的许多共表达关系已减弱或消失；至发育后期，这些关系在突变体中大多丧失（图 7C-D）。然而，在突变体早期网络中，涉及 NIN、NF-YA、WOX5 和 PLT 基因的连接仍可检测到，这表明这些通路可能位于 LSH1/LSH2 上游、与其平行作用，或部分独立于 LSH1/LSH2（图 7C）。与此同时，野生型发育网络中的很大一部分在这些早期阶段就已遭到破坏，说明许多下游发育程序从根瘤器官发生之初便依赖 LSH1/LSH2 的活性。在野生型根瘤中观察到的广泛 LSH1 中心连接，在 lsh1/lsh2 根瘤和侧根中均不存在，尽管 PLT 和生长素相关子网络仍然保留。值得注意的是，lsh1/lsh2 突变体网络并不类似于侧根网络（图 7C），这表明 LSH1/LSH2 的缺失并未使发育状态逆转为侧根状态，而是扰乱了……
建立结瘤特异性调控程序。
对 A17 根瘤及结瘤突变体的分析进一步支持了这一解释。尽管 *nf-ya1* 和 *cre1* 突变体的 *LSH1* 相关网络结构发生了改变，但与 *lsh1/lsh2* 根瘤相比，它们保留了更多野生型网络连接。*nf-ya1* 突变体中，网络关系中与 *NF-YA1* 特异相连的部分受到部分扰乱，但整体网络结构大多得以保留；而 *cre1* 的网络重构更为轻微，部分连接减弱，另一些则增强，这表明细胞分裂素信号可能更多地发挥广泛调控反馈系统的作用。这些观察结果与上述突变体相对温和的发育表型相符，并支持 *LSH1/LSH2* 在维持协调的根瘤调控程序中发挥核心作用。
综合来看，这些分析支持一种模型：早期根瘤发育由整合的调控网络驱动，该网络在根瘤成熟过程中逐步分化为特化的细胞类型特异性程序（图 7E）。*LSH1/LSH2* 似乎充当网络协调因子，在根瘤的多个区域之间连接这些发育模块。缺失 *LSH1/LSH2* 后，网络组织逐渐瓦解，导致协调的细胞类型特异性调控程序丧失，进而无法建立形成成熟根瘤特征所需的转录架构。更广泛而言，这些发现凸显了空间转录组学如何揭示在不同发育区域中同时运行的调控程序，并阐明器官发生过程中高阶网络架构；而这些信息在很大程度上无法通过整体转录组分析获得。维持
这些空间共表达关系是决定根瘤身份、发育模式形成及器官功能的关键组成部分。
讨论
根瘤是植物界中特有的器官，能够形成一种特殊细胞，使其可以容纳固氮细菌，并为细菌固氮酶发挥作用提供适宜环境
41
。数十年来的研究已鉴定出调控根瘤起始和发育的遗传调控因子
2
，
42
，并揭示了根瘤与侧根共享的发育程序
1
。然而，根瘤身份如何建立、协调并维持，以及其基础性的侧根发育程序如何经过改造，进而形成根瘤特有的细胞类型和功能，仍是尚未解决的问题。通过整合空间组织与发育时间维度，我们构建的四维空间转录组图谱揭示，侧根相关程序保留在特定细胞类型中，尤其是与维管组织发育相关的细胞类型中。根瘤特有功能的形成似乎并非源于侧根身份向根瘤身份的线性转变，而是通过添加并行发育且持续维持的特化细胞程序实现。这些发现表明，结瘤的发育与演化需要叠加不同的发育轨迹，从而产生出比侧根更高的细胞复杂性。值得注意的是，根瘤身份的丧失并非简单地切换为侧根命运。相反，身份缺失的根瘤呈现出一种由初生根相关程序主导的嵌合器官转录状态，同时根瘤特异的调控模块化结构发生崩解，而非发生线性的命运转换。这些发现对根瘤……
其行为类似于经改造的侧根，受扰动后会发生侧根逆转。相反，我们的数据支持这样一种模型：结瘤细胞身份与侧根细胞身份是并行存在、并主动维持的发育状态，需要调控程序与激素程序在空间上协调。
既往研究通过整体转录组和单细胞研究加深了我们对根瘤发育的认识，鉴定出特定发育阶段中与结瘤相关的主要发育调控因子和细胞类型
23
,
26
,
28
,
43
,
44
。然而，基于解离的方法在样本制备过程中可能引入细胞和转录偏差
30
,
31
，且会不可避免地丢失空间背景
32
,
33
，也可能低估稀有、脆弱或嵌入组织结构中的细胞群
31
。因此，空间关系和谱系进程必须依据标记基因及转录相似性间接推断。在植物研究中，细胞类型注释通常依赖通过启动子报告实验、
原位
杂交鉴定的标记基因，或从模式物种迁移应用的直系同源标记。然而，启动子活性未必能反映内源性转录本的定位；即使在保守的直系同源基因中，基因复制和功能分化也可能改变其空间表达域
34
,
35
，从而使标记基因难以跨物种和发育背景迁移。空间转录组学通过直接测量完整组织中的转录本定位，为细胞类型注释和发育分析提供了具有空间锚定特征的框架。尽管 Xenium 分析的是靶向基因集而非完整转录组，但增加细胞及亚细胞分辨率的空间信息可提升】【。
细胞状态、发育组织及细胞间关系的表征，使得能够识别仅凭解离法难以分辨的空间差异性细胞群。
我们的四维空间图谱支持这样一种模型：共同的分生组织域产生三种协调的发育程序，即共生侵染相关程序、非共生皮层／未侵染程序，以及维管谱系程序（图1–6）。其中，只有维管谱系在转录层面仍与主根和侧根维管组织保持一致，这与结瘤过程中根维管发育模块被重新利用的观点相符（图3和图4）。相比之下，共生谱系和非共生谱系均为结瘤发育所特有；而侧根则保留了结瘤过程中未观察到的独特根尖和皮层程序。综上，这些发现表明，根瘤器官发生涉及共享根发育模块与根瘤特异性细胞身份的并行部署。
空间转录组学带来了新的发育分辨率和洞见，这些信息无法仅凭形态学观察或基于解离的转录组学方法推断。空间定位不再依赖根据观察到的结构推定器官身份，而是直接解析发育调控因子如何影响特定细胞类型的出现、组织和维持。功能扰动实验表明，根瘤身份依赖协调的调控输入。破坏这些调控因子会导致不同的发育缺陷：从在 *cre1* 中共生程序未能充分稳定，到在 *nf-ya1* 中发育停滞，再到在 *lsh1/lsh2* 中状态崩解并趋向与主根相关的状态。研究揭示，CRE1
与整体生长和结瘤分生组织的维持相关，尽管不同 cre1 结瘤之间存在显著的表型变异。同样，NF-YA1 的功能主要与感染区的发育以及分生组织区域的扩展相关。既往研究表明，nf-ya1 突变体的中央分生组织区域显著缩小^45，而维管组织基本局限于根瘤基部。由于 NF-YA1 的表达在原基区域和中央分生组织相关区域中较为富集，而在维管前体细胞中并不富集，因此 nf-ya1 中的维管组织缺陷可能反映了其对完整中央根瘤分生组织程序的间接依赖。
最显著的表型出现在 lsh1/lsh2 中。尽管根瘤菌诱导的结构仍然形成，但这些结构无法建立野生型根瘤所具有的协调性细胞组织以及与激素相关的模式化。既往研究已指出 LSH1/LSH2 参与根瘤身份的确定，而我们的空间分析进一步揭示了其在协调根瘤特异性发育程序方面作用的广泛程度。值得注意的是，LSH1/LSH2 的缺失并不会导致结构向侧根身份逆转。相反，lsh1/lsh2 结构主要由与初生根相关的细胞状态构成，这表明根瘤特异性身份的维持独立于侧根发育程序。这些发现支持这样一种模型：LSH1/LSH2 是建立和维持特化细胞身份所必需的，而这些细胞身份的发展与侧根发育轨迹并行，而非直接源自侧根发育轨迹。动态网络分析进一步表明，根瘤器官发生经历了由整合的早期发育程序向日益分区化的大小规律的转变。
成熟过程中具有细胞类型特异性的调控模块（图 7）。在这一框架下，LSH1/LSH2 似乎充当高阶协调因子，维持原本彼此独立的发育程序之间的连通性。在 lsh1/lsh2 突变体中，这种协调功能从发育早期便遭到破坏，并最终导致后期网络架构崩溃。NIN、NF-YA、WOX5 和 PLT 基因之间仍存在部分连接，这表明某些调控通路可能作用于 LSH1/LSH2 上游、与其平行，或独立于 LSH1/LSH2；而发育网络中的很大一部分则依赖 LSH1/LSH2 活性，才能在器官发生过程中得到恰当部署。考虑到 LSH1/LSH2 的主要功能，它们的表达主要与根瘤周边组织相关，这一点或许令人意外。由此我们推测，LSH1/LSH2 可能是诱导发育的形态发生素，能够在细胞间移动以确定发育进程。这类形态发生素可能包括完全依赖 LSH1/LSH2 的激素调控程序，也可能包括 SHR 等可移动蛋白质¹⁴⁶。
值得注意的是，即使是严重的类根突变器官，也不会获得典型的侧根转录程序，这表明其身份丧失反映的是向与主根相关的基础状态退化，而非向侧根命运的转分化。更广泛而言，这些发现表明，器官身份调控因子能够稳定发育状态；身份丧失可能延长前体样程序，而非直接将组织转变为其他器官命运。这一现象也见于拟南芥等其他发育系统⁴⁷˒⁴⁸。
我们的分析强调，细胞身份是
在发育过程中呈动态变化。标记基因的表现具有阶段依赖性和情境依赖性；当不同数据集的发育阶段不匹配时，标签转移的效果会下降。这些观察结果提醒我们，不应将标记基因视为普遍稳定的身份标识；它们还表明，单细胞数据集中推断出的许多“细胞类型”，可能实际上是受发育位置、发育时间和组织环境共同塑造的、具有空间和发育阶段限制的调控状态。随着高分辨率、高通量空间组学和单细胞技术的快速发展，未来的分析框架或可将细胞身份解释为动态调控状态，而非固定的类别标签。
根瘤整合了植物和细菌的发育程序。本研究的一项关键技术进展在于，我们证明，通过优化植物和根瘤菌转录本的探针设计，Xenium 能够在保留空间组织结构的同时，同步捕获宿主和细菌的基因表达。根瘤菌基因在间区、固氮区和衰老区呈现空间分辨的表达模式，这表明细菌的功能状态与宿主界定的发育区室相对应。与此一致，共表达分析鉴定出一个宿主—微生物共享模块，其中包含植物氧缓冲基因 MtLb1 和 MtLb2，以及细菌的氧响应型呼吸基因（fixK1 和 fixNOP）、固氮基因（nifA 和 nifHDK），还有参与二羧酸利用和三羧酸循环功能的中心碳代谢基因（gltA、dctA、mdh、pckA 和 dme）。这表明，宿主的氧缓冲作用影响的不仅是固氮酶活性，还涉及细菌更广泛的……
代谢程序。既往代谢建模表明，氧限制可制约三羧酸循环通量及 2-氧代戊二酸的生成，进而限制铵同化并促进氮向宿主输出
49
。gltA 与参与二羧酸摄取及中心碳代谢的基因协调表达，这与该模型一致，并提示 gltA 的富集可能反映了在低氧固氮区维持三羧酸循环碳通量的尝试。本文观察到的氧缓冲、呼吸作用、固氮及碳代谢相关基因的空间协同表达，凸显了双物种空间转录组学解析宿主—微生物整合生理程序的能力。
我们的空间转录组图谱提供了此前无法获得的亚细胞分辨率，使我们能够对转录特征不同的细胞状态进行功能解读。一个显著例子是固氮区内受感染与未受感染细胞群的分离。植物和根瘤菌的基因表达均表明，固氮主要发生于受感染细胞；而未受感染细胞则呈现出不同的转录程序，与其在氮同化和根瘤代谢中的专门功能相符（图 2）。这两类细胞群在标记基因和信号通路上的显著空间分隔，进一步支持其功能分化。这些发现表明，固氮区内未受感染的细胞并非仅仅是缺少细菌的细胞，而是一种特化细胞类型，有助于有效固氮器官的形成与维持。
总之，我们的空间分辨图谱揭示了若无……则无法获得的发育见解。
空间背景。我们证明，根瘤发育并非源自单一调控通路，而是由多个并行发育程序在不同空间区域内协同实施而形成。空间转录组学揭示了这些程序如何在器官发生早期整合，并在成熟过程中进一步划分为细胞类型特异性的模块。此外，我们发现，根瘤特异性细胞类型在根发育过程中显然没有对应类型；LSH1/LSH2 是这些发育程序的核心调控因子，在根瘤形成过程中为多种细胞类型发挥关键作用。与先前报道的 LSH 家族基因在芽发育中的作用一致（23、50、51），我们的研究结果凸显了共同发育调控因子如何在不同发育背景中被重新部署。解析这些并行调控状态的能力，为理解根瘤等复杂器官如何演化并获得独特身份提供了框架，也有助于解释其如何形成专门的细胞功能，包括容纳固氮细菌的能力。
研究局限性
Xenium 分析采用的是靶向基因面板，而非全转录组，因此分析受限于预先设定的基因，也可能无法检测到未预期的调控因子。此外，空间分辨率取决于细胞分割策略。尽管基于细胞壁的分割方法与以细胞核为锚点的分割方法能够得到一致的主要细胞状态，但在特定组织环境中，两种方法各有偏倚，尤其是在细胞密集的分生组织区域或高度液泡化的细胞中。未来，全转录组空间分析技术的进步、分割方法的改进，以及整合转录组学的多模态方法……
通过结合染色质可及性、蛋白质定位及代谢读数，将进一步提高空间调控网络的分辨率。遗传学研究依据发生突变的特定基因来推断功能。由于存在遗传冗余（本研究所考察的所有遗传调控因子均存在这种情况），我们可能过度简化了这些调控因子的功能。此类研究总可以增加时间点或突变体，但现有资源限制了我们全面开展研究的能力，因此我们尽力充分利用了可用资源。
资源可用性
主要联系人
如需了解更多信息或申请资源与数据，请联系主要联系人 Min-Yao Jhu（myj23{at}cam.ac.uk）；相关请求将由其处理。也可联系通讯作者 Giles E. D. Oldroyd（GOldroyd{at}danforthcenter.org）。
材料可用性
本研究未产生独特材料或试剂。所用材料均可通过商业渠道获取，或通过俄克拉荷马州立大学的蒺藜苜蓿 Tnt1 突变体数据库获取。
数据与代码可用性
原始数据和支持信息将在同行评审期刊正式发表之日起开放获取。同行评审期间，数据将实行受控访问。审稿人访问令牌可向通讯作者索取。
本研究生成的空间转录组学数据已存入美国国家生物技术信息中心基因表达综合数据库（NCBI GEO），并将自正式发表之日起公开。这些数据集包括原始成像数据、解码后的转录本坐标、处理后的基因表达矩阵、分割结果及相关元数据。
所有原始代码均已存入 GitHub。
用于……的 Linux Bash 脚本。
使用 Xenium Ranger 进行重新标注和重新分割的相关资源见：https://github.com/MinYaoJhu/Medicago_Xenium_relabeling_resegmentation。
基于细胞壁和 Cellpose 的细胞分割流程所用 Python 脚本见：https://github.com/thiagomaf/PYcellsegmentation。
用于 Xenium 数据分析和可视化的 R 脚本见：https://github.com/MinYaoJhu/Medicago_Rhizobia_Xenium_Analysis_Workflow。
用于重新分析已发表单细胞数据集的 R 脚本见：https://github.com/chongjing/scRNAseq_Medicago/。
用于探索 RDS 文件格式的处理后 Xenium 数据的交互式 Shiny 应用见：https://github.com/MinYaoJhu/MedicagoXeniumSpatialViewer。
如需重新分析本文报告的数据所需的任何其他信息，请联系首席联系人索取。
作者贡献
M.-Y.J.、G.E.O. 和 K.S. 构思了本研究。M.-Y.J. 和 C.L. 进行了样本采集和突变体基因分型。M.-Y.J. 和 J.H. 优化了实验方案，并制备了用于 Xenium 的 FFPE 样本和切片。M.-Y.J.、K.S.、G.E.O.、J.G.、T.A.M. 和 C.X. 参与了 Medicago 探针设计的基因筛选和生物学解读。P.P. 为根瘤菌基因筛选及探针设计提供了生物学专业知识和解读。M.-Y.J. 在 10x Genomics 的意见和支持下，设计了 Medicago 和根瘤菌 Xenium 探针面板。C.M.M. 在 D.B. 的指导下进行了 STPT 成像，D.B. 则完成了三维图像配准。M.-Y.J. 进行了 Xenium 预处理和空间转录组学分析。T.A.M. 和 M.-Y.J. 开发并应用了定制细胞分割方法。C.X. 和 M.-Y.J. 进行了单细胞数据重新分析和标签转移。K.S. 进行了根瘤菌感染
可视化。M.-Y.J. 在所有作者的意见基础上撰写了稿件。所有作者均审阅、修改并批准了最终版本。
利益声明
作者声明不存在任何竞争性利益。
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实验模型与研究参与者详细信息
植物材料
蒺藜苜蓿
本研究使用蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）生态型 A17 和 R108 作为野生型对照。所用突变株系根据其来源，具有 A17 或 R108 遗传背景。nf-ya1 和 cre1 突变体（A17 背景）由甲基磺酸乙酯（EMS）诱变获得，且此前已有报道^37,38。lsh1/lsh2 双突变体^23、noot1/noot2 突变体^39 和 lbd16 突变体^10（R108 背景）均为 Tnt1 逆转座子插入株系，来源于 Tnt1 逆转座子突变体资源库（美国俄克拉荷马州斯蒂尔沃特，俄克拉荷马州立大学）。
细菌菌株
本研究使用了两个苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）菌株 Sm2011。Sm2011–GFP 菌株组成型表达绿色荧光蛋白（GFP）标记，用于点接种实验，以便在收获组织前通过荧光解剖显微镜观察感染位点。这样可确认接种成功，并准确定位早期感染区域以采集样本。为获取成熟根瘤而设计的喷雾接种实验则使用 Sm2011–LacZ 菌株。LacZ 报告系统可最大限度降低背景荧光，避免干扰后续 Xenium 原位荧光检测。两种细菌菌株均按照下文所述，在 28 °C、200 rpm 振荡条件下培养，并在接种前稀释至目标光密度。
方法详述
蒺藜苜蓿种子的破皮与灭菌
为去除不透水的种皮，使用浓硫酸对蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）种子进行破皮处理。将约 100 粒种子置于 50 ml Falcon 离心管中，在通风橱内加入浓 H₂SO₄，直至种子完全浸没。种子在酸液中处理 4 min，每隔 30 s 轻轻摇匀一次。当种皮出现明显斑点时，小心移除酸液，并用冷的无菌蒸馏水冲洗种子 6 次，以彻底去除残留酸液。
破皮处理后，将种子置于冰上，并转移至层流洁净工作台中进行表面灭菌。将种子置于 0.75%（v/v）次氯酸钠溶液中，轻轻摇动处理 10 min，随后用无菌蒸馏水冲洗 6 次。将灭菌后的种子置于无菌水中，在室温下避光振荡 1 h，使其吸水。浸泡后，用铝箔包裹种子，并于 4 °C 下保存 3 天进行层积处理。
进行萌发时，将层积处理后的种子转移至铺有湿润滤纸的无菌培养皿中，用 Parafilm 封口，以铝箔包裹，并在 21 °C 下避光培养至少 24 h。通常培养 1–2 天后，种子会出现胚根，可转移至生长培养基或种子袋中进行后续实验。
重力刺激诱导侧根
通过重力刺激诱导蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）形成侧根，以实现原基发育的同步化。将萌发的幼苗垂直培养于添加磷（+P）但不含氮（−N）的缓冲结瘤培养基（BNM）平板上，在受控生长条件下（21 °C，光照/黑暗周期为 16 h/8 h）培养 2 天。2 天后
为促进垂直生长，将培养皿顺时针旋转 135°，并孵育过夜，以诱导主根发生向重力性弯曲。
对照幼苗在旋转时于根尖处做标记，但在整个实验过程中始终保持垂直。于旋转后第 1、2、3、4 和 5 天（DPR）采集根样品，用于固定和空间转录组分析。每个时间点仅切取主根的弯曲区域进行后续处理。使用体视显微镜检查采集的根段，以确认自旋转后第 2 天起存在侧根原基，从而确保准确获取发育中的原基，用于后续原位分析。
早期结瘤原基诱导的点接种
为捕获结瘤原基发育的早期阶段，将蒺藜苜蓿（*Medicago truncatula*）幼苗转移至不含氮（−N）、补充磷酸盐（+P）并添加 1 µM 氨基乙氧基乙烯基甘氨酸（AVG）的 BNM 培养基中，以抑制乙烯生物合成。幼苗在受控条件下（21 °C，16 h 光照/8 h 黑暗光周期）生长 2 天后进行接种。
接种使用苜蓿中华根瘤菌（*Sinorhizobium meliloti*）Sm2011 菌株。首先将细菌接种于胰蛋白胨–酵母提取物（TY）培养基中培养，随后在接种前 1 天转接至添加 3 μM 木犀草素的基本培养基中，以激活共生基因表达。菌液在 28 °C 下振荡培养约 16 h，直至 OD₆₀₀ 达到约 1.0；之后用新鲜的 Fahraeus（FP）培养基稀释，使最终 OD₆₀₀ = 0.025。
进行点接种时，使用移液器将 1 µl 稀释后的菌悬液小心地滴加至每株根的易感区，该区域定义为根毛开始出现的位置。⟦原文未完⟧
通过在接种点旁边的滤纸上打孔进行标记，以便准确追踪。接种后第1、2、3、4和7天（DPI）收获根段，用于组织学检查和空间转录组分析。
喷雾接种以促进成熟根瘤发育
为获得成熟根瘤，将蒺藜苜蓿（*Medicago truncatula*）幼苗置于优化条件下培养，以维持共生发育。首先将萌发的幼苗转移至BMM−N+P培养基平板上，于21 °C垂直培养3天。随后将幼苗转移至种子袋（CYG™ Grow Pouch，蓝色，Mega International）中；该种子袋不透光，可最大程度减少根部受光。
转移时，用无菌镊子轻轻撑开预先制备的袋纸切口，并小心插入每株幼苗，使胚根伸入湿润的袋内层，而下胚轴和子叶留在袋面上方。待所有幼苗转移完毕后，将两个种子袋正面对合并用胶带固定，以完全遮挡根系，同时使地上部保持光照。幼苗在袋中于21 °C继续培养3天，并以BMM−N+P液体培养基供液，以保持湿润。
苜蓿中华根瘤菌（*Sinorhizobium meliloti*）菌株Sm2011的接种准备流程为：先在TY培养基中进行初始培养，随后于接种前1天转接至添加3 mM木犀草素的TY培养基中培养，以激活细菌共生基因表达。菌液过夜培养（约16 h）至OD₆₀₀约为1.0，随后用新鲜BMM−N+P培养基稀释至最终OD₆₀₀ = 0.05。
进行喷雾接种时，打开每个种子袋的上部，将2–3 ml菌悬液均匀喷洒】【。
沿根表面使用装有鼻腔喷雾适配器的注射器进行接种。接种袋水平放置 1 h，以确保细菌均匀接触，随后置于竹制种子袋支架上恢复垂直放置。实验其余时间内，植株均维持在标准生长条件下。接种后第 14、21 和 28 天（DPI）收获根瘤，用于组织学和空间转录组分析。
Xenium 原位空间转录组样品制备
在预定发育阶段收获新鲜的蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）根瘤和根段，并制备为 FFPE 切片，用于 Xenium 原位分析。分步操作规程已发表^36。
简而言之，组织以新鲜配制的 4%（w/v）多聚甲醛和 0.25%（v/v）戊二醛（溶于 1× PBS，pH 约为 7.4）固定。样品浸没于固定液中，组织与固定液比例不低于 1:10；随后在冰上进行真空渗透（约 500 mm Hg，20 min，共 4 个循环），并于 4 °C 孵育过夜（12–16 h）。室温下依次经乙醇梯度脱水（10%、30%、50%、70%、90%；各 30 min），随后置于 100% 乙醇中 1 h（重复 3 次）。之后将样品转入新鲜的 100% 乙醇中，于 4 °C 放置过夜。
透明和浸润步骤采用梯度乙醇-Histo-Clear 混合液（3:1、1:1、1:3；各 1 h），随后以 100% Histo-Clear 处理 3 次（各 1 h）。将 Paraplast X-tra（熔融温度为 58–60 °C）以 1:3 的 Paraplast:Histo-Clear 比例加入，置于 60 °C 过夜；随后依次使用 1:2、1:1 和 3:1 的比例处理（各 3 h），再以 100% Paraplast 处理过夜，并在新鲜 Paraplast 中额外更换一次，继续处理过夜。将组织包埋于预热的模具中，调整方向以包含根瘤的中央区域（侵染区、过渡区和固氮区），并于 4 °C 保存。
使用旋转式切片机切取 5–10 µm 厚的切片。初始切片
将切片置于普通载玻片上，在光学显微镜下确认其方向及目标区域是否存在。收集用切片在 45 °C Milli-Q 水浴中短暂漂浮（5–10 s），随后贴附于 Xenium 载玻片（10x Genomics）上；确保切片位于捕获区域内，并在需要时为多个切片留出足够间距。载玻片在室温下风干 30 min，于 42 °C 烘烤 3 h，再于室温下干燥过夜。脱石蜡时，先将载玻片于 60 °C 烘烤 2 h，平衡至室温（约 10 min），随后依次置于二甲苯中处理（10 min × 2）、100% 乙醇中处理（3 min × 2）、96% 乙醇中处理（3 min × 2）、70% 乙醇中处理（3 min），最后置于无核酸酶水中处理（20 s）。
Xenium 化学反应所用定制探针面板按照制造商说明进行复溶和制备（10x Genomics，《Xenium 原位分析用户指南》）；运行前将相关 .json 文件上传至仪器。将锁式探针（含两个 20 nt RNA 结合臂）加热变性（95 °C，2 min），冰上冷却后与探针杂交缓冲液混合，按每孔 500 µL 加样，并置于预先平衡的热循环仪上使用 Xenium V1 程序孵育过夜。交联解除、杂交、连接、滚环扩增、自发荧光淬灭和 DAPI 染色均按照 Xenium FFPE 工作流程进行，并针对植物组织作了少量调整。
将载玻片装载至 Xenium 分析仪，并按照制造商说明制备和运行解码试剂（瓶 1–4 及模块 A/B）。利用细胞核和自发荧光通道选取涵盖完整根瘤横切面及匹配根组织的感兴趣区域。仪器通过迭代的杂交、成像和探针去除循环生成……
光学条形码并分配转录本身份。收集每个 ROI 的输出（解码后的转录本、图像和质控报告），用于下游分析。
运行完成后，去除淬灭剂（在亚硫酸氢钠溶液中处理 10 min，随后用水冲洗），即可选择进行 H&E 染色和成像，以获取组织学背景信息。适用于植物样本的 Xenium 原位工作流程详细方案已发表（Jhu et al., 2025）。
Xenium 后共聚焦成像
完成 Xenium 原位分析后，使用配备白光激光器和光谱检测功能的 Leica SP8 共聚焦显微镜对组织切片进行成像。为改善植物组织中的单细胞分割效果（植物细胞通常呈不规则多边形），利用细胞壁自发荧光界定细胞边界。首先进行 Lambda-Lambda 光谱扫描，以表征组织特异性自发荧光并确定最佳激发和发射设置。随后采用荧光寿命成像显微术（FLIM）采集荧光衰减曲线，从而根据寿命特征分离重叠信号。之后将得到的寿命参数用于 tau 门控和 tau 分离，以抑制背景自发荧光，并增强全切片图像中的细胞壁对比度。所得图像用于生成细胞边界掩膜，以进行空间转录组分割。
3D Xenium 样本制备及 H&E 成像数据采集
对 FFPE 组织块进行浅表修整，仅暴露组织的最外缘。随后以 10 μm 的间隔连续切片，直至组织几乎耗尽。将连续切片带（约 60 张）分成 4 条数量大致相等的切片带，并将每条切片带置于预先清洁的托盘上。切片
对切片进行计数，并按顺序保留切片带，以便持续追踪每个切片的编号。从完整连续切片组中取出三个切片：一个位于切片组起始处（第1张），一个位于中间（约第30张），另一个位于末尾（约第60张）。取片时，将切片带放在切割垫上，用剃刀片切下各个切片。将切片置于45 °C水浴上漂浮5–10秒，随后捞取并贴附到普通载玻片上，再用显微镜检查切片的朝向和质量。确认合格后，收集完整的连续切片组，并使用贴有第1张切片的普通载玻片，从第2张切片开始收集。起始部分的切片均收集到普通载玻片上，直至获得能够较充分代表结节的切片，约为第10张。从此处开始，将切片收集到普通载玻片上，同时以大致均匀的间隔切下单张切片并收集到Xenium载玻片上。每次准备收集一张Xenium切片时，都会先在显微镜下检查其紧邻的前一张切片的质量。还会在切割垫上目视检查候选Xenium切片；这些检查有助于从Xenium切片中选出质量最佳的切片，因为整个连续切片组的质量略有差异。共在两张载玻片上收集了8张Xenium切片，切片之间间隔4–6张。到达中间位置时，将切片收集到最初用于检查、且贴有中间位置切片的载玻片上，以便将该切片纳入连续切片组。最后约10张切片收集到普通载玻片上。
普通载玻片在60 °C下烘烤1小时，随后使用多功能染色仪进行苏木精-伊红（H&E）染色，再用明场扫描仪扫描。Xenium载玻片
风干 30 分钟后，在 42 °C 下烘烤 3 小时。随后将其储存在干燥器中，直至进行 Xenium 实验。
采用连续双光子断层成像进行三维表型分析
为制备 Medicago 根瘤样品以进行连续双光子断层成像（STPT），将样品包埋于以 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）配制的 8%（w/v）I 型琼脂糖（货号 A6013，Sigma）中。将琼脂糖溶液加热融化后倒入置于冰上的 2 cm³ 模具（Peel-A-Way 包埋模具，货号 E6032，Sigma）中。将根瘤按正确方向浸入熔融琼脂糖中，并静置至凝固。在通风橱内按照制造商说明配制 20 ml 1X 包埋聚合物试剂（Imbed 100S reagent，TissueVision，美国马萨诸塞州剑桥），随后脱气 30 分钟。琼脂糖块凝固后，将其置于包埋聚合物溶液中，于 4°C 下放置 72 小时，使聚合物渗透整个琼脂糖块。随后将其在 40°C 下烘烤 6 小时，以促进聚合物溶液交联。聚合后的琼脂糖块储存在含 0.01% 叠氮化钠的 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，于 4°C 保存，直至成像。
使用 TissueCyte® 1000 仪器进行连续双光子断层成像。该仪器是一种高速多光子显微镜，集成振动切片机，可对指定组织体积进行整体连续切片和块面成像（TissueVision，美国马萨诸塞州剑桥）。首先对组织表面采集一系列二维 XY 拼接图像（16 倍物镜；分辨率 500 nm/pixel），随后使用陶瓷刀片通过振动切片去除已成像组织，以形成新的表面供下一轮成像使用。62 在 z 平面上共采集 150 张、厚度为 15 µm 的切片。
以 0.1 mm/sec 的速度进行切片，频率为 70 Hz。每个厚度为 15 µm 的实体切片采集一个成像平面，激发波长为 900 nm（2 光束 Chameleon 2 光子飞秒激光器，Coherent Discovery），并配备中心波长分别为 450 nm、520 nm、630 nm 和 660 nm 的滤光片。使用下文及其他文献中所述的图像分析流程，对拼接后的 STPT 图像进行二维拼接和三维配准，以重建根瘤图像
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通过 β-半乳糖苷酶（X-Gal）染色观察根瘤菌侵染
为检测 β-半乳糖苷酶活性，首先将接种了表达 lacZ 报告基因（ProHemA:LACZ）的 Sm2011 根瘤菌的根组织用 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）冲洗，随后在真空渗透条件下用 2.5% 戊二醛固定 15 min，再于室温下孵育 1 h。固定后，样品用 Z 缓冲液（100 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.0；10 mM KCl；1 mM MgCl₂）洗涤三次。染色时，将样品置于以 Z 缓冲液配制的 X-Gal 溶液中；该溶液补充了 5 mM 铁氰化钾、5 mM 亚铁氰化钾和 5-溴-4-氯-3-吲哚基 β-D-半乳糖苷（蓝色 X-Gal，Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特）。样品于 28°C 孵育 6–12 h，使颜色充分显现，随后用水洗涤三次。染色后，根瘤和根组织经梯度乙醇脱水，并保存于 4°C 的 70% 乙醇中。进行整体成像时，将组织置于玻片上的 70% 乙醇中封片，并使用 Keyence VHX-5000 数码显微镜（Keyence Ltd.，英国米尔顿凯恩斯）观察，放大倍数为 20× 至 1000×。
定量与统计分析
Xenium 蒺藜苜蓿探针基因筛选与面板设计
靶向基因面板
用于 Xenium 原位空间转录组的基因旨在捕捉蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）根瘤器官发生、空间分区及细胞身份背后的调控架构。基因筛选依据已发表的单细胞和单核 RNA 测序数据集，并结合根瘤与侧根发育的时间序列整体 RNA 测序表达谱（包括 Schiessl 等、Roy 等、Pereira 等以及 Ye 等，2022），优先纳入与结瘤信号传导、激素响应通路、转录调控、分生组织功能、侵染过程和固氮相关的基因，以及参与侧根发育程序、与其共享或存在差异的基因。该策略确保了核心调控模块和器官特异性转录特征均得到覆盖。
候选基因经过一系列条件筛选，以兼顾生物学相关性、探针设计可行性和检测稳健性。为确保转录本具备基线可检测性，排除了在参考单细胞数据集中未检出的基因。探针设计可行性通过要求每个基因至少具有三个探针结合位点来保证；保守探针少于三个的基因将降低优先级，除非有针对生态型的探针设计作为支持。为实现生态型间的可比性，纳入了 A17 与 R108 基因组间的直系同源基因；缺乏可靠直系同源基因判定的基因则被赋予较低优先级。表达水平筛选旨在避免靶标信号过低或易发生饱和：对于在单细胞数据集中表达极低的基因，除非得到发育时间序列数据集中差异表达证据的支持，否则降低其优先级；而对于组成型表达极高的基因……
表达缺乏动态调控的基因也被降低优先级，以保留对时空变化的敏感性。在这些限制条件下，优先纳入已知或推测参与结瘤和器官发生的基因，以提高结果的可解释性。
本研究采用了两个 Xenium 基因面板：一个用于靶向优化的初始 50 基因面板，以及一个用于图谱规模分析的较大定制面板。用于分析的最终蒺藜苜蓿（*Medicago*）面板包含 405 个基因，其中 350 个来自最初设计的 380 基因定制面板，另有 55 个纳入自一个额外的 100 基因扩展面板。最终分析基因集的纳入遵循 10x Genomics 的重新标注流程，仅保留通过质量控制和注释一致性标准的基因，以确保探针设计与转录本身份之间的准确对应。未纳入最终分析基因集的基因不参与下游分析，但仍属于更广泛的面板设计范围，并将在后续工作中另行报告。
探针设计经过优化，以最大程度提高不同生态型中的转录本检测能力；为此，设计中既纳入靶向共有序列的保守探针，也在需要时纳入生态型特异性探针。对于每个
关键词：根瘤发育 · 空间转录组学 · 共生固氮 · 细胞命运 · LSH1/LSH2调控
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.23.733685v1?rss=1