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背景与目的 人类食管经历一套严格调控的发育程序，从发育早期的简单柱状上皮转变为成熟的复层鳞状组织，这对成年后的屏障功能至关重要。本研究构建了涵盖发育早期至成年期的发育细胞图谱，并据此建立了具有生理相关性的体外模型。方法 我们对发育早期至成年期的人类食管组织进行了单细胞RNA测序和空间多重蛋白质组学分析。我们建立了由饲养层支持的二维培养系统，以及采用无Matrigel悬浮培养、适用于96孔板的三维食管类器官模型。为探究WNT2B的功能，我们分析了携带WNT2B功能缺失突变的患者组织，并在食管类器官中进行WNT抑制实验。结果 测序分析鉴定出具有阶段特异性的上皮细胞群：多纤毛细胞和GPC3基底细胞仅见于发育早期；KRT14基底细胞和CRNN腔面细胞仅见于成年期；而COL17A1、LY6D和KRT4细胞群则见于多个发育阶段。研究还鉴定出具有空间组织特征的WNT2B、KIT和VWC2间充质亚型。二维培养系统以较高的转录保真度保留了上皮和间充质区室。食管类器官呈现基底层至腔面层的分层结构及间充质区室化，其形成依赖基质细胞相互作用。WNT2B抑制TP63基底祖细胞的自我更新并限制细胞增殖；在体外食管类器官中通过药理学抑制WNT，进一步证实了这一作用。结论 本研究提供了人类食管发育的阶段分辨细胞图谱，并建立了可扩展的食管类器官平台，可重现食管组织结构。WNT2B通过限制基底细胞自我更新调控祖细胞动态。食管样体为模拟食管发育和疾病提供了具有生理相关性的系统。视觉摘要O_FIG O_LINKSMALLFIG WIDTH=200 HEIGHT=139 SRC="FIGDIR/small/733451v1_ufig1.gif" ALT="图 1">查看大图（45K）：org.highwire.dtl.DTLVardef@16a36a5org.highwire.dtl.DTLVardef@29b56borg.highwire.dtl.DTLVardef@45b626org.highwire.dtl.DTLVardef@b98957_HPS_FORMAT_FIGEXP M_FIG C_FIG 主要发现及意义O_LI发育图谱：本研究构建了人类食管上皮全面的转录和结构图谱，鉴定出从早期发育到成年期保守且具有阶段特异性的上皮细胞群。值得注意的是，多纤毛细胞和GPC3基底细胞的阶段特异性基因表达仅见于早期发育阶段；KRT14基底细胞和CRNN腔面细胞则为成年期特异性细胞；COL17A1+（基底层）、LY6D+（基底上层）和KRT4+（中间层）细胞群则存在于所有阶段。C_LIO_LI间充质多样性：空间和转录组分析揭示了不同的间充质亚型，包括WNT2B、KIT和VWC2细胞群。这些细胞群具有空间组织特征，并参与上皮-间充质信号传导。这些发现进一步证实了基质-上皮相互作用在食管发育中的作用。C_LIO_LI二维食管细胞培养系统：本研究建立了一种由饲养层支持的二维细胞培养系统，该系统可保留上皮和间充质细胞群，维持转录特征的保真度，并支持长期扩增，从而用于机制研究。C_LIO_LI三维食管样体模型：本研究采用96孔板格式优化了一种基于悬浮培养的三维类器官系统，可实现食管样体的高通量生成，并形成稳健的上皮分层和间充质区室化。这些类器官重现了人类的关键特征。食管，包括基底层至腔面层的组织结构，且其形成需要基质相互作用。C_LI_WNT2B在食管发育中的功能作用：体内和体外分析均表明，WNT2B通过抑制位于基底部的TP63+细胞自我更新并抑制细胞增殖，调控上皮祖细胞动态和组织结构。功能缺失模型及对WNT通路的调节证实了WNT2B在上皮-间质相互作用和类器官完整性中的作用。C_LI
基于悬浮培养的人食管类器官重现 WNT2B 对食管基底祖细胞的调控 | bioRxiv
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基于悬浮培养的人食管类器官重现 WNT2B 对食管基底祖细胞的调控
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Noah Etzioni，Tristan Frum，Kelli Johnson，Andrea P. Álvarez-Maldonado，Helena M. Yllescas-Lopez，David E. Bayer，Zhiwei Xiao，Madeline K. Eiken，Claudia Loebel，Joshua H. Wu，Yu-Hwai Tsai，Angeline Wu，Charles J. Zhang，Michael K. Dame，Bhargav Gunuguntla，Ashley J Cuttitta，Hana Ho，Dominic J Tigani，Jonathan Sexton，Venkata S. Dasuri，Nicholas Makogonov，Amy E. O’Connell，Jason R. Spence，Daysha Ferrer Torres
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.06.23.733451
Noah Etzioni
1
科罗拉多大学安舒茨医学院医学系，胃肠病学与肝病学部，科罗拉多州奥罗拉
2
科罗拉多大学癌症中心安舒茨医学院 Katy O. 和 Paul M. Rady 食管与胃卓越中心，科罗拉多州奥罗拉
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Tristan Frum
3
密歇根大学医学院内科学系，胃肠病学与肝病学部，密歇根州安娜堡
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Kelli Johnson
3
密歇根大学医学院内科学系，胃肠病学与肝病学部，密歇根州安娜堡
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Andrea P. Álvarez-Maldonado
3
密歇根大学医学院内科学系胃肠病学与肝病学部，密歇根州安娜堡
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Helena M. Yllescas-Lopez
3
密歇根大学医学院内科学系胃肠病学与肝病学部，密歇根州安娜堡
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David E. Bayer
3
密歇根大学医学院内科学系胃肠病学与肝病学部，密歇根州安娜堡
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Zhiwei Xiao
3
密歇根大学医学院内科学系胃肠病学与肝病学部，密歇根州安娜堡
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Madeline K. Eiken
3
密歇根大学医学院内科学系胃肠病学与肝病学部，密歇根州安娜堡
9
密歇根大学材料科学与工程系，密歇根州安娜堡，美国
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Claudia Loebel
8
波士顿儿童医院新生儿医学部，马萨诸塞州波士顿
9
密歇根大学材料科学与工程系，密歇根州安娜堡，美国
10
宾夕法尼亚大学生物工程系，宾夕法尼亚州费城，美国
11
精准健康工程中心，宾夕法尼亚州费城，美国
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Joshua H. Wu
3
密歇根大学医学院内科学系胃肠病学与肝病学分部，密歇根州安娜堡
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Yu-Hwai Tsai
3
密歇根大学医学院内科学系胃肠病学与肝病学分部，密歇根州安娜堡
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Angeline Wu
3
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Charles J. Zhang
3
密歇根大学医学院内科学系胃肠病学与肝病学分部，密歇根州安娜堡
6
密歇根大学药学院药物化学系，密歇根州安娜堡
7
密歇根大学药物再利用中心，密歇根州安娜堡
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Michael K. Dame
3
密歇根大学医学院内科学系胃肠病学与肝病学分部，密歇根州安娜堡
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Bhargav Gunuguntla
3
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Ashley J Cuttitta
3
内科学系胃肠病学与肝病学分部，
密歇根大学医学院，密歇根州安娜堡
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Hana Ho
1
科罗拉多大学安舒茨医学园区医学院，胃肠病学与肝病学部，科罗拉多州奥罗拉
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Dominic J Tigani
3
密歇根大学医学院内科学系，胃肠病学与肝病学部，密歇根州安娜堡
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Jonathan Sexton
3
密歇根大学医学院内科学系，胃肠病学与肝病学部，密歇根州安娜堡
6
密歇根大学药学院药物化学系，密歇根州安娜堡
7
密歇根大学药物再利用中心，密歇根州安娜堡
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Venkata S. Dasuri
8
波士顿儿童医院新生儿医学部，马萨诸塞州波士顿
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Nicholas Makogonov
8
波士顿儿童医院新生儿医学部，马萨诸塞州波士顿
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Amy E. O’Connell
8
波士顿儿童医院新生儿医学部，马萨诸塞州波士顿
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Jason R. Spence
3
密歇根大学内科学系，胃肠病学与肝病学部，大学……
密歇根大学医学院，密歇根州安娜堡
4
密歇根大学医学院细胞与发育生物学系，密歇根州安娜堡
5
密歇根大学医学院细胞可塑性与器官设计中心，密歇根州安娜堡
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通信请联系：
daysha.ferrertorres{at}cuanschutz.edu
Daysha Ferrer Torres
1
科罗拉多大学安舒茨医学园区医学院内科学系胃肠病学与肝病学分部，科罗拉多州奥罗拉
2
科罗拉多大学癌症中心安舒茨医学园区 Katy O. 和 Paul M. Rady 食管与胃卓越中心，科罗拉多州奥罗拉
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daysha.ferrertorres{at}cuanschutz.edu
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摘要
背景与研究目的
人类食管经历一个受到严格调控的发育过程：从发育早期的简单柱状上皮，逐渐转变为成熟的复层鳞状组织，而后者对成人屏障功能至关重要。本研究构建了一个涵盖发育早期至成年期的发育细胞图谱，并利用该图谱建立了具有生理相关性的体外模型。
方法
我们对人类食管组织进行了单细胞 RNA 测序和空间多重蛋白质组学分析，样本涵盖发育早期至成年期。我们建立了饲养层支持的二维培养系统，以及一种无 Matrigel、基于悬浮培养并采用 96 孔板格式的三维食管类器官模型。为探究 WNT2B 的功能，我们分析了携带 WNT2B 功能缺失突变的患者组织，并在食管类器官中进行了 WNT 抑制实验。
结果
测序分析……
鉴定出具有阶段特异性的上皮细胞群：多纤毛细胞和 GPC3⁺ 基底细胞仅见于早期发育阶段；KRT14⁺ 基底细胞和 CRNN⁺ 腔面细胞仅见于成年阶段；COL17A1⁺、LY6D⁺ 和 KRT4⁺ 细胞群则在各阶段均有分布。研究还鉴定出空间分布有序的 WNT2B⁺、KIT⁺ 和 VWC2⁺ 间充质亚型。二维培养系统以较高的转录保真度保留了上皮和间充质区室。食管类器官呈现基底层至腔面层的分层结构及间充质区室化，其形成需要基质细胞相互作用。WNT2B 可抑制 TP63⁺ 基底祖细胞的自我更新并抑制细胞增殖；在体外培养的食管类器官中，通过药理学抑制 WNT 信号通路证实了这一作用。
结论
本研究构建了人类食管发育的阶段分辨图谱，并建立了可扩展的食管类器官平台，以重现食管组织结构。WNT2B 通过限制基底细胞的自我更新调控祖细胞动态。食管类器官为模拟食管发育与疾病提供了具有生理相关性的研究系统。
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主要发现与意义
发育图谱： 本研究构建了全面的人类食管上皮转录与结构图谱，鉴定出从早期发育至成年阶段保守存在及具有阶段特异性的上皮细胞群。值得注意的是，多纤毛细胞和 GPC3⁺ 基底细胞的阶段特异性基因表达仅见于早期发育阶段；KRT14⁺ 基底细胞和 CRNN⁺ 腔面细胞则仅见于成年阶段；COL17A1⁺（基底层）、LY6D⁺（基底上层）和 KRT4⁺（中层）细胞群在各阶段均有分布。
间充质多样性： 空间与转录组分析揭示了不同的间充质亚型，包括 WNT2B⁺、KIT⁺ 和 VWC2⁺ 细胞群；这些细胞群具有空间组织特征，且
参与上皮-间充质信号传导。这些发现进一步证实了基质-上皮相互作用在食管发育中的作用。
二维食管细胞培养系统： 建立了一种由饲养层支持的二维细胞培养系统，可同时保留上皮和间充质细胞群，维持转录特征的保真度，并支持长期扩增，为机制研究提供条件。
三维食管类器官模型： 优化了一种基于悬浮培养的三维类器官系统，采用96孔板格式，可高通量生成食管类器官，并形成稳健的上皮分层结构和间充质区室。这些类器官重现了人类食管的关键特征，包括从基底层到腔面的组织结构；其形成依赖基质相互作用。
WNT2B在食管发育中的功能作用： 体内和体外分析均表明，WNT2B通过抑制基底定位的TP63+细胞自我更新并抑制细胞增殖，调控上皮祖细胞动态变化和组织结构。功能缺失模型及WNT通路调节实验证实了WNT2B在上皮-间充质相互作用和类器官完整性中的作用。
引言
食管是一个动态器官，其发育过程复杂，最终形成复层鳞状上皮。这种上皮能够承受机械应力，并保护下方组织免受环境因素的损伤（Rosekrans, Baan et al. 2015，Zhang, Jiang et al. 2017，EŞRefoglu, Taslidere et al. 2018，Morrisey and Rustgi 2018）。食管发育受到上皮与间充质之间相互作用的严格调控；这些相互作用为细胞增殖、分化和组织结构形成提供关键信号（Goss, Tian et al. 2009，Rodriguez, Da Silva et al. 2010，Zhang, Yang
等（2018）。经典组织学研究表明，人类食管起源于前肠背侧，并在妊娠约第4至第6周与腹侧气管分离（Zhang, Bailey et al. 2021）。妊娠第8周时，食管内衬为假复层柱状上皮（DeNardi 1991）。至发育约5个月时，复层鳞状上皮首先出现在食管中段，随后逐渐向头端和尾端延伸，取代纤毛上皮（Johns 1952）。食管上皮由简单的增殖状态转变为完全复层化的组织，该组织由基底祖细胞、增殖中间细胞及分化的腔面细胞构成（Geboes 1978, Huff and Carreon 2019, Edwards, Shacham-Silverberg et al. 2021）。这一过程受到上皮—间充质相互作用的严格调控；这些相互作用为细胞增殖、分化及组织结构形成提供关键调控信号（Yang, McCullough et al. 2025）。我们对这些相互作用的认识大多来自小鼠食管研究（Zhang, Jiang et al. 2017, EŞRefoglu, Taslidere et al. 2018, Zhang, Bailey et al. 2021）；然而，不同物种的食管存在显著差异（Grommisch, Eenjes et al. 2025）。例如，成年小鼠食管上皮为厚度仅三至四层细胞的角化复层鳞状上皮（Rosekrans, Baan et al. 2015），而人类食管上皮厚达40层细胞，并具有显著的间质内陷结构，即乳头（Huff and Carreon 2019）；此外，人类食管还存在小鼠所缺乏的黏膜下腺（Long and Orlando, 1999）。
……方面的进展。
单细胞转录组学和空间分析已开始揭示胃肠道内的细胞异质性及发育轨迹（Madissoon, Wilbrey-Clark et al. 2019，He, Wang et al. 2020，Busslinger, Weusten et al. 2021，Chen, Zhao et al. 2021，Yu, Kilik et al. 2021，Ferrer-Torres, Wu et al. 2022，Rochman, Wen et al. 2022，Ding, Garber et al. 2024，Yang, McCullough et al. 2025）。近期研究着重于表征发育中的（Yu, Kilik et al. 2021，Yang, McCullough et al. 2025）和成年人的食管（Busslinger, Weusten et al. 2021，Ferrer-Torres, Wu et al. 2022，Rochman, Wen et al. 2022）。然而，迄今尚未对发育中的人类食管上皮与成熟的成人食管上皮进行比较。因此，为研究人类食管发育，我们利用了公开可用的单细胞 RNA 测序数据集，涵盖早期发育阶段和成人食管上皮（Yu, Kilik et al. 2021，Ferrer-Torres, Wu et al. 2022）。该分析鉴定出阶段特异性标志物和上皮亚型，为此前未知的人类食管发育至成年过程中的动态细胞组织结构及谱系转换提供了新见解。
单细胞和空间转录组学揭示了发育中人类食管间质细胞群体错综复杂的细胞结构。Yang 等人（2025）提出了一项时空多组学普查，鉴定出成纤维细胞祖细胞以及围绕上皮呈同心层状排列的间充质亚型。在此框架基础上，我们的研究进一步界定并表征了人类食管早期发育过程中的间充质细胞群体。
发育过程中，鉴定出具有不同空间定位特征的 WNT2B⁺、KIT⁺ 和 VWC2⁺ 间充质细胞群。
最后，类器官技术的进步使得研究人员能够利用人多能干细胞生成食管类器官，其研究重点主要集中于这些类器官的上皮组分（Trisno, Philo et al. 2018；Zhang, Yang et al. 2018；Yang, McCullough et al. 2025）。此外，多种利用人原代组织生成上皮类器官的方法，也推动了复杂上皮类器官模型的发展（Giroux, Lento et al. 2017；Kasagi, Chandramouleeswaran et al. 2018；Ferrer-Torres, Wu et al. 2022；Milne, Mustafa et al. 2024）。在此，我们基于既往开发的活检成人食管培养方法（Ferrer-Torres, Wu et al. 2022），建立了早期发育阶段人食管的长期二维共培养体系，使上皮和间充质细胞群均能在体外长期培养中得以保留。我们进一步开发了高通量、基于悬浮培养的三维食管样体平台，该平台同样能够维持上皮和间充质细胞群的多样性。利用这一体外食管样体模型系统，我们证明 WNT 信号通路在上皮祖细胞调控和组织结构形成中发挥关键作用；同时，我们将这些功能实验与 WNT2B 突变患者的食管及食管组织表征相结合，表明食管样体可用于模拟与人类疾病相关的表型。
本研究对人食管进行了表征，确立了新的间充质亚型，并建立了一种可扩展且具有生理相关性的食管样体模型。该模型具有间充质中心、上皮基底干细胞和分层上皮，可用于对上皮—间充质……
食管发育与疾病中的串扰。
结果
食管上皮的转录与结构动态：从早期发育到成年分化
我们的首要目标是全面描绘食管上皮在早期发育阶段和成年阶段的转录、结构及发育动态。我们利用公开的单细胞 RNA 测序数据，对早期发育阶段（Yu, Kilik 等，2021）与成年阶段（Ferrer-Torres, Wu 等，2022）进行比较（补充图 1A-D）。基于这些数据，我们能够识别并绘制食管中的上皮、间充质和免疫组分（补充图 1B），并通过 CDH1（上皮）和 VIM（间充质）标记突出显示上皮和间充质细胞群（补充图 1A、D）。我们的首要目标是评估并比较人类食管在早期发育阶段和成年阶段的上皮细胞类型（图 1，补充图 1E-F）。成年期和早期发育期食管上皮的 UMAP 嵌入图显示出不同的上皮细胞群（图 1A-B）。成年期上皮分为五种不同的细胞群，包括基底细胞、增殖细胞、基底上层细胞、中层细胞和腔面细胞（图 1A）；这与我们课题组此前的观察结果（Ferrer-Torres, Wu 等，2022）以及其他研究结果一致（Busslinger, Weusten 等，2021；Yu, Kilik 等，2021；Rochman, Wen 等，2022）。相比之下，早期发育期上皮还包括额外的过渡状态，包括两个增殖细胞簇、基底上层细胞、晚期细胞和多纤毛上皮细胞群（图 1B）。为对测序数据中鉴定出的早期人类食管细胞群进行空间定位并确认其上皮细胞身份，我们……
我们对关键谱系标志物进行了免疫荧光染色（图 1C）。我们观察到基底/上基底标志物 TP63 和上基底特异性标志物 LY6D 均呈强表达，同时还检测到标记中层分化上皮细胞的 KRT4。这些标志物此前已在成人食管中得到表征（Ferrer-Torres, Wu et al. 2022），表明其表达模式在不同发育阶段间具有保守性。值得注意的是，早期发育阶段的管腔上皮不表达 CRNN；该标志物存在于成人食管的终末分化管腔细胞中（图 1A–C），提示此时上皮尚处于较不成熟的状态。此外，我们检测到乙酰化微管蛋白（AcTB）的表达。AcTB 是纤毛细胞的标志物；纤毛细胞是一种特殊的上皮亚型，已知存在于食管早期发育过程中（Linda M. Ernst and Eduardo D. Ruchelli, Menard 1995, Yaron Daniely 2004）（图 1C），但在成人样本中未见表达（补充图 1G）。
标签转移分析揭示了发育轨迹，显示早期发育细胞簇与成人细胞簇相对应：早期发育的基底细胞簇和增殖细胞簇分别对应成人的基底细胞群和早期/上基底细胞群（图 1D）。对成人和早期发育阶段各上皮细胞簇中关键基因的分析，揭示了两者共有及各自特异表达的基因（图 1E）。这些图谱显示了 GPC3 和 CC10 等发育阶段特异性标志物，以及 COL17A1、KRT4、LY6D 和 HOPX 等共有标志物；后者在成年期仍持续表达（图 1D、E、F；补充图 1B）。值得注意的是，GPC3 被鉴定为早期发育阶段基底细胞特异性标志物，而已得到充分验证的基底细胞标志物 KRT14（Rosekrans, Baan et al. 2015）则仅在成人基底细胞中表达。
细胞（图 1F、G）。多纤毛细胞标志物仅见于早期发育阶段（图 1A、B、D、E；补充图 1G），而角化细胞标志物 CRNN 仅在成人食管腔面细胞中表达（图 1A、B、C）。从早期发育阶段到成年期的组织学分析显示，上皮逐渐形成分层结构，由早期发育阶段的简单结构转变为成人完全分化的多层上皮（补充图 1E、F）。
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补充图 1：人类早期发育期与成人食管的转录特征及组织学表征
（A）UMAP 图展示早期发育期食管细胞的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据（受孕后第 100 天［PCD］和第 117 天），显示上皮标志物 CDH1 和间充质标志物 VIM 的表达，并突出显示不同的上皮和间充质细胞群。
（B）点图展示上皮、间充质、骨骼肌、神经及免疫细胞群中关键标志物的标准化表达，揭示发育中人类食管的转录异质性。
（C–D）成人食管细胞的 UMAP 图及特征图，显示上皮标志物 CDH1 和间充质标志物 VIM 的表达。
（E）早期发育期与成人食管组织结构的示意图及组织学比较。苏木精-伊红（H&E）染色显示早期发育期与成人食管在上皮分层、间充质组织结构及黏膜肌层方面的差异。
（F）不同发育阶段（受孕后第 74 天、第 108 天和第 130 天）及成人（44 岁）的人类食管组织 H&E 染色。早期发育期的上皮经历
随时间发生渐进式分层与分化。比例尺：50 µm。
（G）对不同早期发育阶段（59–152 PCD）及成人食管进行 AcTβ（红色）和 DAPI（细胞核）免疫荧光染色，显示乙酰化微管蛋白在人体食管上皮中的动态分布。
（H）对 80 日早期发育阶段的食管组织进行 SCGB1A1（红色，左）和 HOPX（红色，右）免疫荧光染色，并结合 FOXJ1 荧光原位杂交（FISH）。比例尺：10 µm。
（I）早期发育阶段及成人食管上皮细胞群的示意图。早期发育特异性标志物（AcTβ⁺、CC10⁺、GPC3⁺）可区分腔面细胞、中间细胞和早期基底细胞；成人基底细胞表达 KRT14，腔面细胞表达 CRNN。共同标志物包括 HOPX、KRT4、LY6D、TP63 和 COL17A1。
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图 1.
成人与早期发育阶段人类食管上皮细胞类型的比较分析揭示共同标志物与区域特异性标志物
（A）成人食管上皮细胞群的 Louvain 聚类及 UMAP 可视化，显示不同的基底区和腔面区。
（B）早期发育阶段人类食管上皮细胞群的 Louvain 聚类及 UMAP 可视化，显示与成人食管相似及特有的细胞亚型。
（C）对早期发育阶段（受孕后 130 天，PCD）食管组织进行免疫荧光染色，显示 LY6D、TP63、KRT4、CRNN、AcTB、核标志物 DAPI 和上皮标志物 ECAD 的表达，证实存在基底、基底上层及腔面上皮细胞。
（D）标签转移分析：将成人上皮细胞群映射至早期发育阶段的上皮细胞群，以揭示发育关系及保守标志物。
（E）点图
不同成人及早期发育阶段食管上皮细胞簇中的关键基因表达模式，展示了共有标志物和细胞区域特异性标志物。
（F–H）
免疫荧光和荧光原位杂交分析证实了成人及早期发育阶段人类食管基底层和腔面上皮层中特异性标志物的空间分布及表达。
这些数据共同揭示了食管上皮中保守的组织结构及阶段特异性差异。我们验证了发育阶段特异性细胞群，例如基底细胞特异性标志物 GPC3、多纤毛细胞，以及成人特异性细胞群中的 CC10 阳性腔面细胞；后者表现为 KRT14 限于基底层表达，以及 CRNN 阳性的角化腔面细胞。值得注意的是，发育期和成人阶段的基底干细胞均表达 COL17A1，基底上层细胞均表达 LY6D，中晚期分化上皮细胞均表达 KRT4（补充图 1I）。这些发现共同展示了食管上皮在细胞、转录和结构层面的协同演变，并明确了伴随食管上皮成熟发生的细胞与分子转变。
食管发育过程中间充质细胞群的转录多样性与空间组织
接下来，我们希望表征食管不同部位中存在的间充质细胞群（补充图 1A-B、图 2）。遗憾的是，由于成人组织取自活检样本，本研究样本队列中的间充质细胞群数量极少（补充图 1C-D），因此未进行成人与发育期样本之间的比较（图 2）。为探究发育中食管内的间充质细胞类型并绘制其……
空间组织方面，我们首先对间充质细胞的 UMAP 嵌入进行分析，鉴定出不同亚型，包括增殖型间充质细胞、WNT2B⁺ 间充质细胞、APOE⁺ 间充质细胞、KCNN3⁺ 间充质细胞、NRXN1⁺ 间充质细胞、KIT⁺ 间充质细胞、平滑肌前体细胞和成熟平滑肌细胞（共 8 个簇）（图 2A）。这些细胞簇体现了间充质区室内部的异质性。
图 2B 展示了这些间充质亚型中关键基因表达情况的点图。值得注意的标志物包括在 WNT2B⁺ 间充质细胞中高表达的 PDGFRA、在多个细胞群中表达的 GDF10，以及可特异性标记 KIT⁺ 间充质细胞簇的 KIT（图 2B）。我们进一步关注各亚簇亚型中的高表达基因，例如 PDGFRA、GDF10、HGF、KIT、WNT2B、VWC2 和 TOP2A 的特征图。这些基因在 UMAP 中呈现独特的空间分布，界定了广泛及特定的间充质细胞簇；其中，WNT2B 和 HGF 特异性标记了对上皮-间充质串扰至关重要的间充质细胞群。
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图 2.
人类食管早期发育过程中间充质细胞群的全面表征
(A) 对早期发育的人类食管间充质细胞群进行 Louvain 聚类和 UMAP 分析，划分出不同的细胞亚型。
(B) 点图展示各鉴定出的间充质细胞群中差异表达程度最高的基因，突出显示关键分子标志物。
(C) UMAP 投影图展示代表性基因在间充质细胞簇中的表达模式。
(D–H) 免疫荧光与荧光原位杂交（FISH）相结合，验证关键基因的空间定位和表达情况。
早期发育食管间充质细胞群中的基因。
(I)
示意图总结了早期发育人类食管中间充质细胞亚型的基因表达谱及空间组织。
随后，我们利用荧光原位杂交（FISH）结合免疫荧光，对发育第54天和第80天组织切片中定义各细胞簇的代表性基因进行表征，并验证其空间分布和表达情况（图2D-H）。
PDGFRA、WNT2B、HGF和KIT与上皮标志物ECAD呈现共定位，表明这些基因位于发育中上皮附近、但不在上皮内。我们通过FISH验证了PDGFRA和VIM在所有间充质细胞群中均有表达（图2D-F），这与单细胞数据中的观察结果一致（图2C）。我们观察到，GDF10不仅在PDGFRA细胞群中共表达，也在一部分HGF细胞中共表达（PDGFRA+/GDF10+/HGF+）；不过，另有一部分GDF10阳性细胞不表达HGF（PDGFRA+/GDF10+/HGF−）（图2C-E）。至发育第80天，HGF似乎在一个界定更明确的间充质细胞群中表达（图2E-G）。我们还鉴定出以KIT、WNT2B和VWC2为标志的间充质细胞群（图2F、G、H）。VWC2特异性表达于最靠近上皮的间充质细胞群中（图2H），而KIT则表达于间充质最外层（图2F）。最后，PDGFRA与WNT2B的共染显示，二者标记的间充质区域既有重叠又不完全相同（图2H），进一步表明这些细胞在发育过程中具有空间异质性。
图2I示意总结了……中间充质细胞群的空间分布。
发育中的人食管。
总体而言，这些数据进一步支持食管发育过程中间充质具有空间组织特征这一观点，并凸显了不同研究中保守的基质-上皮相互作用（Yang, McCullough 等，2025）。这些发现突显了间充质异质性对食管上皮和食管平滑肌发育的重要作用，并为理解正常发育及疾病背景下的上皮-间充质相互作用提供了框架。
利用 3T3-J2 饲养细胞系统在二维体外扩增发育中的食管细胞
为在体外模拟食管发育，将人早期发育阶段的食管组织进行机械解离，并在一层 3T3-J2 细胞上以二维单层培养方式扩增（发育阶段分别为受孕后第 101、122 和 130 天，n=3）（图 3A）。代表性明场显微图像显示，上皮和间充质细胞克隆均成功建立并增殖；如第 1 代（P1）和第 3 代（P3）所示，随着传代进行，克隆的大小和密度逐渐增加（图 3B）。人细胞核（Hu-Nu）免疫荧光染色证实这些食管细胞来源于人（图 3C）。如 ECAD（CDH1；上皮标志物）和 VIM（间充质标志物）免疫染色所示，二维培养物中同时含有上皮细胞和间充质细胞，且两类细胞呈现明显的空间分隔（图 3D）。
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图 3.
人早期发育阶段食管上皮与间充质细胞群的长期共同扩增
体外
（A）体外共同扩增的样本制备流程示意图，包括使用手术刀进行机械解离，以及与 3T3-J2i 饲养细胞共培养。
细胞。
(B) 原代混合细胞（PMC）体外培养物在第1代（P1）和第3代（P3）的明场显微镜图像，显示细胞逐步扩增，并展示不同细胞形态随时间推移得以保留。
(C) 使用人类特异性核抗体（Hu-Nu）进行免疫荧光染色，以确认 PMC 体外培养物中存在人源细胞。
(D) 对 E-钙黏蛋白（ECAD）和波形蛋白（VIM）进行免疫染色，以区分体外培养的上皮细胞群和间充质细胞群。
(E) 流式细胞术定量分析多个样本（HT，n=2）及不同传代中的 ECAD⁺ 上皮细胞，显示共培养中上皮细胞群和非上皮细胞群均持续扩增。统计分析表明，这类细胞的比例随时间推移无显著差异（ns），亦无富集现象。
(F) COL17A1、KRT4、ECAD、TP63 和 DAPI 免疫荧光染色证实存在基底细胞及祖细胞上皮标志物。
(G) 标签转移分析将二维扩增细胞映射至体内上皮细胞簇，显示其保留了食管组织的关键上皮细胞特征。
(H) 关键基因（CDH1、COL17A1、TP63、KI67、KRT4、VIM、WNT2B、HGF、PDGFRA）的特征图展示了转录多样性，以及上皮细胞和间充质细胞的保留情况。
(I) 小提琴图展示了根据标签转移预测的细胞身份分组的谱系评分，包括基底上皮细胞、基底旁上皮细胞、腔面细胞、平滑肌祖细胞、平滑肌细胞和周细胞群。
(J) 二维扩增培养物细胞类型组成示意图总结。
对多个样本及不同传代进行的流式细胞术分析显示，ECAD⁺（上皮）细胞与 ECAD⁻（非上皮）细胞的比例相近，这两类细胞的数量无显著差异（图 3E），提示
该方法能够同时扩增上皮细胞群和间充质细胞群。免疫荧光染色证实存在多种关键上皮标志物，包括 COL17A1（基底细胞）、TP63（基底/基底上层细胞）、KRT4（中层腔面细胞）和 ECAD；这些标志物是体内基底上皮细胞和上皮祖细胞的特征（图 1C、图 3F）。我们取第 3 代细胞，将 150,000 个细胞接种于 6 孔板中，培养至第 14 天。为评估二维扩增培养物的转录特征保真度，我们进行了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。为验证体外系统在发育方面的相关性，我们进行了标签转移分析，将二维扩增细胞映射至体内早期发育阶段的食管细胞。结果显示，关键上皮细胞类型（二维体外组 n=4，体内组 n=5），包括基底细胞、基底上层细胞群和腔面细胞，在二维体外培养中得以保留（图 3G）。对于间充质细胞群，标签转移结果提示，周细胞、增殖性间充质细胞以及 APOE⁺ 间充质细胞簇得以维持（二维体外组 n=3，体内组 n=8）（图 3G）。CDH1、COL17A1、TP63、KI67、KRT4、VIM、WNT2B、HGF 和 PDGFRA 等基因的特征图证实，这些基因在二维细胞簇中呈现空间上不同的表达模式（图 3H）。我们通过小提琴图展示标签转移预测身份分组的谱系评分，以可视化标签转移的置信度；结果进一步证实存在不同的上皮细胞群，包括 COL17A1⁺ 基底细胞、基底上层细胞、增殖性细胞、KRT4⁺ 细胞和 HOPX⁺ 腔面细胞，以及平滑肌祖细胞、平滑肌细胞和周细胞（图 3I）。这些数据表明，体外培养未能维持间充质细胞的全部多样性；但部分细胞群得以维持并扩增。
间充质细胞群构成了首个包含间充质成分的组织来源长期人食管培养模型（Giroux, Lento et al. 2017；Kasagi, Chandramouleeswaran et al. 2018；Ferrer-Torres, Wu et al. 2022；Milne, Mustafa et al. 2024）。概述二维体外系统的示意图展示了细胞的空间组织：表达 COL17A1 的基底上皮细胞、表达 KI67 的增殖细胞，以及表达 PDGFRA 且低表达 WNT2B 的间充质细胞（图 3J）。
低黏附悬浮培养可形成具有生理相关性、呈现基质-上皮结构的食管样体
二维原代混合培养（PMC）扩增模型能够成功维持上皮和间充质细胞群中的细胞类型。然而，上皮似乎以被间充质包围的细胞集落形式维持，且上皮-间充质相互作用未能体现天然食管的空间复杂性和组织结构（图 3B-D）。随后，我们希望确定在三维模型中，上皮-间充质相互作用是否会自行形成有序结构。我们将细胞包埋于 Matrigel 中，或接种于低黏附悬浮培养板中（Brandenberg, Hoehnel et al. 2020）（补充图 2A）。对悬浮培养和基于 Matrigel 的培养体系进行明场成像发现，随着时间推移，悬浮培养形成的类器官体积更大、组织更有序，而基于 Matrigel 的培养则形成较小且结构较不规整的类器官（补充图 2B）。定量分析证实，在多个时间点，悬浮培养类器官的生长均显著优于 Matrigel 类器官（****p < 0.0001；补充图 3C）。苏木精-伊红（H&E）染色进一步凸显了……
悬浮类器官呈现出良好的结构组织，其中央间充质细胞群周围分布着分层清晰的上皮层；这一特征在基质胶类器官中不太明显（补充图 2D）。第 14 天的基质胶类器官 H&E 染色仅显示少量上皮细胞，其体积明显小于同期悬浮培养中观察到的完全分层上皮（补充图 2D）。ECAD（上皮标志物）和 VIM（间充质标志物）免疫荧光染色证实存在相互区分的上皮和间充质区室；与基质胶类器官相比，悬浮类器官呈现出更为显著的上皮—间充质组织结构（补充图 2D）。
悬浮类器官表达了完整谱系的上皮细胞类型，并形成了完整的分层上皮结构：COL17A1（基底祖细胞标志物）表达局限于靠近间充质细胞群的细胞，随后依次为上基底层标志物 LY6D，以及中层至腔面分化标志物 KRT4。有趣的是，悬浮类器官还表达腔面标志物 CRNN；在发育阶段匹配的体内样本中，这一分化标志物尚未出现（补充图 2E）。这表明悬浮培养的类器官发生了进一步分化。综上，我们将这一模型称为食管样类器官模型。该模型具有中央间充质核心，其周围环绕着上皮基底干细胞，并形成完全分层的上皮，可重现人类食管结构及上皮—间充质相互作用的关键特征。
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补充图 2：早期发育阶段食管来源的 3D 悬浮类器官的构建
细胞
（A）人类早期发育食管体外建模流程示意图。从早期发育食管组织中分离的细胞在 3T3-J2 饲养层上进行二维扩增，随后转入三维培养体系，包括悬浮培养或基质胶培养。
（B）悬浮培养和基质胶培养体系中第 0 天和第 14 天的类器官明场图像。悬浮培养的类器官呈现清晰的球形形态，而基质胶培养的类器官结构不规则，内部可见腔隙（洋红色箭头）。比例尺：第 0 天，500 µm；第 14 天，200 µm。
（C）对第 3、6、9、12、15 和 18 天三维类器官面积的定量分析显示，悬浮培养与基质胶培养体系中的生长存在显著差异。与基质胶培养的类器官相比，悬浮培养的类器官体积更大。数据以均值 ± SEM 表示；*p < 0.05，****p < 0.0001。
（D）第 14 天基质胶培养和悬浮培养类器官的明场（BF）、苏木精-伊红（H&E）及免疫荧光（IF）图像。H&E 染色显示，悬浮培养的类器官具有分层的上皮结构。针对 ECAD（上皮标志物）和 VIM（间充质标志物）的 IF 染色显示，悬浮培养类器官中存在上皮组织结构及间充质成分。比例尺：BF，500 µm；H&E，100 µm；IF，50 µm。
（E）第 14 天悬浮培养类器官的免疫荧光染色，检测上皮及基底层标志物，包括 COL17A1（基底层标志物）、KI67（增殖标志物）、LY6D（早期基底层标志物）、KRT4（基底上层标志物）和 CRNN（管腔标志物）。类器官呈现清晰的上皮分层，各标志物在空间上呈定位表达。比例尺：100 µm。
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补充图 3：
利用微孔优化类器官的尺寸与均一性
（A）明场】【。
以及在直径各异的微孔（500 µm、800 µm、1600 µm 和 5000 µm）中培养的人食管三维类器官的苏木精-伊红（H&E）染色图像。较小的微孔（500 µm 和 800 µm）形成均一、致密的类器官，而较大的微孔（1600 µm 和 5000 µm）则形成大小和形态各异的异质性类器官。比例尺：明场图像为 200 µm，H&E 图像为 50 µm。
（B）不同尺寸微孔中培养的类器官的免疫荧光染色。TP63（绿色，基底祖细胞标志物）、ECAD（蓝色，上皮标志物）和 COL17A1（红色，基底层标志物）显示出分层的上皮结构。较大的微孔中，上皮层完整性和细胞分布的变异性更高。比例尺：50 µm。
（C）不同尺寸微孔中类器官在第 1 天和第 7 天的面积定量结果。较小的微孔（500 µm 和 800 µm）形成的类器官显著更小且更均一；较大的微孔（1600 µm 和 5000 µm）则导致类器官变异性更大。数据以均值 ± SEM 表示，****p < 0.0001。
（D）不同直径微孔中每孔类器官数量的分布。较小的微孔（500 µm 和 800 µm）中每孔主要形成单个类器官，而较大的微孔中则常形成多个类器官，凸显了微孔尺寸对类器官均一性的影响。
鉴于悬浮培养可形成具有复杂上皮-间充质结构的食管类器官，我们希望确定能否利用工程化微孔实现类器官的大规模制备。我们使用直径不同（500 µm 至 800 µm）的工程化琼脂糖微孔，对类器官尺寸、均一性及每孔形成的类器官数量进行优化，并将结果与在……中形成的类器官进行比较。
96孔低黏附培养板。这些系统均可使细胞在不附着于表面的情况下形成三维类器官。在较小微孔（500 µm 和 800 µm）以及96孔板中培养的类器官，其大小和组织结构更加均一（补充图3C）；而较大的微孔（1600 µm）则形成了体积更大、异质性更高的类器官（补充图3A-C）。免疫荧光分析显示，所有系统均支持清晰的基底侧至腔面组织结构：TP63和COL17A1标记的基底祖细胞类型形成单层，环绕间充质核心（补充图3B）。对类器官大小进行纵向定量发现，较大微孔中的类器官显著大于较小微孔中的类器官，但大小变异也更大（补充图3C）。尽管如此，与微孔系统相比，96孔板始终平均每孔生成一个类器官，且类器官大小随时间变化更加均一（补充图C-D）。这些结果表明，较小的工程化微孔系统和96孔低黏附培养板均可稳定生成具有间充质和上皮结构的自组织食管类器官，并凸显了这些可扩展平台在健康和疾病背景下模拟具有生理相关性的上皮-基质相互作用方面的应用价值。
鉴于96孔低黏附培养板系统在均一性和细胞组织结构方面表现更佳，我们接下来重点表征该系统的细胞时序动态特征和可重复性。明场成像显示，类器官随时间稳定生长，大小在第6天至第14天之间显著增加（图4A）。免疫荧光染色显示， the
上皮和基质区室中均可见增殖性上皮细胞，KI67 标记了这些细胞；同时还存在表达 TP63 和 COL17A1 的基底祖细胞（图 4B、4C）。KRT4 等分化标志物证实了中间层至腔面层的形成，表明该模型重现了体内食管上皮的分层结构（图 4D）。在基质区室中，PDGFRA 的表达局限于 VIM⁺ 间充质细胞（图 4E），HGF 也同样仅见于间充质细胞群（图 4F）。相比之下，WNT2B 在上皮和间充质区室中均有表达，提示在该类器官模型中，这一标志物失去了区域特异性（图 4F）。
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图 4.
悬浮培养中人食管细胞的自组织与生长
（A）单细胞培养的明场显微图像显示，细胞至第 6 天自组织形成类器官样三维结构，至第 14 天持续生长且体积增大。类器官面积定量结果显示，第 6 天至第 14 天之间体积显著增加。
（B）第 14 天悬浮培养三维类器官的免疫荧光染色显示，上皮细胞群（E-钙黏蛋白［ECAD］⁺）与间充质细胞群（波形蛋白［VIM］⁺）在空间上自组织；两类细胞群中均检测到 KI67⁺ 增殖细胞。
（C）COL17A1 和 TP63 免疫荧光染色显示，上皮基底干细胞定位于间充质细胞群邻近区域。
（D）分化的 KRT4⁺ 上皮细胞主要分布于悬浮培养类器官的外侧区域。
（E–F）免疫荧光与荧光原位杂交（FISH）联合检测，显示了特定间充质标志物在……中的表达及空间分布。
悬浮类器官。
（G）3D类器官的示意性横截面图，标示了不同的区域和细胞类型，包括基底层、腔面层和间充质区室。
（H）将3D悬浮类器官细胞映射至体内细胞簇的标签转移分析，显示其保留了早期发育阶段食管组织的关键上皮和间充质身份。
（I）上皮和间充质细胞簇关键基因的UMAP图。
（J）比较不同预测细胞身份和条件（体内 vs. 体外）下基因表达评分水平的小提琴图，突出显示转录保真度和谱系构成。
（K）成人基底细胞（BC）和胎儿基底细胞中GPC3和KRT14的表达水平，并与2D和3D基底细胞进行比较。
为进一步验证细胞组成，我们对第3代、培养第14天的悬浮类器官进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。为确定各细胞簇的身份，我们进行了从3D体外样本到体内身份的标签转移分析。该分析鉴定出不同的上皮细胞群（体外n=4，体内n=5）和间充质细胞群（体外n=3，体内n=8），包括基底、增殖、腔面和基质细胞簇，其中含有周细胞和APOE+间充质细胞（图4H–I）。CDH1、COL17A1、TP63、KI67、PDGFRA和WNT2B等关键标志物的特征图证实了这些细胞群转录身份的分布（图4I）。最后，为评估3D悬浮培养食管类器官的转录保真度，我们比较了体内早期发育样本与体外类器官在各预测细胞身份中的基因表达谱。小提琴图显示，谱系标志物的表达具有高度一致性，包括基底、上基底和腔面上皮相关标志物
区室（图 4J）。值得注意的是，我们观察到体内存在的纤毛化腔面成分消失了（图 4J）。然而，如前所述，这些类器官中形成了 CRNN 阳性细胞层（补充图 2E）；这一表型见于成年组织，提示其在体外发生了更充分的成熟和鳞状分化。基于这一观察，我们检测了二维和三维培养体系中早期发育标志物 GPC3 和成年基底祖细胞标志物 KRT14 的表达水平（图 4K）。结果显示，两种培养体系中的 GPC3 表达均较低，而 KRT14 表达相对较高（图 4K）。这些发现表明，尽管早期发育阶段的人食管细胞能够在体外培养并扩增，但它们会发生成熟，无法维持早期发育特征（图 4K）。为确定三维体外体系中保留的间充质细胞群，我们分析了各间充质细胞簇的转录谱。小提琴图显示，三维培养物与许多体内间充质细胞簇具有较强的转录相似性，提示间充质细胞群得以保留；不过，与上皮细胞簇相比，这些间充质细胞群的特征似乎更为共有、区分度较低（图 3J）。综上，这些数据证实，悬浮培养的食管类器官保留了人食管的关键转录和结构特征。这表明，它们可作为具有生理相关性的模型，以可扩展、高通量的方式研究上皮-基质相互作用、细胞谱系动态及疾病建模。
上皮-基质相互作用是三维食管类器官形成和维持所必需的
随后，我们试图确定上皮-间充质相互作用是否……
对于食管样体的形成至关重要，因此我们使用荧光激活细胞分选（FACS），以 E-钙黏蛋白（ECAD）为标志物，从二维（2D）培养物中分离上皮组分和间充质组分（图 5A）。分选后，两类细胞群均成功重新接种，并在二维条件下扩增为纯培养物（图 5B）。ECAD 阳性细胞呈蜂窝状形态，并以紧密排列的细胞集落生长；而 ECAD 阴性基质细胞则呈细长形态，在培养物中分布稀疏（图 5B）。免疫荧光结果证实，ECAD 阳性培养物中 ECAD 表达强烈，而 ECAD 阴性培养物中未检测到 ECAD 表达（图 5C–D）。定量分析显示，两类细胞群的 ECAD 表达存在统计学显著差异（非配对 t 检验，p = 0.0014）。二维培养中的倍增时间分析表明，基质细胞的增殖速度快于上皮细胞：基质细胞的平均倍增时间为 2 天，而上皮细胞为 3 天（p < 0.001）（图 5E）。随后，我们评估了这些纯化细胞群在悬浮培养中形成三维（3D）结构的能力是否得以保留。ECAD 阳性细胞形成 3D 结构的速度显著快于其他条件，平均形成时间为 18.04 ± 0.75 小时（均值 ± 标准误），而 ECAD 阴性细胞、原代混合培养物（PMC）以及 1:1 ECAD 阳性/ECAD 阴性共培养物的形成时间分别为 42.93 ± 2.98 小时、43.57 ± 2.55 小时和 43.13 ± 2.27 小时（图 5F–G）。尽管形成迅速，ECAD 阳性 3D 结构至第 14 天时仍无法维持结构完整性（图 5H–I）。相比之下，ECAD 阴性培养物、PMC 及混合培养物均能随时间维持其 3D 结构（图 5H–I）。第 14 天类器官面积的定量分析显示，ECAD 阳性培养物的 马会天天爱彩票
与ECAD阴性、PMC及1:1混合培养相比，类器官的体积显著更小（图5I）。对第14天三维结构进行免疫荧光分析发现，ECAD阳性培养物中缺乏COL17A1阳性的上皮干细胞，而这类细胞对于上皮再生至关重要。VIM染色证实，ECAD阴性细胞具有基质细胞特征，不表达ECAD，而表达VIM。来自混合培养物的类器官（其中同时含有上皮细胞和非上皮细胞，来源于PMC或1:1混合培养）呈现出分层结构，包括基质细胞中心、上皮祖细胞以及分化的复层细胞（图5J）。综上，我们成功分离了人食管上皮和基质组分，并证明基质细胞是形成三维食管类器官所必需的。
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图5.
人食管来源培养物中上皮细胞群和基质细胞群的分离及功能评估。
（A）实验流程示意图：将原代人食管细胞进行二维扩增，通过荧光激活细胞分选（FACS）分选为ECAD⁺（上皮）和ECAD⁻（基质）细胞群，再进行二维扩增，并在三维悬浮条件下培养。
（B）二维扩增培养物的代表性相差图像。ECAD⁺细胞形成排列紧密、呈蜂窝状形态的细胞集落；ECAD⁻细胞则呈细长形态，细胞间有间隙。
（C–D）免疫荧光分析及ECAD表达定量证实，上皮细胞群与基质细胞群已成功分离（p = 0.008，非配对t检验）。
（E）二维培养中的倍增时间分析表明，基质细胞的增殖速度快于上皮细胞，平均倍增时间分别为2天和3天（p < 0.001）。
（F）延时成像
悬浮培养中类器官形成的成像。ECAD⁺细胞形成三维结构的速度显著快于ECAD⁻细胞、PMC或1:1混合培养组。
（G）不同条件下类器官形成时间的定量分析。ECAD⁺细胞形成类器官所需时间为18.04 ± 0.75小时，显著短于ECAD⁻细胞（42.93 ± 2.98小时）、PMC（43.57 ± 2.55小时）和1:1混合培养组（43.13 ± 2.27小时）（p < 0.001，Tukey HSD检验）。
（H）第14天类器官的代表性图像。ECAD⁺类器官出现结构塌陷，而ECAD⁻、PMC及混合培养组均保持了三维结构完整性。
（I）第14天类器官面积的定量分析。ECAD⁺类器官面积（102,842 ± 14,255 µm²）显著小于ECAD⁻类器官（194,289 ± 19,837 µm²）、PMC组（236,204 ± 19,420 µm²）和1:1混合培养组（286,909 ± 19,047 µm²）（F = 14.99，p < 0.0001，ANOVA；p < 0.01，Tukey HSD检验）。
（J）第14天类器官的ECAD、VIM、COL17A1和DAPI免疫荧光染色。ECAD⁺类器官缺乏COL17A1⁺上皮基底祖细胞；而含有基质细胞的类器官则呈现有序分层结构，包括基质细胞中心、上皮基底祖细胞和分化的复层细胞。
WNT2B信号调控食管上皮祖细胞动态
我们观察到，间充质在体外支持食管类器官的结构组织中发挥重要作用（图5H–J）。我们还发现，在二维和三维体外模型中均保留了表达WNT2B的间充质（图3H、图4I）。为进一步探究WNT2B在食管上皮发育中的作用，我们分析了WNT2B功能缺失（LOF）患者的原代组织样本，并利用三维悬浮培养类器官，在体外考察调节WNT信号的影响。组织学分析显示，WNT2B LOF组织表现出更薄的，
与对照组相比，WNT2B 功能缺失（LOF）组织的上皮结构紊乱、细胞密度降低，苏木精-伊红（H&E）和 Masson 三色染色（MTS）结果均显示了这一点（Figure 6A）。β-catenin、TP63 和 KI67 免疫荧光染色显示，WNT2B LOF 组织中增殖中的 TP63+ 祖细胞增多（Figure 6B、C）。增殖中的 TP63+ 祖细胞增加，提示 WNT2B 可抑制发育中基底祖细胞的自我更新。此外，与健康对照相比，WNT2B LOF 食管组织中的乳头显著增大（Figure 6B-C），提示 WNT 活性降低会改变上皮-基质组织结构，并促进乳头延伸。
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图 6.
WNT2B 在食管上皮生长与分层中的作用
（A）对照组和 WNT2B 功能缺失（LOF）模型食管组织的组织学分析。苏木精-伊红（H&E）和 Masson 三色染色（MTS）显示，与对照组相比，WNT2B LOF 组织的上皮厚度降低，结构紊乱。
（B）β-catenin（红色）、TP63（绿色，基底祖细胞标志物）、KI67（白色，增殖标志物）和 DAPI（蓝色，细胞核）的免疫荧光染色显示，与对照组相比，WNT2B LOF 组织中的基底祖细胞和增殖细胞增多。比例尺：50 µm。
（C）对照组和 WNT2B LOF 组织中 TP63+ 和 KI67+ 细胞、DAPI+ 细胞核数量及上皮乳头大小（mm）的定量分析。柱状图显示，WNT2B LOF 组织中的 TP63+ 和 KI67+ 细胞数量显著增加，乳头数量也更多。数据以均值 ± SEM 表示；*p < 0.05，**p < 0.01。
（D）3D 食管类器官接受 WNTi-2b 处理 14 天的实验流程示意图，包括细胞接种、药物处理和终点分析。
（
E）对照组、HYENA处理组和WNTi处理组食管类器官的H&E染色切片，显示上皮分层结构的差异。
（F）第6天和第14天类器官总尺寸的定量分析。在两个时间点，WNTi处理组类器官均显著大于对照组和HYENA处理组。数据以均值 ± SEM表示；**p < 0.0001，p < 0.01，*p < 0.05。
（G）不同处理条件下Ki67和TP63表达的mRNA定量分析。
（H）第14天3D类器官的免疫荧光染色：KI67（红色）、TP63（绿色）、ECAD（青色，上皮标志物）和DAPI（细胞核）。比例尺：50 µm。
（I）对照组、HYENA处理组和WNTi处理组3D类器官中KI67阳性细胞和TP63阳性细胞的定量分析。WNTi处理显著提高了KI67阳性和TP63阳性细胞的比例。数据以均值 ± SEM表示；**p < 0.0001，p < 0.01，*p < 0.05。
随后，我们试图探究食管类器官模型是否可用于体外研究WNT信号通路，以及调节WNT信号是否会模拟体内WNT2B功能缺失表型（图6D）。鉴于二维培养使用含有GSK3β拮抗剂CHIR99021的对照培养基（见方法），我们在三维食管类器官中开展实验，分别使用对照培养基、不含CHIR99021的培养基以及WNT抑制剂（WNTi，IWR-1）处理（图6D）。在三维悬浮培养的类器官中，明场成像显示对照条件下类器官生长旺盛；而去除CHIR99021或抑制WNT信号后，类器官体积进一步增大，且差异具有统计学意义（图6E–F）。尽管类器官体积增大，H&E染色显示，WNTi处理的类器官形成了较薄且组织结构较差的上皮层，类似于体内观察到的WNT2B功能缺失表型（】【。
图6A、E）。为评估WNT抑制是否影响祖细胞动态，我们在转录和蛋白水平检测了KI67和TP63的表达。qPCR分析显示，与对照组及撤除CHIR99021组相比，WNTi处理类器官中的KI67和TP63 mRNA表达显著上调（图6G）。KI67和TP63免疫荧光染色结果进一步证实了这一发现，显示WNT抑制使增殖性祖细胞群和基底祖细胞群扩增（图6H、I）。这些结果表明，WNT通过抑制祖细胞增殖并限制TP63表达，在食管上皮生长过程中发挥关键作用。体内和体外模型均凸显了WNT信号通路在食管发育过程中维持上皮稳态与结构完整性的重要性。
重要的是，这些结果也强调了食管类器官模型的生理相关性，该模型成功模拟了健康与患病食管组织的关键特征。该模型能够重现WNT2B功能缺失表型，包括WNT抑制导致上皮结构紊乱，并引起增殖细胞和基底（TP63⁺）祖细胞增加，这凸显了其在研究上皮—基质相互作用以及模拟食管发育障碍和疾病状态方面的应用价值。
讨论
理解调控食管发育的细胞与分子机制，对于推进再生策略和疾病建模至关重要。本研究提出了一种多平台研究方法，整合转录组分析、空间定位和体外建模，以解析人类食管从早期发育至……的上皮与间充质动态变化。
成年期。我们对早期发育期与成年期食管上皮的比较分析发现，除保守的谱系标志物外，还存在阶段特异性细胞群：早期发育期包括多纤毛细胞和GPC3⁺基底祖细胞，成年期则包括KRT14⁺基底细胞和CRNN⁺角化腔面细胞。这些发现与既往研究一致（Yu, Kilik et al. 2021；Ferrer-Torres, Wu et al. 2022），并为上皮成熟过程提供了更精细的图谱，揭示了在成年组织数据集中常被低估的过渡状态和谱系轨迹。值得注意的是，我们发现了物种特异性差异：KRT14在小鼠胚胎上皮早期即有表达（Yu, Slack et al. 2005），而我们发现其在人类早期发育阶段缺失。相反，GPC3标记人类早期基底祖细胞，而KRT14仅见于成年基底细胞。这一区别使GPC3和KRT14可作为阶段特异性标志物，用于评估人类食管发育过程中的基底祖细胞状态。在小鼠中，KRT14约从胚胎第15.5天（E15.5）开始表达，并在单层立方上皮向复层鳞状上皮转变期间（E15.5–E17.5）显著表达（Yu, Slack et al. 2005），标志着基底细胞层的建立。相比之下，我们的数据表明，人类食管发育遵循不同的轨迹：GPC3⁺基底祖细胞先于KRT14⁺细胞出现，这进一步凸显了人类特异性研究对于理解上皮谱系定化的重要性。最后，COL17A1（基底层）、LY6D（基底上层）和KRT4（中层至腔面层）在早期发育期和成年期均呈保守表达，为区分沿着……的空间定位和细胞身份提供了一组可靠的标志物。
食管上皮中从基底干细胞到完全分化细胞类型的分化轨迹。尽管多数关于基底态与分化态的研究主要聚焦于 TP63 和 KRT4（Mou, Vinarsky et al. 2016；Yamamoto, Wang et al. 2016；Kasagi, Chandramouleeswaran et al. 2018；Trisno, Philo et al. 2018；Zhang, Yang et al. 2018；Ferrer-Torres, Wu et al. 2022），我们的分析发现，在基底区与 KRT4 表达起始阶段之间存在一个中间亚群；该亚群在成年样本（Ferrer-Torres, Wu et al. 2022）和早期发育样本（图 1）中均呈 LY6D 阳性。基底祖细胞层中不表达 LY6D，但细胞离开该区室后开始表达 LY6D，且早于 KRT4 的表达。因此，LY6D 可作为祖细胞脱离基底态、进入腔面分化初始阶段的早期标志物。这组经过精细界定的标志物有助于更准确地描绘食管上皮发育与成熟过程中的谱系轨迹和过渡状态。
我们还对发育中食管的间充质区室进行了表征，鉴定出在转录特征和空间分布上各异的亚型，包括 WNT2B⁺、KIT⁺ 和 VWC2⁺ 间充质细胞。这些细胞群与上皮之间呈现明确的空间关系。值得注意的是，这些发现与 Yang et al. 2025 提出的多组学细胞图谱相符；该研究鉴定出早期成纤维细胞祖细胞（Fib_PG）、已分化的成纤维细胞亚型（Fib_1–5）、肌成纤维细胞（MFs）、Fib_ICC 以及平滑肌（SM）细胞。值得注意的是，表达 SFRP2 等 WNT 拮抗因子的 Fib_1 和 MFs 被发现与上皮空间相邻，并对基底细胞（BC）的命运指定至关重要（Yang, McCullough et al. 2025）。我们的
WNT2B⁺和KIT⁺间充质细胞的鉴定与Fib_ICC的基因表达谱相吻合，并支持这样一种模型：间充质亚型通过提供局部、阶段特异性的信号，调控上皮生长与分层。此外，我们观察到VWC2⁺间充质细胞紧邻上皮，这与其将Fib_1空间定位为邻近基底膜的信号枢纽相呼应。我们的研究结果补充并验证了Yang等人（2025）的多组学细胞图谱，进一步支持了这一观点：空间组织化的基质信号枢纽可调控基底细胞命运决定和上皮分层。
为在体外模拟这些相互作用，我们利用3T3-J2饲养层建立了二维扩增系统（Liu, Krawczyk等，2017；Ferrer-Torres, Wu等，2022），该系统保留了关键的上皮和间充质细胞群，其转录特征与体内对应细胞高度一致。尽管该系统可用于细胞扩增与表征，但未能重现食管的空间组织结构。为此，我们建立了基于悬浮培养的三维食管样体模型（Brandenberg, Hoehnel等，2020），该模型能够自组织形成具有生理相关性的结构。与既往系统不同（Andl, Mizushima等，2003；Kalabis, Wong等，2012；Giroux, Lento等，2017；Kasagi, Chandramouleeswaran等，2018；Busslinger, Weusten等，2021；Ferrer-Torres, Wu等，2022；Yang, McCullough等，2025），这一平台可自组织形成具有生理相关性的结构：中央为间充质核心，外围为复层上皮，从而重现体内组织结构的关键特征。该模型支持稳健的上皮分化，并捕捉到四种主要的轨迹细胞状态：COL17A1阳性基底细胞，
LY6D 阳性上基底细胞、KRT4 阳性中层至腔面细胞以及 CRNN 阳性角化细胞的出现，表明与匹配的发育阶段相比，其成熟程度有所提高。重要的是，食管样体保留了不同的基质细胞群，包括周细胞和平滑肌细胞，并在上皮和间充质谱系中表现出转录特征的高度保真。这种复杂性使研究者能够在模拟人体生理环境的背景下，对上皮–基质相互作用进行功能性研究。此外，食管样体的取向使其能够模拟具有临床相关性的损伤因素（如反流暴露），且其方式与人体食管面向腔面的结构相似；这是其他类器官系统所不具备的优势（Giroux, Lento et al. 2017；Kasagi, Chandramouleeswaran et al. 2018；Busslinger, Weusten et al. 2021；Nakagawa, Sato et al. 2025）。最后，该平台具有良好的可扩展性和可重复性，支持对生长和组织结构进行高通量定量分析，因此可用于机制研究、药物筛选和疾病建模，并克服其他系统在可扩展性方面面临的挑战（Lampart, Iber et al. 2023）。
对上皮–基质相互作用进行功能性研究发现，仅有纯化的上皮细胞不足以维持类器官的完整性，凸显了基质支持对于维持上皮祖细胞群体的关键作用。WNT2B 功能缺失研究进一步证实了这种依赖性：无论在体内还是体外，WNT2B 功能缺失均会导致上皮结构紊乱，并使基底祖细胞增殖增加。这些发现与 Yang 等人（2025）的报告一致；他们指出，早期基底细胞的定向分化需要抑制 WNT 信号（通过 IWP2 实现），以便从……时时彩官网
hPSC中，WNT激活则有助于后期自我更新，这凸显了时序性调控WNT信号在平衡祖细胞扩增与上皮成熟中的重要性（Yang, McCullough et al. 2025）。我们对悬浮类器官中的WNT信号进行调节，重现了这些表型，证实食管样类器官模型可用于研究与疾病相关的信号通路。这些观察结果可置于食管WNT生物学的更广阔背景中加以理解：与其在其他成年上皮中的作用已得到明确界定相比，经典WNT信号在食管中的作用长期以来研究不足（Clevers, Loh et al. 2014）。在人类食管早期发育过程中，必须抑制WNT，才能从前肠背侧指定食管祖细胞（Kelley S. Harris-Johnsona 2009, Woo, Miletich et al. 2011, Trisno, Philo et al. 2018）。在成年小鼠食管中，经典WNT靶基因的表达仍维持在较低水平（Grommisch, Wang et al. 2024），这提示持续抑制而非激活上皮WNT信号，是组织稳态的特征。与此一致，成年食管组织中经典WNT通路基因的上皮体细胞突变并不常见（Lin, Hao et al. 2014, Song, Li et al. 2014, Cancer Genome Atlas Research, Analysis Working Group: Asan et al. 2017, Martincorena I 2018）。综上，这些数据支持一种模型：WNT信号在食管生物学中的作用取决于具体情境；谱系指定需要在早期抑制WNT，基底祖细胞调控需要局部间充质WNT2B信号输入，而成年组织稳态则需要全面抑制WNT信号。
尽管本研究为理解食管发育及上皮—基质相互作用提供了有价值的见解，但仍存在若干局限，有待……
需要指出的是，首先，我们的三维食管样体系统缺乏免疫组分，而免疫组分日益被认为是上皮稳态、伤口愈合及基质重塑的关键调节因素。缺少先天性和适应性免疫细胞，限制了该模型的生理相关性，尤其是在研究炎症性或免疫介导的食管疾病时。将免疫细胞纳入共培养系统，或整合器官芯片平台，有望提升未来模型的复杂性及转化潜力。其次，尽管我们证实 WNT2B 信号在调控基底祖细胞扩增和上皮结构方面发挥关键作用，其下游分子机制仍不清楚。鉴定 WNT2B 下游的转录靶点和信号级联（例如其与经典 WNT/β-catenin 信号、非经典通路的相互作用，或与 BMP、TGFβ 和 Hedgehog 信号的串扰），对于理解间质信号如何影响上皮命运决定至关重要。第三，我们的类器官系统未能完全保留其来源组织的发育阶段。其依据是：来源于早期发育组织的类器官中开始表达 CRNN，而 CRNN 是终末分化的成年腔面细胞标志物，在此类组织中通常不表达。这表明，体外环境可能加速或改变成熟轨迹，从而可能绕过中间发育状态。尽管这可能有利于构建类似成年组织的模型，但也凸显了在需要时优化培养条件、保持发育保真度的必要性。最后，需要指出的是，用于体外建模的早期发育阶段样本采集于……形成之前。
黏膜下腺。因此，目前尚不清楚该模型能否支持这一重要人类细胞群的扩增或维持。
总体而言，我们的研究建立了一个用于模拟人类食管发育与疾病的稳健框架。单细胞转录组学、空间 RNA 与蛋白质分析以及可规模化的类器官技术相结合，为研究上皮-基质相互作用、测试再生策略，以及探索先天性和后天性食管疾病的分子基础提供了强大平台。
结论
总之，本研究对人类食管发育进行了比较分析，并构建了结构图谱，为调控上皮与间充质相互作用的细胞和分子机制提供了新的见解。我们建立了一种长期扩增方法，可在体外同时保留上皮和间充质细胞群，从而能够对食管细胞动态开展长期研究。此外，我们开发了一种高通量 96 孔悬浮培养系统，促进具有生理相关性的食管类器官形成，并在体外忠实再现人类食管的结构与细胞复杂性。我们的研究结果还表明，WNT2B 在体内和体外器官形成过程中的上皮-间充质串扰中发挥关键作用，凸显了其作为食管发育关键调控因子的潜力。这些进展不仅加深了我们对食管生物学的理解，也为疾病建模、组织再生和治疗干预奠定了坚实基础。
关键方法
实验模型与研究参与者详情
人胎儿组织及人类……使用的伦理声明
研究对象
本研究采用的人类胎儿食管组织均通过伦理审查批准的方案获取，并严格遵守联邦、州及机构关于人类胎儿组织用于研究的相关规定。所有组织样本均由已建立的组织库依据机构审查委员会（IRB）批准的方案（IRB #380）提供，且在组织采集前均已取得捐献者的知情同意。仅在捐献者自主决定同意后方取得组织捐赠同意，且未向捐献者提供任何经济奖励。
华盛顿大学出生缺陷研究实验室（BDRL）协助获取组织，并确保仅采集临床诊疗不需要的组织。所有个人身份信息均已移除，样本均采用编码方式处理，以保护捐献者匿名性。此外，本研究获得了美国国立儿童健康与人类发展研究所颁发的保密证明，以进一步保护捐献者隐私。
本研究方案及人类胎儿组织的使用均经科罗拉多大学安舒茨医学院科学伦理委员会审查批准，确保所有程序符合最高标准的伦理与科学规范。本研究旨在利用胎儿组织来源的类器官模拟人类早期食管发育，从而增进对先天性食管疾病的认识。本研究遵循的伦理框架强调透明度、问责制及对人的尊严的尊重。
3T3-J2细胞的培养与维持
采用3T3-J2成纤维细胞饲养层细胞系，支持人类早期发育阶段食管上皮细胞的二维扩增。该细胞系按照先前报道的方法制备（Liu, Krawczyk et al. 2017）。简而言之，J2…
该细胞系购自 Kerafast，性别未披露。J2 培养基配制方法如下：将 500 mL DMEM（REF 11960-044；不含 L-谷氨酰胺）、50 mL 添加铁的牛犊血清（ATCC 30-2030；未经伽马射线照射或热灭活）、5.5 mL 青霉素/链霉素（Pen/Strep；Gibco）和 5.5 mL L-GlutaMax（Gibco 25030-081）混合。复苏时，将冻存的 J2 细胞（每管约 600,000 个细胞）置于 37°C 水浴中快速解冻 30 秒，随后直接加入 50 mL 预热培养基中，不进行离心。将细胞接种于 T150 培养瓶中，在 37°C、10% CO₂ 条件下培养。接种 24 小时后更换培养基，此后每两天更换一次。细胞培养至 70–90% 汇合度后进行传代。达到适宜汇合度后，吸去培养基，并用 5 mL DPBS 冲洗细胞。加入共计 5 mL 的 0.05% 胰蛋白酶/EDTA，使细胞脱落。加入 5 mL 培养基终止胰蛋白酶活性，随后以 500×g 离心 5 分钟。用 7 mL 培养基重悬细胞沉淀，并吹打混匀 20 次，再根据生长需求按 1:2 或 1:6 的比例分瓶。细胞汇合度不得超过 80%，因为过度汇合会影响其对辐照的敏感性。制备饲养层细胞时，将 3T3-J2 细胞以 30 Gy 辐照，并重悬于含 5% DMSO 的培养基中，细胞浓度为 1.2 × 10⁶ 个/mL。每管分装 500 µL、含 600,000 个细胞的细胞悬液并冻存。通过每孔接种 100,000 个细胞并确认培养后无细胞生长，验证辐照是否成功。
用于食管类器官培养的 HYENAC 培养基配制
HYENAC 培养基按照 Ferrer-Torres 等人（2022）此前所述方法配制。
荧光原位杂交（FISH）
为观察早期发育过程中食管组织中特定 mRNA 转录本的空间分布……
组织和类器官采用 RNAscope 方案（ACD Bio-Techne）进行荧光原位杂交（FISH）。组织和类器官在 4% 多聚甲醛中于 4°C 固定过夜，随后包埋于石蜡中。石蜡切片在 Histoclear II 中脱蜡，并经梯度乙醇溶液复水；冰冻切片则用 PBS 短暂清洗。为提高探针可及性，切片经过氧化氢处理以阻断内源性过氧化物酶活性，随后使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，并进行蛋白酶消化。探针杂交时，加入针对 WNT2B、PDGFRA、TP63 或其他感兴趣标志物的靶标特异性探针，并将切片置于 40°C 加湿培养箱中孵育 2 小时。随后使用专有扩增系统扩增杂交探针，并以荧光团标记。使用 FluorSave Reagent（Millipore-Sigma：345789）封片。细胞核以 DAPI 复染，并通过共聚焦显微镜（Nikon）成像，以捕捉靶标转录本的空间分布。分析荧光信号及其与蛋白标志物的共定位情况，以确认上皮细胞群与间充质细胞群之间的空间关系。
免疫荧光与组织学分析
石蜡包埋组织的免疫荧光染色。切片在 Histoclear II 中脱蜡 5 分钟（更换两次），并经梯度乙醇溶液（100%、95%、70% 和 30% 乙醇，每种浓度更换两次，每次 3 分钟）复水。复水后，切片用双蒸水（ddH₂O）冲洗 5 分钟（更换两次）。抗原修复通过将切片置于柠檬酸钠缓冲液中进行（取 25 mL 10× 柠檬酸钠缓冲液，用……稀释】【。
225 mL 双蒸水（ddH₂O），微波加热 2 分钟，直至溶液变浑浊。随后将载玻片置于 Tissue-Tek 容器中蒸汽处理 20 分钟，并冷却 15–20 分钟，再用 ddH₂O 漂洗 5 分钟（更换两次）。去除多余液体后，用疏水性 PAP 笔圈定样品区域，并加入封闭液以防止非特异性结合。将载玻片置于湿润的水浴盒中，于室温孵育 30 分钟至 1 小时。将用封闭液稀释的一抗（封闭液由 4.7 mL TBS、50 μL 10% Triton X 和 250 μL 驴血清配制）加至载玻片上，并置于水浴盒中，于 4°C 孵育过夜。
次日，将载玻片置于 1× PBS 中漂洗 5 分钟（更换三次），以去除未结合的一抗。加入用封闭液稀释的二抗和 DAPI，并将载玻片置于避光湿润的水浴盒中，于室温孵育 2 小时。用 1× PBS 最后漂洗（每次 5 分钟，共三次）后，使用 ProLong Gold 封片剂封片。盖上盖玻片的载玻片避光保存于 4°C，直至成像。免疫荧光（IF）染色所用一抗如下，除非另有说明，稀释比例均为 1:1000：兔抗 CAV1（HPA049326，Sigma）、兔抗 CAV2（HPA044810，Sigma）、兔抗 COL17A1（HPA043673，Sigma）、山羊抗 CRNN（AF3607，R&D）、小鼠抗 ECAD（610181，BD Biosciences）、大鼠抗 ECAD（13-1900，Thermo Fisher）、小鼠抗 KI67（652402，BioLegend）、兔抗 KRT4（HPA034881，Atlas）、兔抗 LY6D（HPA024755，Atlas）、山羊抗 TP63（BAF1916，R&D）、山羊抗 VIM（sc-7558，Santa Cruz）和小鼠抗 Hu-Nu（ab191181，Abcam）。
用于 3D 悬浮类器官培养的 pHEMA 涂层培养板的制备
为生成三维悬浮类器官，我们参照既往方案（Choi, Vodyanik et al. 2011; Capeling, Huang et al. 2022），使用 10% 聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（pHEMA）溶液包被组织培养板。配制包被液时，将 4 g pHEMA（Sigma，P3932）加入 40 mL 含 10 mM 氢氧化钠（NaOH；Fisher Scientific，S318）的 95% 乙醇中。NaOH 用作增溶剂；鉴于其具有腐蚀性，配制过程中须佩戴橡胶手套和防护 goggles。通过在室温或 37°C 下持续旋转过夜，使溶液完全溶解。为防止 pHEMA 沉淀，加入 pHEMA 后应立即振荡。完全溶解后，溶液在室温下保存，直至使用。在组织培养罩内，将 pHEMA 溶液充分加入培养板，使其覆盖整个表面。小心移除多余溶液并倒回原液中，该溶液可重复使用多次。包被后的培养板不加盖，置于组织培养罩内的紫外线（UV）照射下过夜，以确保无菌。次日，用 1× PBS 清洗培养板一次，然后接种细胞进行三维悬浮培养。
三维悬浮类器官培养、Matrigel 和工程化微孔
解离的食管细胞采用悬浮培养体系（Brandenberg, Hoehnel et al. 2020）培养，或包埋于 Matrigel（Discovery Labware，货号 354234）中培养；培养方式还包括不使用细胞外基质的悬浮培养或在工程化微孔中培养。将细胞以经优化、适于类器官形成的密度接种于 96 孔板中（所有体系均为每孔 150,000 个细胞）。琼脂糖工程化微孔按照既往描述的方法制备（Eiken, Levine et al. 2025）。
简而言之，将 EZSPHERE 培养板（Nacalai USA）不同尺寸的表面（500/200 μm、800/300 μm 和 1600/400 μm，分别为宽度/深度）作为模板，制备聚二甲基硅氧烷（PDMS；DOW Chemicals Corporation）微孔模具（Loebel, Saleh 等，2022）。将琼脂糖（Millipore Sigma）以 2.2 wt% 的浓度溶于 PBS 中并加热至完全溶解，取 2 mL 加入 6 孔板，再将 PDMS 模具压置其上。冷却使琼脂糖交联后，移除模具。用 PBS 清洗水凝胶微孔表面，并经紫外线灭菌后加入细胞。采用明场成像和免疫荧光成像评估类器官结构及标志物表达。
ECAD⁺细胞分选的流式细胞术
采用流式细胞术分析食管上皮细胞群和间充质细胞群的细胞表面标志物。收集细胞后，使用 TrypLE 在 37°C 下处理，直至完全解离为单细胞悬液。加入等体积培养基以中和 TrypLE 活性，并将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛，以去除细胞聚集体。以 300 × g、4°C 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液，并用冰冷的 FACS 缓冲液（含 3% BSA 的 PBS）重悬细胞沉淀。以 300 × g、4°C 离心 5 分钟洗涤两次后，将细胞重悬于 100 µL FACS 缓冲液中。进行抗体染色时，向每份样品中加入 0.1–10 µg/mL 的标记一抗；必要时用 FACS 缓冲液稀释抗体。样品于 4°C 避光孵育 30 分钟。孵育后，用冰冷的 FACS 缓冲液洗涤细胞两次（离心进行），再将细胞重悬于 200 µL 至 1 mL 缓冲液中。加入 DAPI（1 µg/mL）以评估
细胞活力。样本置于冰上避光保存，或在 4°C 下保存直至分析。为获得最佳结果，立即进行流式细胞术检测。使用流式细胞仪采集数据，并通过 FlowJo 软件进行分析。将分选出的 ECAD+ 和 ECAD– 细胞收集于经 FBS 包被、含有冷 HYENAC 培养基的试管中，以维持细胞活力。随后将分选细胞与 3T3-J2i 共培养并扩增，以用于后续实验。
WNT 调控实验
为评估 WNT 信号通路的作用，在类器官培养体系中加入 WNT 信号通路抑制剂 IWR-1（ApexBio，货号 B2306，终浓度 5 μM）。持续 14 天监测类器官的生长和形态。通过明场成像和免疫荧光成像评估类器官结构及标志物表达。
RNA 提取、逆转录合成 cDNA 及 qPCR
第 14 天，采用 TRIzol（Invitrogen™ TRIzol™ Reagent，货号 15-596-026）和氯仿（Sigma-Aldrich，货号 366927）提取食管类器官中的 RNA。将类器官从 96 孔板中取出，离心沉淀以去除培养基。加入 200 μL TRIzol，短暂孵育后加入 200 μL 氯仿，随后以 12,000 × g 离心 15 分钟。将含 RNA 的上层澄清水相转移至新试管中，再加入异丙醇，并以 12,000 × g 再次离心 15 分钟。移除异丙醇后，加入 70% 乙醇，以 7,500 × g 离心 5 分钟。移除乙醇后，将 RNA 沉淀置于层流罩中晾干。用 10 μL 无核酸酶水重悬 RNA 沉淀，置于预热至 60°C 的加热模块上，随后使用 Nanodrop 测定 RNA 浓度。
定量后，计算含有 500 ng RNA 的 RNA 溶液体积，并将其加入……
每个PCR管中加入4 μl iScript Supermix（Bio-Rad，iScript™ Reverse Transcription Supermix，货号：1708841）和13–15 μl无核酸酶水，使每管总体积达到20 μl。
cDNA逆转录完成后，将其置于冰上保存，并针对所用的每种引物配制引物预混液。每个PCR孔对应的引物预混液由5 μl SYBR Green（Abclonal Technologies，2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix，货号：RK21203）、2 μl无核酸酶水和1 μl工作浓度引物组成。引物由Thermo Fisher Scientific定制合成，交付时为干粉；加入无核酸酶水重悬，使其浓度达到100 μM。引物工作液由180 μl无核酸酶水、5 μl正向引物和5 μl反向引物配制而成。
每个孔加入2 μl cDNA和8 μl预混液。将PCR板离心后，使用QuantStudio 3 96孔实时PCR检测仪进行扩增并定量。
单细胞RNA测序与数据分析
预处理与质量控制
使用CellRanger v7将测序读段比对至人类基因组（GRCh38-2020-A），并生成基因表达矩阵。细胞判定也在CellRanger中完成。将过滤后的细胞×基因计数矩阵导入R v4.0（RStudio v1.4），并使用Seurat v4–v5进一步处理。
对于组织样本，仅分析符合以下阈值的细胞核：特征数介于1500至7500之间，且线粒体RNA读段比例低于20%。对发育中食管的二维培养物及食管样体三维培养物数据进行过滤，仅保留特征数介于1500至10000之间、线粒体读段比例低于20%且唯一分子标识符（UMI）数量超过10000的细胞。发育中食管数据还在未过滤的条件下进行处理，以恢复一个正在经历腔面……的多纤毛细胞簇。
脱落。该簇在质控筛选后、数据整合前，被追加至合并后的发育中食管数据集中。
数据整合（批次校正）、降维与初始聚类
使用 Seurat::NormalizeData() 对每个样本进行归一化，并使用 Seurat::FindVariableFeatures() 确定可变特征。针对来源相似的样本（即成人食管、发育中食管、二维和三维食管培养物），使用 Seurat::SelectIntegrationFeatures() 选择用于数据集间整合的特征。随后，使用 Seurat::ScaleData() 对每个数据集中的这些特征进行缩放，并将缩放后的数据作为 Seurat::RunPCA() 的输入。
使用前 30 个主成分（PC）作为 Seurat::FindIntegrationAnchors() 的输入，并采用互为 PCA（reciprocal PCA）方法；随后再次使用前 30 个 PC，通过 Seurat::IntegrateData() 生成经批次校正的 assay。在批次校正后的 assay 上执行 Seurat::CellCycleScoring()，随后使用 Seurat::ScaleData()，并回归 S 期和 G2/M 期评分。将缩放后的批次校正数据作为 Seurat::RunPCA() 的输入。随后，对每个经批次校正的数据集执行 Seurat::RunUMAP()，所用 PC 如下：成人食管为 1 至 12；发育中食管、三维食管样体和二维食管培养物为 1 至 14。Seurat::FindNeighbors() 使用相同数量的 PC。随后使用 Seurat::FindClusters() 执行 Louvain 聚类，分辨率如下：成人食管为 0.15；发育中食管为 0.4；二维培养物和三维食管样体培养物为 0.3。
亚聚类
根据 CDH1 表达鉴定成人和发育中食管数据中的上皮簇；而间充质簇则……
根据VIM表达进行鉴定。将属于上皮或间充质簇的细胞分别提取为独立对象，并使用完整数据集的整合 assay，通过 Seurat::RunPCA() 为每个对象重新计算主成分（PC）。随后使用以下 PC 执行 Seurat::RunUMAP：成人食管上皮：1 至 12；发育中食管上皮：1 至 6；发育中食管间充质：1 至 10。使用 Seurat::FindClusters 进行 Louvain 聚类，分辨率设置如下：成人食管上皮：0.15；发育中食管上皮和间充质：0.4。
细胞类型注释
根据定义成人食管分层上皮细胞群的已知标记物（Ferrer-Torres, Wu et al. 2022）以及不同间充质亚型的已知标记物，对成人和发育中食管数据集中的簇进行人工注释。当某一细胞类型的基因富集谱不对应任何已知细胞类型时，簇名称由高特异性标记物和其主要细胞类别组成（例如 KCNN3+ 间充质）。
标签转移
为将发育中食管上皮细胞类型身份与成人食管上皮细胞类型身份对齐，使用两个数据集未经校正的 RNA assay 和前 30 个 PC 进行标签转移。通过 Seurat::FindTransferAnchors() 确定锚点，并使用 Seurat::TransferData() 转移标签。
为根据体内参考数据推断体外细胞身份，使用参考数据集和查询数据集中的批次校正 assay，通过 FindTransferAnchors(k.filter = 200) 生成锚点，并使用 Seurat::MapQuery() 转移标签。
基因模块评分
通过选取……来确定发育中食管数据中各细胞类型的基因集模块。
根据 Seurat::FindMarkers() 确定的 log-fold change，选取富集程度最高的前 100 个基因。采用 Tirosh 等人开发的基因集方法（Tirosh, Izar et al. 2016），并通过 Seurat::AddModuleScore() 实现，对三维食管类器官和二维食管细胞培养中的所有细胞进行所有基因模块的评分。
定量分析与统计分析
使用 Seurat 中默认设置的 FindMarkers()，对 scRNA-seq 数据中不同细胞培养条件之间的基因表达差异进行统计分析。使用 Olympus Cellsens 对类器官大小、标志物表达和细胞增殖进行定量分析：采用手动阈值测量类器官大小（单位为 μm²），采用自适应阈值将标志物表达与背景荧光区分开。使用 Cellsens 内置的神经网络对 DAPI 染色的细胞核进行计数。统计分析使用 GraphPad Prism 完成。数据以均值 ± SEM 表示，显著性通过 Student t 检验、单因素方差分析或双因素方差分析并进行事后校正来确定。P 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。
为量化类器官形成速率，当类器官停止收缩时，即将其判定为完全形成。因此，我们记录了类器官停止收缩的时间点。为复核判断并降低主观性，我们将记录时间点的类器官大小与最终记录帧中的类器官大小进行比较，如图 5 所示。
对数据进行正态性检验，并采用适用于组间比较的参数检验进行分析。为比较 ECAD⁺ 和 ECAD⁻ 细胞群体之间的 ECAD 表达水平（图 5D），采用非配对的……
采用双尾 Student’s t 检验。选择该检验是因为它适用于比较具有连续型数据的两个独立组的均值。
对于涉及两个以上组的比较，包括类器官形成时间（图 5F）和第 14 天的类器官面积（图 5H），采用单因素方差分析（ANOVA）评估四种条件之间的总体差异：ECAD⁺、ECAD⁻、原代混合培养（PMC）以及 1:1 ECAD⁺/ECAD⁻ 混合组。当数据近似服从正态分布且各组方差相近时，ANOVA 适用于评估多个组之间的均值差异。
ANOVA 结果显著后，采用 Tukey 诚实显著性差异（HSD）事后检验确定各条件之间的两两差异，同时控制家族错误率。Tukey HSD 适用于多重比较，并通过提供校正后的 p 值识别具有统计学显著性的组间差异。显著性阈值设为 p < 0.05；在适用情况下报告精确 p 值。除非另有说明，数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。
严谨性与可重复性
所有实验中，每种条件至少设置 2 至 3 个技术重复；生物学重复为 2 至 4 个独立样本，以确保各项检测的严谨性与可重复性。
数据可用性
本文分析的所有 scRNA-seq 数据集，其完整处理并注释后的 RObjects 均可在 Zenodo 获取（https://zenodo.org/uploads/17410413）。体外食管培养的原始 scRNA-seq 数据将在论文发表时上传至 ArrayExpress。成人期食管样本的原始 scRNA-seq 数据已上传至 ArrayExpress（E-MTAB-12266）。原始……
发育中食管标本的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据可在 ArrayExpress 获取（E-MTAB-10187）。
代码可用性
用于单细胞 RNA 测序数据分析的代码可从以下网址获取：
https://github.com/jason-spence-lab/Frum-et-al.-2025b.git
示意图与图表
示意图使用 BioRender.com 和 Adobe Illustrator 制作。
稿件准备过程中生成式人工智能及 AI 辅助技术的使用声明
在准备本研究期间，作者使用 Microsoft Copilot 检查语法错误。使用该工具/服务后，作者对内容进行了审阅并根据需要作出修改，并对已发表文章的内容承担全部责任。
关键资源表：
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经费支持与利益声明
J.R.S. 获得了 Chan Zuckerberg Initiative Seed Network、密歇根大学胃肠道研究中心（UMCGR）以及美国国立糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（5P30DK034933）的资助。D.F.-T. 获得了密歇根大学医学院可塑性与器官设计中心（CPOD）（T32HD007505）、密歇根临床与健康研究所（UL1TR002240、KL2TR002241、TL1TR002242）以及美国国立糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（K99.R00DK133804）的资助。J.R.S. 和 D.F.T. 均列名于一项与本研究相关的专利。
利益冲突声明
Jason R. Spence 是 Intero Biosystems 的首席科学官。Intero Biosystems 未为本研究提供任何支持。Jason R. Spence 和 Daysha Ferrer Torres 列名于一项与本出版物相关的专利；该专利与 Intero Biosystems 无关。其余作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们衷心感谢密歇根大学先进基因组学核心设施在操作 10x Chromium 单细胞捕获平台及测序方面提供的专业支持。我们还感谢密歇根大学显微成像核心设施提供共聚焦显微镜和图像分析软件的使用机会，并感谢华盛顿大学发育生物学实验室的工作人员。
我们感谢密歇根大学组织学核心设施对组织学样本进行处理，并特别感谢 Emma Snyder-White。我们还感谢密歇根医学转化组织建模实验室（TTML）提供生长培养基，并为人类体外建模提供技术指导。转化组织建模实验室是由密歇根大学资助的项目，获得胃肠道研究中心、院长办公室、综合癌症中心以及病理学、药理学和内科学系的支持，并另获基础科学捐赠基金支持。
已申报的资助方信息
美国国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所，
https://ror.org/00adh9b73，K99.R00DK133804
脚注
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12
通讯联系人
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共同第一作者
参考文献
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Andl，C. D.，T. Mizushima，H. Nakagawa，K. Oyama，H. Harada，K. Chruma，M. Herlyn 和 A. K. Rustgi（2003）。“表皮生长因子受体在体外和体内促进食管角质形成细胞的增殖、迁移与聚集。”《生物化学杂志》278（3）：1824–1830。
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Brandenberg，N.，S. Hoehnel，F. Kuttler，K. Homicsko，C. Ceroni，T. Ringel，N. Gjorevski，G. Schwank，G. Coukos，G. Turcatti 和 M. P. Lutolf（2020）。“高通量自动化类器官……
通过在微腔阵列中进行干细胞聚集培养
Nat Biomed Eng 4（9）：863–874。
Busslinger，G. A.、B. L. A. Weusten、A. Bogte、H. Begthel、L. A. A. Brosens 和 H. Clevers（2021）。《在单细胞分辨率下解析的人类食管、胃和十二指肠胃肠道上皮》。Cell Rep 34（10）：108819。
癌症基因组图谱研究组、分析工作组：阿桑医疗中心、英属哥伦比亚癌症局、布里格姆妇女医院、Broad 研究所、布朗大学、凯斯西储大学、丹娜-法伯癌症研究所、杜克大学、大波兰癌症中心、哈佛医学院、系统生物学研究所、鲁汶大学、梅奥诊所、纪念斯隆凯特琳癌症中心、美国国家癌症研究所、全美儿童医院、斯坦福大学、某大学、某大学、北卡罗来纳大学、某大学、某大学、南加州大学、德克萨斯大学 MD 安德森癌症中心、某大学、范安德尔研究所、范德堡大学、华盛顿大学；基因组测序中心：Broad 研究所、圣路易斯华盛顿大学；基因组特征分析中心：Broad 研究所、哈佛医学院、约翰斯·霍普金斯大学西德尼·金梅尔综合癌症中心、某大学。
关键词：食管类器官 · 食管发育 · WNT2B信号 · 基底祖细胞 · 单细胞RNA测序
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.23.733451v1?rss=1