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发育生物学中一个尚未解决的核心问题是，复杂程度极高的系统如何由相对少数的生长因子家族产生。使这一问题更加复杂的是，信号通路往往存在信号汇聚现象，即多种配体与数量较少的受体相互作用，随后这些受体通过单一的第二信使复合物传递信号。在此，我们以骨形态发生蛋白（BMP）信号及其指导脊髓背侧发育的作用为背景，聚焦于两种受体调控型（R）Smad蛋白——Smad1和Smad5，对这一问题展开研究。关于它们的作用方式，目前已提出多种模型，从通过综合信号强度发挥冗余作用，到具有不同活性并驱动不同的命运结局。为区分这些模型，我们通过CRISPR基因编辑构建了Smad1和Smad5敲除的小鼠胚胎干细胞（ESC）系，以体内研究无法达到的分辨率，解析各个R-Smad在细胞命运决定中的作用。通过结合背侧中间神经元（dI）定向分化方案与生物信息学分析，我们明确了R-Smad在dI命运特化进程中关键决策节点上的作用。总体而言，这些发现支持这样一种模型：Smad1和Smad5在脊髓背侧发育中发挥基本不同的作用。尽管这两种R-Smad均可激活经典的BMP响应性转录靶标，但它们对细胞命运特化的贡献并不对等。Smad1的作用较为有限，而Smad5则发挥主导作用，调控背侧祖细胞的转录动态，并反复指导最背侧dI细胞的命运决定。
Smad1和Smad5在小鼠胚胎干细胞体外分化为背侧中间神经元的过程中差异性地转导BMP信号 | bioRxiv
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Smad1和Smad5在小鼠胚胎干细胞体外分化为背侧中间神经元的过程中差异性地转导BMP信号
Salena Gallardo，
Sandeep Gupta，
Yahir Verdin，
Cristian Rodriguez，
Brian Chilin，
Armo Derbarsegian，
Gabriela Gajardo Del Real，
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Samantha J. Butler
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.06.30.735733
Salena Gallardo
1
美国加利福尼亚州洛杉矶，加利福尼亚大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院神经生物学系，邮政编码90095
2
美国加利福尼亚州洛杉矶，加利福尼亚大学洛杉矶分校分子生物学跨系研究生项目，邮政编码90095
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Sandeep Gupta
1
美国加利福尼亚州洛杉矶，加利福尼亚大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院神经生物学系，邮政编码90095
3
加拿大埃德蒙顿，阿尔伯塔大学细胞生物学系
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Yahir Verdin
4
加利福尼亚州立大学北岭分校CIRM科研衔接项目，加利福尼亚州北岭，邮政编码91330
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Cristian Rodriguez
1
美国加利福尼亚州洛杉矶，加利福尼亚大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院神经生物学系，邮政编码90095
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Brian Chilin
4
CIRM科研衔接项目，
加利福尼亚州立大学
，北岭，加利福尼亚州 91330
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Armo Derbarsegian
1
加利福尼亚大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院神经生物学系
，洛杉矶，加利福尼亚州 90095，
美国
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Gabriela Gajardo Del Real
4
加利福尼亚州立大学 CIRM 研究桥梁计划
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Samantha J. Butler
1
加利福尼亚大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院神经生物学系
，洛杉矶，加利福尼亚州 90095，
美国
5
加利福尼亚大学洛杉矶分校伊莱与伊迪丝·布罗德再生医学与干细胞研究中心
，洛杉矶，加利福尼亚州 90095，
美国
6
加利福尼亚大学洛杉矶分校智力与发育障碍研究中心
，洛杉矶，加利福尼亚州 90095，
美国
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发育生物学中一个尚未解决的核心问题是：极其复杂的系统如何由相对少数的生长因子家族产生。使这一问题更加复杂的是，信号通路往往呈现信号汇聚现象，即多种配体与数量较少的受体相互作用，而这些受体随后通过单一的第二信使复合物传递信号。在此，我们以骨形态发生蛋白（BMP）信号传导及其在指导脊髓背侧发育中的作用为背景，研究这一问题，重点关注两种受体调控型（R）Smad 蛋白，
Smad1和Smad5。关于二者的作用方式，目前已提出多种模型：从通过叠加信号强度发挥冗余作用，到具有驱动不同命运结局的独特活性。为区分这些模型，我们利用CRISPR基因编辑技术构建了Smad1和Smad5基因敲除的小鼠胚胎干细胞（ESC）系，以体内研究无法达到的分辨率，剖析各个受体调节型Smad（R-Smad）在细胞命运决定中的作用。通过结合背侧中间神经元（dI）定向分化方案与生物信息学分析，我们明确了R-Smad在dI命运特化进程中关键决策节点上的作用。总体而言，这些发现支持如下模型：Smad1和Smad5在脊髓背侧发育中发挥的作用在很大程度上各不相同。尽管这两种R-Smad均可激活经典BMP响应性转录靶基因，但它们对细胞命运特化的贡献并不对等。Smad1的作用有限，而Smad5则发挥主导作用，调控背侧祖细胞的转录动态，并在多个阶段反复引导最背侧dI的命运决定。
引言
骨形态发生蛋白（BMP）在不同胚胎组织中调控极为广泛的细胞功能，包括增殖、分化、迁移和细胞模式形成（Hemmati-Brivanlou and Thomsen, 1995；Hogan, 1996；Kobayashi et al., 2005）。20余种BMP配体通过约7种I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶BMP受体传递信号；这些受体通过磷酸化，激活三种经典第二信使，即受体调节型（R）Smad（Smad1/5/8）（图1B）（Wang et al., 2014）。R-Smad与共同介导型Smad——Smad4形成复合物，并转位至细胞核，调控特定的基因表达程序（Wrana et al., 1994；Zhang et al., 1996
）。Smad复合物可根据所存在的辅因子发挥激活或抑制作用，还可直接或通过募集组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）复合物重塑染色质结构（Akizu et al., 2010；Kim et al., 2011）。
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图1.
小鼠背侧中间神经元（dI）定向分化方案中Smad1/5信号传导的时间进程
（A）为期9天的RA±BMP4体外定向分化方案的时间进程示意图，该方案用于从小鼠胚胎干细胞（mESC）获得dI。首先诱导mESC丧失多能性并进入神经中胚层祖细胞（NMP）状态。在第3–5天添加RA，引导NMP获得背侧祖细胞（dP）身份，随后分化为dI4、dI5和dI6。在第4–5天同时添加BMP4和RA，则引导dP分化为dI1、dI2和dI3。
（B）经典BMP信号通路示意图。BMP与受体结合后，Smad1/5被磷酸化（p）并激活，成为背侧脊髓发育过程中BMP信号传导的关键下游介导因子。
（C–J）第9天的体外培养细胞已有效完成神经化，同时包含Pax3⁺ dP和Myt1l⁺有丝分裂后神经元（C、F和I；RA：n=7张图像，RA+BMP4：n=13张图像）。如先前研究所示（Gupta et al., 2022；Rodriguez et al., 2026），RA方案可诱导产生Lhx1/5⁺ dI4和Lmx1b⁺ dI5（E、H和J；RA方案：Lhx2，n=7；Lhx1/5、Lmx1b，n=4；RA+BMP4方案：Lhx2，n=10；Lhx1/5、Lmx1b，n=4），而RA+BMP4方案可诱导产生Lhx2⁺ dI1（D、G和J）。
（K、L）通过蛋白质印迹分析评估RA±BMP4方案整个时间进程中的Smad1和Smad5水平以及BMP信号活性（p-Smad）。在RA+BMP4方案的整个过程中，Smad1和Smad5均广泛表达
(K)。通过 p-Smad 免疫反应性检测可见，在 RA 方案中，BMP 信号通路自第 4 天起持续以稳定水平激活（L）；而在 RA+BMP4 方案中，重组 BMP4 处理后 6 小时内，BMP 信号通路活性即显著上调（K）。
比例尺：100 μm
对照组与实验组之间的相似性概率：* p<0.05，*** p<0.0005；双因素方差分析
Smad 作为转录调控因子的能力已得到充分证实。然而，单一的第二信使复合物如何通过种类有限的受体传递多样化的配体输入，进而产生由 BMP 指导的广泛细胞反应，目前仍未明确。我们正在背侧脊髓中研究这一问题，BMP 在此反复发挥指导细胞命运（Andrews et al., 2019；Gupta and Butler, 2021）和轴突导向（Augsburger et al., 1999）的作用。背侧脊髓包含六类背侧中间神经元（dI），即 dI1–dI6，分别来源于六个背侧祖细胞（dP）群，即 dP1–dP6。这些亚型可根据其表达的转录因子组合加以区分（Alaynick et al., 2011）。已知 BMP 信号通路决定脊髓最背侧区域的细胞命运，即顶板（RP）、dI1、dI2 和 dI3（Andrews et al., 2017；Lee et al., 2000；Lee et al., 1998；Wine-Lee et al., 2004）。脊髓中间区域，即 dI4–dI6，被认为由视黄酸（RA）决定其细胞命运（Gupta et al., 2022）。RA 存在于周围的轴旁中胚层中，并在更早阶段发挥指导神经化的作用（Diez del Corral et al., 2003；Novitch et al., 2003）。
既往研究表明，R-Smad 在胚胎发生过程中可相互替代地发挥功能（Arnold et al., 2006）。然而，R-Smad 分布于发育中脊髓的不同区室：
Smad5在祖细胞中的表达水平最高，而Smad1则富集于有丝分裂后神经元及其突起中，Smad8则完全不表达（Hazen et al., 2012）。这一分布模式与Smad1和Smad5在脊髓发育中发挥不同而非冗余作用的观点一致。我们在小鼠中采用的条件性功能缺失遗传学方法以及在鸡中开展的过表达研究支持了这一假说，提示Smad5介导骨形态发生蛋白（BMP）的细胞命运指定活性，而Smad1调控轴突生长（Hazen et al., 2012）。然而，其他研究得出了不同的结论；在鸡胚中采用RNA抑制方法的研究提示，Smad1和Smad5以冗余方式介导背侧中间神经元（dI）的命运指定（Le Dreau et al., 2012）。这一发现促成了信号强度模型的提出，该模型认为，决定细胞命运的是Smad1/5的总体活性水平，而非各个Smad的分子身份（Le Dreau et al., 2014）。受体调节型Smad（R-Smad）在脊髓中呈梯度磷酸化（p）（Hazen et al., 2012），这与信号强度模型一致。然而，我们随后发现，不同的BMP可诱导相似水平的pSmad1/5，却产生显著不同的细胞命运结果（Andrews et al., 2017），提示R-Smad的分子身份而非信号强度才是决定细胞命运的关键因素。
体内研究方法存在固有的局限性。在鸡中进行短时异位基因表达是在内源性信号反复作用的背景下开展的，而RNA抑制方法可能缺乏特异性，同时靶向多个相关基因。相比之下，小鼠条件性敲除方法所使用的Cre品系可能缺乏组织特异性，或者存在持续残留的基因功能，从而掩盖表型，尤其是在蛋白质周转……
进程缓慢。为克服这些局限性，我们建立了一种新的小鼠胚胎干细胞（ESC）模型系统，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术（Jiang and Doudna, 2017）构建了分别缺失Smad1（Smad1Δ）或Smad5（Smad5Δ）的细胞系。干细胞模型是研究复杂发育模式形成及转录机制的有力系统（Gouti et al., 2014；Panchision et al., 2001；Sagner et al., 2018），也被用于研究脊髓腹侧发育（Mazzoni et al., 2013；Sagner et al., 2018）。这些模型能够产生大量以相对同步的方式执行相同发育命运决策的细胞，并允许以体内无法实现的方式对输入信号进行实验性控制。
在本研究中，我们以已建立的背侧中间神经元（dI）定向分化方案（Gupta et al., 2022；Rodriguez et al., 2026）为平台，解析Smad1和Smad5在脊髓背侧发育中的各自作用。这些方案通过神经中胚层祖细胞（NMP）这一中间阶段产生dI（Gouti et al., 2014），从而重现脊髓背侧发育的内源性程序（Gupta et al., 2025；Gupta et al., 2022）。视黄酸（RA）方案可富集中间区域的dI（dI4–dI6），而RA+BMP4方案则最有效地诱导最背侧的dI（dI1–dI3）（Gupta et al., 2022）。通过在对照、Smad1Δ和Smad5Δ小鼠胚胎干细胞（mESC）系的dI命运特化时间进程中的关键决策节点应用生物信息学方法，我们明确了每种受体调节型Smad（R-Smad）对脊髓背侧发育的独立贡献。我们发现，尽管这两种R-Smad均可激活经典的BMP响应性转录靶标，但它们对细胞命运决策的贡献并不对等。Smad1的作用较为有限，主要抑制特定的背侧
命运，而Smad5则是主要的第二信使，指导整个背侧祖细胞区域（dP1–dP6）的转录动态，并反复指导最背侧dI的命运。综上，这些发现支持这样一种模型：在脊髓背侧，决定BMP信号通路多样化细胞命运输出的是Smad的类型，而非仅仅是信号强度。
材料与方法
小鼠胚胎干细胞向dI的分化
按照既往所述的二维贴壁培养方案，将对照、Smad1Δ和Smad5Δ小鼠胚胎干细胞（mESC）诱导分化为背侧中间神经元（dI）（Rodriguez等，2026）。
蛋白质免疫印迹分析
用1× PBS洗涤细胞后，将添加了1×蛋白酶抑制剂混合物（Roche）和1×磷酸酶抑制剂混合物（Roche）的预冷Pierce® RIPA缓冲液（Thermo Scientific）直接加入24孔分化培养板的多个孔中。合并裂解后的细胞悬液，在冰上放置15分钟，随后于4°C、14,000 × g离心15分钟。对上清液进行BCA测定，以确定蛋白质浓度。取40 μg蛋白质，使用4%–12%梯度Bis-Tris SDS凝胶（GenScript）进行SDS-PAGE，随后转移至PVDF膜（Millipore Sigma）。使用5%脱脂奶粉（Bio-Rad Laboratories）封闭膜1小时。随后将封闭后的膜与一抗（见关键资源表）于4°C孵育过夜。之后，用TBST（20 mM Tris、150 mM NaCl、0.1% Tween 20）洗膜三次，在室温下与相应物种特异性的辣根过氧化物酶偶联二抗（Jackson ImmunoResearch Laboratories）孵育1小时，再用TBST洗涤两次、TBS洗涤一次。对化学发光条带进行分析
使用Pierce Femto化学发光试剂盒，在ChemiDoc™成像系统（Bio-Rad）上进行检测。若重复使用Western blot膜（图1K），则使用Restore™ PLUS缓冲液（Thermo Scientific）对膜进行剥离，并重新检测，以确认无蛋白信号残留。
免疫组织化学
用1× PBS洗涤培养细胞，并在培养孔内用新鲜预冷的4%多聚甲醛（PFA）固定8 min。固定后，用1× PBS洗涤两次，以去除残留的PFA。用含1%热灭活马血清的1× PBS封闭细胞1 h，随后将一抗加入封闭液中，于4°C孵育过夜。洗涤后，将与一抗来源物种相匹配的二抗（Jackson Immuno Research Laboratories）加入1× PBST（PBS + 0.1% Triton 20）中，孵育1 h。随后用1× PBST洗涤培养细胞，以去除残留二抗，并用DAPI复染细胞核。最后，使用蔡司LSM800倒置共聚焦显微镜，以20×放大倍数对培养板进行成像。
Smad1和Smad5缺失（Δ）mESC细胞系的构建
采用已报道的CRISPR介导的基因组删除策略（Ran et al., 2013），构建Smad1和Smad5缺失（Δ）小鼠胚胎干细胞（mESC）系。简言之，将靶向Smad1或Smad5基因座第2外显子上游和下游的向导RNA（gRNA）克隆至pSpCas9(BB)-2A-Puro V2.0质粒中。随后，使用Lonza 4D-Nucleofector® X Unit将不同组合的gRNA构建体导入细胞。将核转染后的细胞以单细胞密度接种于含有添加嘌呤霉素的mESC培养基的组织培养板中。分离在嘌呤霉素存在条件下生长的克隆，进行扩增并进一步鉴定，以确认基因组删除正确。
Smad1Δ和
Smad5Δ mESC细胞系
我们通过PCR、Sanger测序和蛋白质印迹法确认了外显子2位点的成功切除。将候选Smad1Δ和Smad5Δ小鼠胚胎干细胞（mESC）系培养于0.1%明胶包被的培养板上，并在细胞融合度达到75%时传代。传代两次后，用1× PBS洗涤细胞，再加入0.25%胰蛋白酶，于37°C孵育3 min。按1:1的体积比加入mESC培养基以终止胰蛋白酶的消化作用，收集细胞，并以1,000 rpm离心5 min。将细胞沉淀重悬于1× PBS中，均匀分装，用于后续分析。
PCR和Sanger测序
按照制造商的操作规程，使用QIAamp® DNA Mini试剂盒从重悬的细胞沉淀中提取基因组DNA。使用退火位点位于缺失区间之外的引物，对跨越CRISPR靶向外显子2的基因组区域进行PCR扩增。PCR条件如下：95°C 2 min；随后进行30个循环，每个循环包括95°C 15 s、55.7°C 30 s和72°C 3 min；最后于72°C延伸5 min，并于4°C保温。将扩增产物分别在1.25%（Smad1Δ）或2%（Smad5Δ）琼脂糖凝胶上进行电泳分离。目视确认存在大片段基因组缺失后，使用MinElute™ PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化剩余PCR产物，并送样进行Sanger测序。对SF20 mESC细胞系的基因组DNA进行PCR扩增后，获得了两种不同大小的PCR产物；使用Monarch® DNA凝胶回收试剂盒（New England Biolabs）分别回收各条带，并分别送样进行Sanger测序。使用ApE（A Plasmid Editor）软件将测序峰图与GRCm38小鼠（Mus musculus）参考基因组进行比对，以确定基因组缺失的大小和边界。
蛋白质印迹分析
将细胞悬液以1,000 rpm离心5 min，并重悬于1×
Pierce® RIPA缓冲液（Thermo Scientific），其中添加了1×蛋白酶抑制剂混合物（Roche）。裂解后的蛋白悬液在冰上放置15分钟，随后于4°C、14,000 × g条件下离心15分钟。取上清液进行SDS-PAGE，其余步骤按上述方法部分所述进行。
群体RNA测序与数据处理
样本采集、文库制备与测序
针对每种基因型，即对照（MM13）、Smad1Δ（C2、C34、C36）和Smad5Δ（SF20、SF27、SF43），在平行开展的三次独立分化实验（生物学重复）中，于不同时间点使用RLT缓冲液（Qiagen）获取全细胞裂解液。使用RNeasy mini试剂盒（Qiagen）提取RNA，并使用Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer评估其质量。使用Universal plus mRNA测序试剂盒（NuGEN）构建链特异性文库，并在NovaSeq S4的1.5条泳道上进行测序，每个样本至少生成4,000万条读段（第4天的C34样本除外，其读段数为2,400万条）。值得注意的是，4个样本文库制备失败（第0天-SF20、第0天-SF27、第3天-SF43、第9天-B4-ControlA），另有3个样本未能生成满足测序要求的文库（第3天-SF27、第5天-RA-SF27、第9天-RA-SF20）。为替换第0天至第5天的样本，进行了第四次分化实验，最终共对79个样本进行了测序。
数据处理
使用STAR比对软件将原始测序读段比对至
小家鼠（Mus musculus）
GRCm38参考基因组，并使用featureCounts（Subread软件包）生成基因水平的计数。在归一化之前，去除所有样本中总读段数少于10的基因。采用Pearson相关性分析和主成分分析（PCA）进行质量控制，以评估
重复样本间的相似性和基因型聚类。使用 R 中的 DESeq2 包进行差异表达分析。通过 DESeq2 的对比语句提取差异表达基因，对比包括：（1）WT、Smad1Δ 和 Smad5Δ 各自内部的时间效应；（2）第 0 天、第 3 天和第 4 天的基因型差异（Smad1Δ vs WT 和 Smad5Δ vs WT）。对于分化后期阶段，采用分组的 DESeq2 设计，对在 RA 或 RA+BMP4 培养基条件下于第 4 天、第 4.25 天、第 5 天和第 9 天采集的样本进行分析。在各基因型内，通过差异表达分析比较相同时间点（第 4.25 天和第 5 天）的 RA 与 RA+BMP4 条件。将校正后 p 值（padj）< 0.05 且 log2FoldChange 绝对值 > 1 的基因定义为显著差异表达基因。采用类维恩图重叠分析，鉴定第 4.25 天和第 5 天在 WT、Smad1Δ 和 Smad5Δ 背景下特异性或共同受调控的基因。值得注意的是，由于在获取 FASTQ 数据时发生文件级读取错误，排除了 3 个样本（day 0-ControlB、day 4.25-B4-ControlC、day 9-RA-C34）。
基因本体（GO）富集分析
使用 clusterProfiler 包进行基因本体富集分析。对生物过程进行富集检验，采用 Benjamini–Hochberg 方法进行多重检验校正，显著性阈值为校正后 p 值 < 0.05 且 q 值 < 0.2。
热图绘制
在每个时间点–基因型–培养基组合组内，对方差稳定化后的表达值取平均值，通过 Z 标准化进行行中心化，并使用 R 中的 pheatmap 包绘制热图。
ATAC 测序
我们对三个对照 mESC 细胞系（生物学重复）进行平行分化，并在第 0 天、第 3 天、第 4 天、第 4.25 天（6 小时 ± 该
添加BMP4）和第5天（添加或不添加BMP4处理24小时）。
样本制备与测序
样本按照既往描述的方法制备（Buenrostro et al., 2015）。使用预冷的0.25%胰蛋白酶消化培养物5分钟。按1:1的比例加入胰蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich），以终止胰蛋白酶活性。随后以1000 rpm离心收集细胞，并重悬于1× PBS中。对细胞进行计数，收集75,000个细胞，于4°C、500 × g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于50 μL预冷裂解缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 7.4；10 mM NaCl；3 mM MgCl₂；0.1% IGEPAL CA-630）中，立即于4°C、500 × g离心10分钟。将细胞核重悬于含有TDE1 Tn5转座酶和1× TD反应缓冲液（Illumina）的转座反应混合液中，于37°C孵育30分钟。按照制造商说明，使用MinElute™ PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化转座后的DNA。文库在NovaSeq S4平台上进行测序（XP工作流程，双端2 × 100 bp），每个样本平均获得约1.2亿条读段。
预处理
使用Trimmomatic剪除Nextera接头序列并去除低质量碱基。使用Bowtie2将修剪后的读段比对至GRCm39小鼠参考基因组。使用SAMtools将生成的SAM文件转换为BAM格式，按坐标排序并建立索引。使用Picard MarkDuplicates识别并去除PCR重复读段。使用BEDtools intersect结合mm39黑名单（v2），排除比对至ENCODE黑名单区域的读段。将每个条件下各生物学重复的过滤后BAM文件合并，并使用SAMtools重新排序和建立索引。使用MACS3进行峰调用，以鉴定开放染色质区域。使用deepTools生成归一化覆盖度轨道。
使用 bamCoverage 进行每百万计数（CPM）归一化，并将分箱大小设为 25 bp。
统一峰集与 ATAC 信号定量
以所有条件下鉴定到的峰顶为中心构建固定宽度的窗口，生成统一的调控区域集合，最终得到包含 141,592 个峰的统一峰集。使用 HOMER 软件套件中的 annotatePeaks.pl，基于 mm39 参考基因组对统一峰集进行基因组注释。使用 computeMatrix（deepTools）的参考点模式，以各峰中心为锚点，向两侧各延伸 500 bp，对统一峰集内的 ATAC 信号进行定量。使用 deepTools 中的 plotHeatmap 和 plotProfile 对染色质可及性进行可视化，展示各样本中以峰顶为中心的平均 CPM 信号。
基序富集分析
将处理组（+BMP4）与未处理组（RA）细胞之间归一化可及性信号的 log₂ 倍数变化 > 0.5 的统一 ATAC-seq 峰区域，定义为 24 小时时的处理响应性调控元件。使用 HOMER（findMotifsGenome.pl），基于 mm39 参考基因组对这些峰进行转录因子基序富集分析。
以启动子为中心的分析
将以每个已注释基因的转录起始位点（TSS）为中心、向两侧各延伸 2 kb 的窗口定义为启动子区域。使用 BEDtools intersect 将 24 小时时的 BMP4 响应性 ATAC 峰与启动子区域取交集，鉴定出 16 个染色质可及性增加的启动子区域。将这些区域映射至其最近的基因，并与相同时间点比较（第 5 天，±BMP4）的 bulk RNA-seq 数据取交集。在约 ±2 kb 的范围内，对展示候选基因（
Id2
、
Msx1
和
Wfikkn1
）启动子处 CPM 归一化 ATAC 信号的基因组浏览器轨道进行可视化
以每个基因注释的转录起始位点（TSS）为中心的窗口。
单细胞RNA测序
我们对对照（MM13）、Smad1Δ（C36）和Smad5Δ（SF43）小鼠胚胎干细胞（mESC）系进行平行分化，并在背侧中间神经元（dI）定向分化方案的第9天收集样本，用于单细胞测序。
单细胞悬液的制备
对于采用RA和RA + BMP4两种方案培养至第9天的对照、Smad1Δ和Smad5Δ细胞，使用0.25%的预冷胰蛋白酶解离5 min。按1:1的比例加入胰蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich），终止胰蛋白酶活性。随后以1000 rpm离心收集细胞，并重悬于1× PBS中。按照制造商的操作规程，使用MACS死细胞去除试剂盒（Miltenyi Biotec Inc.）去除死细胞。随后将洗脱得到的活细胞悬浮于含0.04% BSA（400 μg/ml）的1× PBS中，用于文库制备。
文库制备与测序
每个条件下使用约10,000个活细胞，按照10x Genomics Chromium单细胞3′试剂盒（v3.1化学体系）所述方案构建单细胞特异性cDNA文库。简而言之，使用10x Chromium控制器将细胞分配至纳升级乳液凝胶微珠（GEM）中。每个GEM含有一个独特的条形码，同一细胞生成的cDNA均携带该条形码。随后在GEM中裂解细胞，并进行cDNA合成和特征条形码标记。通过磁分离回收测序文库，并使用Agilent 2100 Expert高灵敏度DNA分析试剂盒评估cDNA的数量和质量。使用10B流动槽，在Illumina NovaSeq X Plus的两个泳道上对文库进行测序。
预处理与过滤
将原始10x Genomics计数矩阵导入Seurat。对于每个样本，依据以下标准对细胞进行过滤：
阈值根据质量控制（QC）图确定。具体而言，保留满足样本特异性标准的细胞，包括基因复杂度（nFeature_RNA > 250，上限因样本而异，为7,300–8,000）、总UMI计数（800 < nCount_RNA < 38,000–50,000）以及线粒体含量（percent.mt < 10%）。这些阈值独立应用于各基因型–处理条件数据集（RA或BMP4条件下的WT、Smad1Δ和Smad5Δ），以去除低质量细胞、空液滴和潜在的双细胞。在进行文库大小归一化、降维及后续下游分析之前，剔除不满足上述任一标准的细胞。
数据整合
完成各样本的质量控制后，将六个过滤后的Seurat对象（BMP4和RA条件下的对照、Smad1Δ和Smad5Δ）合并为一个Seurat对象，并使用SplitObject按基因型–处理组进行拆分。使用SCTransform对各子对象独立进行归一化，使用SelectIntegrationFeatures在所有组中筛选出排名前3,000的高变特征，并通过PrepSCTIntegration完成整合前的准备。使用FindIntegrationAnchor识别跨数据集的整合锚点，并通过IntegrateData利用这些锚点生成一个经过批次效应校正的整合对象；这两个步骤均采用SCT归一化。
降维、聚类与细胞类型注释
整合后，使用RunPCA对经校正的整合表达矩阵（integrated assay）进行主成分分析（PCA）。通过RunUMAP以前30个主成分为输入，计算统一流形逼近与投影（UMAP）。使用FindNeighbors基于相同的30个主成分构建共享最近邻图，进行无监督聚类，随后采用Louvain社区发现算法，分辨率设为
使用 FindClusters，参数设为 0.8。
使用 ScType 自动注释框架为每个 Seurat 簇指定细胞类型身份（Ianevski et al., 2022）。在经 SCT 标准化和缩放处理的 assay 上运行 ScType，并使用自定义的主要谱系标志基因文件。利用 ScType 生成的簇水平注释，在最终的 UMAP 可视化图中标注细胞，其中每个细胞均按 ScType 指定的主要谱系身份着色。为可视化并量化 NMP 衍生细胞的比例，将祖细胞、顶板、背侧祖细胞和神经元簇合并为一个“神经”类别，而将中胚层和血管簇合并为一个“中胚层”类别。为便于公平地直观比较不同样本的细胞类型组成，在绘图前对细胞进行下采样。确定所有基因型–处理组中的最小细胞数，并使用固定随机种子（seed = 123）从每组中随机抽取相同数量的细胞，以确保可重复性。使用保留的细胞生成下采样后的 Seurat 对象，并仅将其用于可视化（图 5D、5E、5G、5H）。
细胞类型比例分析
通过统计每个样本中分配至各簇的细胞数量，按基因型–处理组量化细胞类型比例。各比例以占每组总细胞数的百分比表示，并分别为六种基因型–处理组合绘制饼图。仅当某一类别占总细胞数的比例超过 5% 时，才在相应扇区内显示类别标签。
标志基因点图
为验证 ScType 的簇注释，使用一组经筛选的已知标志基因，针对所有已注释的细胞类型簇生成点图。使用经 SCT 标准化的 assay 对表达情况进行可视化，所用方法为
Seurat 的 DotPlot 函数。点的大小表示各细胞簇中表达给定基因的细胞百分比，点的颜色表示经缩放的平均表达水平。绘图前剔除了数据集中不存在的基因。
dP 和 dI 子集提取、重新聚类与注释
从完整整合对象中提取注释为背侧祖细胞或神经元的细胞，构建子集。按照前述方法进行 PCA、UMAP 和无监督聚类。使用 ScType 结合经整理的 dP 和 dI 标志基因集，对筛选后的神经细胞子集进行细胞类型注释。检查背侧祖细胞标志基因的表达后发现，dP3 细胞群未形成独立的细胞簇。为识别该细胞群，将最初注释为 dP2 且
Ascl1
归一化表达水平高于 0.25 阈值的细胞手动重新标记为 dP3。修订后的注释作为单独的元数据字段存储，并用于 dP/dI 子集的所有下游可视化和分析。值得注意的是，在聚类前的检查中识别出一个异常神经细胞簇，并量化了其在各基因型–处理组中的相对占比。由于该细胞簇所代表的细胞群占比较小且不一致，因此将其从所有后续分析中剔除。
按照前述方法生成下采样 UMAP 图（
图 6D、E、G、H
）。按照前述方法进行细胞类型比例分析。按照前述方法绘制标志基因点图。
RNA 速率分析
数据准备与预处理
使用 velocyto（
La Manno 等，2018
）为每个样本生成已剪接和未剪接 RNA 计数矩阵，并使用 AnnData 库将其加载至 Python 中。随后对每个样本进行筛选，仅保留完整神经细胞图谱中存在的细胞（
图6A）。将6个过滤后的样本合并为一个AnnData对象。为保持与Seurat分析的一致性，通过加载导出的嵌入坐标和聚类标签元数据，并将其映射至AnnData对象，将UMAP坐标和聚类注释直接从神经图谱Seurat对象转移至该对象。使用scVelo进行速度估计前的预处理。对基因进行过滤和归一化，剪接/未剪接共享计数的最低阈值设为20，总计数的最低阈值设为20。使用30个近邻构建最近邻图，并在邻域图上计算剪接和未剪接计数分布的一阶矩和二阶矩，为速度估计做准备。
整合神经图谱分析
使用scVelo中实现的随机模型估计RNA速度。按细胞簇检查剪接/未剪接读段的比例，以确认各细胞类型中均获得了足量的未剪接RNA。将速度向量投影至UMAP嵌入空间，并以流线图展示，细胞按所属细胞簇着色，以可视化dP/dI细胞群中转录轨迹的方向性和连续性。
对照细胞中驱动基因的鉴定
为表征基线转录动态，对来自RA和RA+BMP4两种方案的对照细胞评估了速度长度、置信度和转移置信度。使用velocyto中的scv.tl.rank_velocity_genes函数，对对照细胞各细胞簇中的速度基因进行排序，细胞按所属细胞簇分组，最低相关性阈值设为0.3。为选定的排名靠前的速度基因（包括Magi1和Smoc1）绘制相图。
Smad1Δ和Smad5Δ中的速度分析
数据集
为六个组（RA 和 RA + BMP4 方案下的对照组、Smad1Δ 组和 Smad5Δ 组）分别生成速度流线图。通过计算每个组–细胞簇组合的平均速度长度、速度置信度和速度转移置信度，对各组及各细胞簇的速度大小进行量化。
分离经 RA+BMP4 处理样本中的 dI1 细胞，并计算各组中每个基因的平均绝对速度大小。排除在所有组中速度信号均可忽略不计的基因。对于其余每个基因，采用 Wilcoxon 秩和检验对对照组与各突变组进行两两比较，并使用 Benjamini–Hochberg 假发现率方法对 p 值进行多重检验校正。分别在 Smad1Δ 和 Smad5Δ 的比较中筛选出突变细胞相较于对照细胞速度显著降低的候选基因（FDR < 0.05，delta > 0），并按效应量排序。
Nav3
和
Cadm2
被鉴定为在 Smad1Δ 和 Smad5Δ 细胞中相较于对照细胞平均速度大小显著降低的基因。
Nav3
和
Cadm2
的标准化表达量在各 RA+BMP4 处理组的 dI1 细胞 UMAP 图上进行可视化。
定量与统计分析
图像定量
为统计细胞核数量，使用 ImageJ 将图像转换为 8 位图像，调整其强度阈值以仅识别荧光标记的细胞核，然后使用 ImageJ 的颗粒分析工具对细胞核进行计数。
统计分析
数据以均值 ± SEM（均值标准误）表示。使用 Prism 软件进行统计显著性检验。所有情况下均将 p < 0.05 视为具有统计学显著性。
关键资源表
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结果
生成
用于研究背侧中间神经元命运决定的Smad1和Smad5敲除小鼠胚胎干细胞系
我们此前建立了两种定向分化方案（RA±BMP4），可由小鼠胚胎干细胞（mESC）生成全部类型的背侧中间神经元（dI）（图1A）。这些方案生成的dI在转录和功能上均与其内源性对应细胞无异（Gupta et al., 2024；Gupta et al., 2022；Rodriguez et al., 2026），表明这两种方案共同能够准确重现脊髓背侧的发育过程。简而言之，使用bFGF/CHIR处理mESC，使其在第3天获得具有神经和中胚层双向分化潜能的神经中胚层祖细胞（NMP）身份。随后，用视黄酸（RA）处理NMP两天，诱导其向神经谱系分化。为生成最背侧的dI，在第4天额外用BMP4处理NMP 24小时。至第9天，细胞强烈表达有丝分裂后神经元标志物（Myt1l和Tuj1；图1C、1D、1F、1G），同时表达背侧祖细胞（dP）标志物（Pax3；图1C、1F）和dI标志物，包括Lhx2（dI1）、Lhx1/5（dI2/dI4/dI6）及Lmx1b（dI5）（图1D、1G、1E、1F）。尽管两种方案生成的dP和神经元数量相当（图1I），RA+BMP4方案可富集dI1–dI3，而仅使用RA则会增加脊髓中间区域亚型dI4–dI6的数量（图1C–1J）（Andrews et al., 2017；Gupta et al., 2022）。
为初步了解第二信使信号传导在dI命运决定中的作用，我们评估了定向分化过程中Smad1和Smad5的水平及活性。既往研究表明，无论在体内（Hazen et al., 2012）还是体外（Gupta et al., 2024），发育中的脊髓背侧均不表达Smad8。在RA+BMP4分化的整个时间进程中，Smad1和Smad5（图1K）均维持相对恒定的水平，表明添加BMP不会影响Smad蛋白
水平。相反，在第4天添加BMP4后，处理6小时内即可检测到磷酸化（p；活化的）Smad1/5（图1K）。升高的pSmad水平持续24小时，直至第5天。然而，到第7天时，RA方案与RA+BMP4方案中的pSmad水平已相当（图1K、1L）。综上，这些数据明确了研究经典BMP信号通路下游、驱动背侧中间神经元（dI）命运特化的转录组变化的时间窗口，并提示RA方案中存在低水平的BMP信号传导。
为探究Smad1和Smad5在介导BMP依赖性转录程序中是否具有不同作用，我们构建了Smad1和Smad5敲除（Δ）小鼠胚胎干细胞（mESC）系。我们采用CRISPR–Cas9双切口策略（Ran等，2013），设计成对的向导RNA，以切除Smad1和Smad5基因座第2外显子中的起始密码子（图2A）。该方法成功切除了第2外显子（图2B–2D），从而针对每种Smad分别获得了三个独立的相应蛋白完全缺失的mESC细胞系（图2D）。Smad1或Smad5的缺失未改变常规传代过程中mESC的形态，也未改变Oct4、Nanog和Sox2等关键多能性标志物的表达（图2F）。
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图2.
Smad1和Smad5敲除mESC细胞系的构建
（A）CRISPR-Cas9双切口基因编辑策略。使用位于第2外显子两侧的向导RNA，删除（Δ）Smad1或Smad5转录本中的起始密码子，从而阻断蛋白质翻译。
（B）对三个独立的Smad1Δ细胞系（C2、C34、C36）和三个独立的Smad5Δ细胞系（Sf20、Sf27、Sf43）中跨越靶向区域的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，证实了第2外显子位点的基因组缺失。
（C）通过对PCR扩增产物进行测序并将其比对至
小鼠参考基因组，表明缺失断点与gRNA靶向切割位点精确对应。
(E) Western blot分析证实，所有Smad1Δ或Smad5Δ细胞系均携带无功能等位基因。
(F) 相差成像显示，Smad1Δ和Smad5Δ小鼠胚胎干细胞（mESC）的形态与同基因背景对照细胞系相似（F，上），并持续表达多能性标志物Oct4、Nanog和Sox2（F，下）。
比例尺：100 µm
WT、Smad1Δ和Smad5Δ细胞系在dI分化时间进程中的转录组分析
为鉴定在背侧中间神经元（dI）命运特化过程中受Smad1和Smad5调控的基因网络，我们在关键发育时间点对Smad1Δ（n=3个独立细胞系）、Smad5Δ（n=3个细胞系）及同基因背景对照（n=3份样本）mESC细胞系进行了群体RNA测序（Seq）（图3A）（Gupta等，2022）。这些时间点为：[1] 第0天，处于多能性状态的mESC；[2] 第3天，神经中胚层祖细胞（NMP）形成；[3] 第4天，视黄酸（RA）处理24小时后；[4] 第4.25天和[5] 第5天，分别为BMP4处理6小时和24小时后，此时细胞进入背侧祖细胞（dP）状态；以及[6] 第9天，dI分化（文库制备和质量控制后，n=75份样本，更多详情见方法）。
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图3。
Smad1/5在第3天NMP向神经谱系和中胚层谱系的命运定向中发挥相反作用
(A) 群体RNA测序实验的时间线（共81份样本）。按照实验方案，在所示发育时间点收集RNA。每种基因型均采用三个生物学重复，即分别来自三个独立构建的Smad1Δ和Smad5Δ mESC细胞系。
(B) 各时间点和条件下生物学重复均值之间的Pearson相关性。样本主要按发育阶段聚类，其中6–24期间形成一个高相关性区块
在添加BMP4后数小时内，表明在此时间窗口内转录状态高度相似。
(C, D) 主成分分析（PCA，C）显示，mESCs从第0天向背侧中间神经元（dIs，第9天）分化时呈现共同的轨迹。因子载荷（D）显示，Smad1Δ和Smad5Δ样本随时间推移逐渐偏离对照细胞系，这与转录紊乱随分化进程逐步累积的现象一致。
(E) 比较第0天与第3天样本的火山图显示，对照、Smad1Δ和Smad5Δ细胞系均表现出NMP相关基因（T、Cdx2、Nkx1.2）的一致上调，以及多能性基因（Tbx3、Klf4、Nanog）的一致下调，提示所有细胞系均成功获得NMP命运。
(F–I) 在第0天（F、G）和第3天（H、I），通过Pearson相关性分析（F、G）及火山图（H、I）比较Smad1Δ、Smad5Δ细胞系与对照细胞系。在这两个时间点，所有细胞系的转录状态均保持高度相关；然而，差异表达分析显示，相较于对照，Smad1Δ细胞中神经相关基因（Zic1、Sox1、Foxg1）的表达升高，而Smad5Δ细胞中中胚层相关标志物（Myf5、Asb4、Fabp4）的表达上调。
(J–L) 对第3天相较于第0天显著上调和下调的基因进行基因本体（GO）分析，结果显示这些基因富集于神经和中胚层相关生物学过程。
(M–N) 为进行验证，对培养细胞进行了Brachyury（T，红色）、Cdx2（绿色）、Sox2（红色）和DAPI（蓝色）免疫染色。表达Cdx2（M，n=10张图像）和Sox2（N，n=7）的Smad1Δ细胞数量减少。相比之下，表达T的Smad5Δ细胞数量增加，提示其具有中胚层特性。
比例尺：100 μm
显著性阈值：log₂倍数变化 < −1或 > 1，且校正后p值 < 0.05。相似性概率
对照组与实验组之间：* p<0.05，*** p<0.0005；双因素方差分析
主成分分析显示，样本主要按发育时间点聚类，并沿着从多能性状态到NMP状态再到神经状态的预期轨迹分布（图3C）。Smad1Δ和Smad5Δ细胞系遵循相同的总体时间进程，但其位置相对于对照组始终存在偏移（图3D），表明其转录状态发生了改变，而非分化过程被完全破坏。支持这一结论的是，Pearson相关性分析显示，Smad1Δ、Smad5Δ与对照样本在第0天（图3F）和第3天（图3H）均具有高度相关性。样本主要依据发育时间点而非遗传背景聚类，且差异在第9天最为显著（图3B）。比较Smad1Δ、Smad5Δ及对照细胞系第0天小鼠胚胎干细胞（mESC）的火山图也显示，差异表达基因相对较少（图3G）。
Smad1Δ和Smad5Δ mESC形成的NMP具有改变的神经中胚层分化潜能
我们进一步将各细胞系第3天的转录组与对照组第0天mESC的转录组进行比较，以评估Smad1Δ和Smad5Δ对NMP分化的影响。对照、Smad1Δ和Smad5Δ细胞均下调了多能性基因Tbx3、Klf4和Nanog的表达，并上调了包括Nkx1.2、Cdx2、T和Evx1在内的NMP标志基因的表达（图3E）。对第3天显著上调基因的基因本体（GO）分析显示，与中胚层和神经发生程序相关的条目均显著富集（图3J–3L）。综上，这些数据表明，Smad1或Smad5的缺失并不阻止NMP的形成。
尽管Smad1Δ、Smad5Δ与对照样本在第3天的转录组高度相关（图
3H），相较于对照组，观察到一些转录差异（图3I）。Smad1Δ细胞中参与早期神经发育和神经祖细胞维持的基因Zic1、Foxg1和Sox1的表达升高。相比之下，Smad5Δ细胞中中胚层相关基因（包括Myf5、Asb4和Fabp4）的表达升高（图3I）。因此，尽管这些Smad突变细胞获得了神经中胚层祖细胞（NMP）身份，但它们可能偏向不同的谱系分化轨迹。免疫组织化学结果支持这一假设：与对照组相比，表达Cdx2蛋白的Smad5Δ NMP更多，这与中胚层分化预备状态的增强一致（图3M）。相比之下，Smad1Δ NMP中的Cdx2和Sox2水平降低，提示其分化预备状态偏离中胚层分化轨迹（图3N）。
在背侧中间神经元（dI）分化过程中用BMP4刺激NMP可提高染色质可及性
接下来，我们评估了第4至第5天的染色质景观，以更好地理解向分化培养基中加入重组BMP4后发生的发育事件。鉴于染色质可及性的变化先于转录输出，该分析也为解读后续基因表达差异提供了框架。我们在第4天、第4.25天和第5天进行了转座酶可及染色质测序（ATAC-Seq），以捕捉加入BMP4后6小时和24小时的染色质可及性变化（图4A）。整合所有条件和时间点的峰后，得到了一套包含141,592个峰的统一ATAC-Seq峰集。约46%的峰定位于基因间区，表明可及染色质中占比最大的部分对应于远端调控元件（图4B）。
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图4。
第4至第5天的ATAC-Seq分析揭示了不同的表观基因组及
BMP4处理下游Smad1和Smad5的转录调控作用
(A) ATAC-Seq研究时间线示意图，用于评估BMP4处理前（第4天）和处理后（第4.25天和第5天）的染色质可及性变化。每个时间点均设置3个生物学重复（仅使用对照细胞系；n = 9个样本）。
(B) 将各样本的ATAC-Seq峰合并，构建统一的峰集（n = 141,592）。大多数峰位于内含子区域（46%）和基因间区域（37%），两者合计约占所有峰的83%。
(C, D) 差异可及区域的可及性图谱显示，从第4天到第5天，染色质可及性逐步增加。尽管在处理后6小时，BMP4处理样本与对照样本之间尚无显著差异，但到24小时时已出现明显的可及性变化。
(E) 基序富集分析鉴定出37种转录因子基序，这些基序在BMP4处理24小时后染色质可及性增加的区域中显著富集。
(F) 展示(E)中鉴定出的关键转录因子表达情况的热图显示，BMP4处理可迅速上调Lhx2（dI1）和Isl1（dI3）的表达。然而，Cdx2（中胚层）的表达逐步下调，尽管在BMP4处理24小时后，Cdx2基序仍保持可及。因此，BMP4处理可能选择性地稳定预先存在的可及区域。
(G, H) 同样，在添加BMP4后24小时，已知受BMP调控的基因（如Id2和Msx1）启动子区域的染色质可及性增加，同时伴随转录上调。该分析还鉴定出参与背侧命运特化的新型调控因子，如Wfikkn1；它是一种能够隔离BMP4的分泌型配体，可能参与限制BMP信号传导的负反馈机制。
(I–K) 基于
针对BMP4处理24小时后观察到的局部染色质重塑，分析了第5天对照组、Smad1Δ和Smad5Δ的群体RNA-Seq数据集中的差异基因表达。火山图显示，各细胞系中上调幅度最大的基因均为共有的经典BMP靶基因。热图进一步鉴定了各细胞系中特异性调控的基因，揭示了对BMP4的Smad特异性及共有转录响应。
(L) 维恩图显示，BMP4处理24小时后，Smad1Δ、Smad5Δ和对照细胞中上调或下调基因的重叠情况。Smad5缺失始终影响更多的基因。
(M-P) 对维恩图（L）中选取的基因子集进行GO分析。由Smad1和Smad5冗余性上调的298个基因富集于BMP信号通路相关条目
(M)。Smad1Δ和Smad5Δ细胞中共有的转录变化（172个上调基因、99个下调基因）与细胞外基质组织增强以及神经元迁移和细胞黏附减弱相关（N）。值得注意的是，Smad1缺失所特有的转录变化相对较少（O），而Smad5Δ则导致更广泛的转录重塑，涉及BMP的非经典功能，例如生物能量代谢调控的改变（P）。
为评估BMP4是否改变染色质可及性，我们考察了不同发育时间点和处理条件下的ATAC-Seq峰谱。在6小时，RA处理与RA+BMP4处理样本的染色质可及性谱基本相同，表明早期重塑程度极低。然而，到第5天，RA+BMP4处理样本的染色质可及性高于RA对照组（
图4C
）。这些变化局限于离散的调控元件，表明BMP4诱导了
局部而非全局性的染色质重塑（图4D）。
染色质可及性分析鉴定BMP4信号通路的靶基因
将BMP4处理24小时后相较于RA处理对照可及性升高（log2FC >0.5）的ATAC-Seq峰定义为BMP4响应区域。在154个BMP4响应区域中，约36%含有Smad结合元件（SBE）的核心序列“GTCT”（Shi et al., 1998）。HOMER基序富集分析鉴定出53种与BMP4诱导的染色质可及性变化相关的转录因子结合基序，其中37种存在于超过15%的靶序列中，包括Gata2、Gata6、Isl1、Lhx2及多个Hox基因的结合基序（图4E），由此鉴定出参与BMP4响应的新转录因子及已知转录因子。Lhx2和Isl1的表达分别标志着dI1和dI3细胞身份（Alaynick et al., 2011），且二者在BMP4处理6小时后均上调（图4F）。这些因子是BMP4的早期响应因子，因此可能驱动dI1/3亚型中BMP依赖性染色质重塑和基因激活所涉及的初始调控程序。在BMP4响应染色质中富集的转录因子基序中，有32种对应的转录因子并未同时在转录水平上调，提示这些基序反映了先前转录因子活性留下的残余染色质足迹。例如，Cdx2在第3天的NMP中高表达，但到第5天其表达下调（图3M、4F）；然而，其基序在BMP4处理24小时后仍然富集，提示BMP4能够选择性地稳定既有的可及区域。
接下来，我们试图鉴定BMP4处理后启动子可及性增加与转录上调相一致的基因。16个启动子区域的可及性在以下条件下显著增加：
鉴定了经BMP4处理24小时的样本，将其映射至最近的基因，并利用第4天和第5天的群体RNA-Seq数据进行了验证（图4G、4H）。该分析鉴定出Id2、Msx1和Wfikkn1，这些基因的转录起始位点附近均表现出染色质可及性增加，与启动子重塑相一致（图4G）。值得注意的是，Id2和Msx1是已知的BMP信号转录靶基因（Hollnagel et al., 1999；Le Dreau et al., 2018；Liem et al., 1995），这支持了BMP4通过局部的、与启动子相关的染色质可及性变化促进其激活的模型。此前尚未有研究表明Wfikkn1（含WAP、卵泡抑素/Kazal、免疫球蛋白、Kunitz及NTR结构域）参与脊髓背侧发育；然而，该基因编码一种分泌型多结构域蛋白，能够结合BMP4并拮抗GDF8和GDF11（Kondas et al., 2008；Szlama et al., 2010）。因此，BMP4可能通过动态诱导Wfikkn1表达建立负反馈机制，从而在神经分化过程中精细调控BMP配体的可利用性。
Smad1和Smad5在BMP4信号下游具有共同及不同的作用
ATAC-Seq分析显示，BMP4处理6小时（第4.25天）时的染色质重塑程度极低，而处理24小时后则出现了显著的局部调控变化（图4C、4D）。因此，我们聚焦于这一较晚时间点，利用第5天，即添加BMP4后24小时的群体RNA-Seq数据，评估对照、Smad1Δ和Smad5Δ细胞系之间的转录差异。对于每种基因型，将BMP4处理样本与匹配的仅经RA处理的对照样本进行比较，以鉴定BMP依赖性转录响应，并确定Smad1Δ、Smad5Δ及对照细胞中上调或下调基因的重叠情况（图4L）。
298个基因表达上调
在全部三个细胞系中均存在，分别占Smad1Δ和Smad5Δ样本中上调基因的45%和26%（图4L）。这一共有基因集包含已知的BMP靶基因，如Id1、Id2和Wfikkn1（图4I、4L）；GO分析得到的条目包括“对BMP的响应”和“Wnt信号通路”，与我们先前的研究结果一致（Gupta等，2022）（图4M）。由于这一响应需要Smad1或Smad5中的任意一种，R-Smad似乎以功能冗余的方式介导这些BMP响应性转录程序。相比之下，分别有67个和59个基因仅在对照/Smad1Δ细胞和对照/Smad5Δ细胞中上调（图4L），由此鉴定出受Smad1或Smad5选择性调控的候选靶基因（热图，图4J和图4K）。
我们进一步鉴定出172个上调基因和99个下调基因，这些基因在经BMP4处理的Smad1Δ和Smad5Δ细胞中表达，但在经相同处理的对照细胞中不表达（图4L）。这些基因仅存在于Smad1Δ和Smad5Δ数据集中，提示任一种R-Smad的缺失都会破坏共有的转录机制。对这些基因的GO分析提示其涉及细胞外基质组织、突触组织和神经细胞迁移相关通路（图4N）。最后，Smad1Δ细胞中特异性受调控的基因相对较少（175个），其GO条目富集程度很低（图4O）。相比之下，Smad5Δ细胞中特异性受调控的基因显著更多（1054个）（图4L）。GO分析提示，这些Smad5依赖性基因调控非经典或情境依赖性功能（图4P），包括此前研究所揭示的生物能量稳态（Fang等，2017）。综上，这些发现支持这样一种模型：Smad1和Smad5在介导……的过程中发挥共有及各自特异的转录作用
从NMP状态向dP状态转变，其中Smad5在调控对BMP4的应答中发挥更广泛的作用。
Smad1和Smad5在脊髓背侧谱系特化中发挥不同作用
为评估背侧谱系特化对Smad1和Smad5的需求是否存在差异，我们在RA±BMP4分化方案的第9天，构建了Smad1Δ、Smad5Δ及对照细胞的单细胞（sc）RNA-Seq图谱。为实现六个数据集之间的准确比较［RA-对照，n=13,822；RA-Smad1Δ，n=11,157；RA-Smad5Δ，n=10,616；RA+BMP4-对照，n=8,276；RA+BMP4-Smad1Δ，n=10,875；RA+BMP4-Smad5Δ，n=7,944］，我们将其整合为一个联合转录图谱（图5A）。鉴于NMP特化存在Smad依赖性变化（图3），我们首先评估了三个细胞系所产生的Foxc1⁺、Twist1⁺、Meox2⁺中胚层衍生细胞与Pax3⁺、Myt1l⁺、Msx1⁺神经衍生细胞的比例（图5B、5C，图S1）。在RA条件下，各基因型中均有约90%的细胞被归类为神经细胞（图5D）。添加BMP4后，对照组和Smad1Δ组中均有约25%的细胞沿非神经（中胚层）轨迹分化（图5E）。Smad5Δ组中这一比例进一步升高，非神经细胞群体占比约为40%（图5E），其中既包括中胚层细胞，也包括显著扩增的Sox17⁺、Col4a2⁺、Gata4⁺、Foxa2⁺胚外内胚层样细胞。这些发现支持如下模型：Smad5促使NMP偏向神经命运，同时抑制包括中胚层诱导在内的非神经命运（图5J）。
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图5.
Smad5缺失改变dI体外分化过程中的谱系特化
（A）Smad1（C36细胞系）经RA±BMP4定向分化所得scRNA-Seq数据集的整合UMAP图谱，
第9天的Smad5（SF43细胞系）及同基因背景对照细胞系（n=6个数据集）。对数据进行聚类分析，得到30个转录特征不同的细胞簇。
(B) 点图展示了用于界定NMP衍生的不同谱系身份的标志基因及其表达水平。
(C) 整合UMAP图谱展示了中胚层（珊瑚色）、神经（绿色）和胚外内胚层（橙色）谱系的分化轨迹。应激细胞以蓝色标示。
(D, E) 饼图及相应的样本特异性UMAP图谱，量化了各样本组中神经、中胚层和胚外内胚层衍生细胞的比例。在RA方案中，细胞命运决定未见明显差异；然而，在RA+BMP4方案中，Smad5Δ细胞系的中胚层和胚外内胚层细胞群特异性扩增。
(F) 整合UMAP图谱标示了六个主要谱系群及应激细胞群。
(G, H) 饼图及相应的样本特异性UMAP图谱，量化了祖细胞、顶板、背侧祖细胞和神经细胞群的比例。在RA方案中，Smad1Δ细胞系的顶板细胞群扩增，而神经细胞群相应减少。在RA+BMP4方案中，Smad1Δ和Smad5Δ细胞系呈现相同表型：祖细胞群增加，同时神经元数量减少。
(I) 柱状图汇总了采用RA ± BMP4方案诱导对照、Smad1Δ和Smad5Δ细胞系分化所得主要细胞谱系的百分比。
(J, K) 模型概述了Smad1和Smad5在指导NMP衍生细胞命运决定中的作用。Smad5在谱系决定的最早阶段发挥作用，阻止NMP进入中胚层分化轨迹（J）。随着分化
随着这一过程的推进，祖细胞向神经命运发展需要Smad1和Smad5共同参与（K）；此外，Smad1还可阻止祖细胞被引导至顶板命运。
随后，我们基于经典标志基因的表达，将神经类别进一步划分为几个主要谱系类别——增殖中的祖细胞、顶板细胞、背侧祖细胞和神经元（图5B、5F）。在RA+BMP4条件下，R-Smad响应外源性BMP4而被激活（图1N）；与对照相比，两种R-SmadΔ细胞系均出现祖细胞积累，同时神经元减少（图5H）。然而，在RA条件下，R-Smad由内源性BMP信号激活（图1L）；对照和Smad5Δ细胞系的细胞组成比例相近，而Smad1Δ细胞系中顶板细胞积累，同时神经元减少（图5G）。综上，这些数据表明，祖细胞启动分化过程需要两种R-Smad共同参与，但随后Smad1会特异性抑制祖细胞向顶板命运发展（图5K）。
最后，我们评估了Smad1和Smad5在背侧祖细胞（dP）和背侧中间神经元（dI）命运特化中的必要性。我们提取了dP和神经元的scRNA-Seq数据子集并重新聚类，构建了Smad1Δ、Smad5Δ及对照细胞的整合神经细胞图谱（图6A）。利用已确立的dP和dI标志基因进行注释（图6B），证实RA±BMP4方案能够诱导产生完整的dP（dP1–dP6）和dI（dI1–dI6）细胞群（图6C、6F）。dP表型仅在RA方案中观察到，在该条件下，两种R-Smad具有相反的作用。Smad5Δ导致dP1–dP3缺失，而Smad1Δ则使dP1和dP2的比例增加（图6D、6I），提示两种R-Smad在dP命运特化中发挥拮抗作用。dI表型
在两种方案中均观察到了这些现象（图6J）。最显著的是，与对照相比，Smad5Δ条件下最背侧的dI，尤其是dI1，显著且一致地减少，同时中间部位的dI命运相应增加（图6H、6I）。Smad1Δ条件下也出现了dI1缺失，但仅见于RA+BMP4方案，这可能反映出在BMP4信号增强时对Smad1的需求。免疫组织化学验证了这一dI1表型，证实Lhx2⁺ dI1细胞仅在Smad5Δ细胞系中显著减少（图6K、6L）。综上，这些数据支持如下模型：R-Smad在dI命运决定中发挥不同作用。Smad5发挥主导作用，通过反复发挥作用来指定最背侧的dI命运（图7M）。
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图6.
Smad1和Smad5在指定dI细胞命运中的需求存在差异
(A) 对注释为背侧祖细胞和神经元的细胞进行重新聚类，构建整合的神经细胞UMAP图谱，涵盖dP1–dP6和dI1–dI6的分化轨迹。根据RNA速率分析（图7），位于图谱边缘、似乎可产生dP2–dP6的一个细胞群被注释为“mdP”（多能背侧祖细胞）。
(B) 点图显示了用于确定神经细胞身份的标志基因及其表达水平。
(C–H) 整合的dP（C）和dI（F）图谱的UMAP，以及在RA ± BMP4方案下对照、Smad1Δ和Smad5Δ细胞系各样本的UMAP图谱（D、E、G、H）。RA方案可高效生成脊髓中间部位的dP/dI（dI4–dI6），而生成的最背侧dP/dI（即dI1–dI3）数量相对较少。在这些条件下，Smad5Δ细胞系的dP1和dP2形成受损（D），同时伴随数量相应减少的
dI1和dI2（G）。相比之下，Smad1Δ细胞系的dP1/dP2数量增加（D），但dI1/dI2数量未出现相应变化（G）。在RA+BMP4方案中，Smad1Δ和Smad5Δ细胞系的dP1/dP2（E）及dI1/dI2（H）数量均减少。
（I、J）柱状图汇总了采用RA ± BMP4方案时，对照、Smad1Δ和Smad5Δ细胞群体中dP（I）和dI（J）的百分比。
（K、L）为进行验证，对培养物进行了Tuj1（轴突，红色）、Lhx2（dI1，绿色）和Myt1l（神经元，蓝色）免疫染色。与既往观察结果一致（Andrews et al., 2017；Gupta et al., 2022），仅在RA+BMP4方案中产生大量dI1（L）。与转录分析结果一致，相较于Smad1Δ（n=9）或对照（n=10）分化培养物，Smad5Δ分化培养物中的Lhx2⁺ dI1减少最为显著（n=10张图像）。
比例尺：100 μm
对照组与实验组之间的相似性概率：** p<0.005；双因素方差分析
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图7。
Smad5是所有dI谱系维持正常转录动态所必需的
（A）对整合后的神经细胞图谱进行RNA速率分析，以推断dP细胞状态转变的方向和动态。流线化的速率矢量场显示，各dP/dI亚型均遵循独特的发育轨迹。dI2–dI6亚型起源于共同的mdP细胞群，该群体分支形成特定的dP亚型，继而分化为各自对应的dI细胞群。
（B）RNA速率指标显示了完整图谱及各个细胞簇中已剪接与未剪接转录本的比例。
（C、D）将对照RA±BMP4数据集中的速率幅值（C）和速率置信度（D）投射至UMAP嵌入图，显示RNA总体增加
相较于dI细胞群，dP各亚型中的RNA速率更高。一个显著的例外是dI4亚型，其在整个轨迹中均保持较高的RNA速率。
(E-F) 对照组RA±BMP4数据集中两个表现出差异性RNA速率的基因的相图。Magi1在所有dP细胞群中均表现为正速率（E），而Smoc1仅在dP4/dP5细胞群中表现为正速率。
(G-J) RA±BMP4方案下，对照组、Smad1Δ和Smad5Δ的UMAP图谱中速率向量场的流线表示（G、I）。平均速率向量长度值的热图显示，在两种RA±BMP4方案下，Smad5Δ均导致所有dP亚型的速率显著降低（H、J）。
(K) 对对照组、Smad1Δ和Smad5Δ细胞系中dI1细胞群的各基因速率大小进行定量。Nav3和Cadm2的速率降幅最大，且在Smad5Δ细胞系中最为显著。
(L) Nav3和Cadm2在Smad1Δ和Smad5Δ的dI1细胞中的表达依次降低，提示速率大小的降低反映了Nav3⁺/Cadm2⁺ dI1细胞发育进程受损。
(M) 在dI发育轨迹的命运特化过程中，多个阶段均需要Smad5。Smad5对于最背侧祖细胞群（dP1/dP2）和神经元群（dI1–dI3）的命运特化至关重要，同时抑制中间位置的dI细胞群（dI4–dI6）的形成。Smad1的作用范围则较窄，主要限制dP1细胞库的规模。
(N) RNA速率分析显示，除dI4谱系外，dP细胞簇的速率普遍高于dI细胞簇。我们提出，Smad5是维持祖细胞活性并调控其向分化的dI状态转变的转录程序的主要介导因子。
RNA速率分析鉴定调控dP状态转变的基因
为
为进一步解析R-Smad的作用，我们对整合后的神经细胞图谱进行了RNA速率分析，以推断dI细胞状态转变的方向和动态。所得的全局速率场显示，在整合图谱中，dP细胞定向流向各自对应的dI谱系，反映了预期的发育进程（图7A）。出乎意料的是，我们观察到一个转录特征独特的祖细胞簇（图6B）可产生dP2–dP6，提示其代表一个多能背侧祖细胞（mdP）库（图7A）。随后，我们分析了对照细胞的速率大小（图7C），以评估dI分化过程中不同亚型的转录组变化速度。dP细胞群的速率向量长度最高，与其处于过渡状态相一致（图7C）。相比之下，dI细胞群的转录动态减弱，与其已分化状态相一致；但dI4和早期dI5轨迹除外，二者仍保持较高的速率向量长度（图7C）。因此，dI4/dI5细胞在激活亚型特异性转录程序时，可能仍处于动态变化状态。
为鉴定驱动或标志这些细胞状态转变的基因，我们对各对照细胞簇进行了基于RNA速率的基因排序。该分析揭示了一些细胞簇特异性基因，其转录动态与速率方向高度相关。Magi1和Smoc1被鉴定为排名最靠前的两个RNA速率相关基因。Magi1在多个dP细胞簇中广泛表达（图7E），可能在调控细胞极性和细胞间黏附方面发挥普遍作用（Stetak and Hajnal, 2011）。相反，Smoc1特异性表达于dP4/5细胞群，提示其可能具有更
在这一谱系中的特定作用（图7F）。此前，一项独立的拟时序分析已将Smoc1鉴定为dP5标志基因（Gupta et al., 2024）；Smoc1还可作为BMP激动剂发挥作用，但该活性具有情境依赖性（DeGroot et al., 2023；Thomas et al., 2017）。因此，Smoc1可能通过BMP信号传导维持处于转变过程中的dP5细胞的速度幅值。总体而言，这项RNA速度分析捕捉到了dI状态转变背后具有生物学意义的转录动态。
Smad5调控dP和dI细胞簇的转录动态
在确定对照图谱中的基线速度动态后，我们研究了这些转录程序在Smad1Δ或Smad5Δ细胞中是否发生改变。我们量化了RA±BMP4方案中所有背侧细胞群的平均速度向量长度，发现R-Smad的缺失导致各dP细胞簇的速度幅值降低，其中Smad5Δ细胞的降幅最为显著（图7G–7J）。值得注意的是，此前被认为不依赖BMP的dP4–dP6细胞群，其速度向量长度的降幅最为明显。尽管dI细胞群整体上未受到广泛影响，但dI1轨迹是一个例外：与对照相比，Smad1Δ和Smad5Δ细胞中的速度向量减小（RA+BMP4方案，图7I、7J）。我们尝试鉴定驱动dI1细胞速度的基因，发现Nav3（神经元导航蛋白3）和Cadm2（细胞黏附分子2）是两个细胞系中速度降低最显著的基因（图7K）。这两个基因均在一个dI1细胞亚群中富集表达，而该亚群在Smad5Δ图谱中显著减少（图7L）。Nav3（Martínez-López et al., 2005；van Haren et al., 2009）和Cadm2（Frei et al., 2014）分别调控细胞骨架动态和细胞黏附，
提示Smad1Δ和Smad5Δ dI1神经元的神经突延伸、轴突导向及突触形成均受损。
尽管Smad1Δ和Smad5Δ的分化轨迹均表现出RNA速率降低，但这一效应在Smad5Δ细胞系中最为显著。因此，我们提出，Smad5是维持祖细胞活性并调控其向分化的dI状态转变的转录程序的主要介导因子（图7N）。
讨论
在本研究中，我们利用此前建立的小鼠脊髓背侧干细胞模型（Gupta等，2022），研究了在脊髓发育过程中介导BMP下游信号传导的R-Smad蛋白的作用。来自对照、Smad1Δ和Smad5Δ mESC细胞系的群体RNA测序和单细胞RNA测序数据集表明，在dI分化过程中的多个发育命运决策节点，R-Smad发挥着不同的必需功能。R-Smad的缺失并不妨碍mESC维持多能性（图2）或获得NMP身份（图3），提示在dI发育早期，R-Smad可能并非必需，或发挥功能冗余作用。在这些阶段之后，它们的作用开始分化，Smad5则在多个阶段反复发挥主要作用。Smad5的必需作用包括：[1]促使NMP向神经谱系分化，这可能通过阻止其分化为中胚层衍生细胞实现（图5）；[2]促进dP1/dP2和dI1/dI2的生成，同时限制中间部dI4–dI6细胞群的命运特化（图6）；以及[3]维持所有dP细胞群的转录动态（图7），因为通过RNA速率衡量的dP转录变化速率在Smad5Δ细胞系中普遍降低。相比之下，Smad1的作用是阻止祖细胞获得RP命运，并限制其规模
dP1细胞群。
这些研究还产生了新的资源，包括ATAC-seq和RNA速率图谱，增进了我们对脊髓背侧发育机制的理解。这些数据集还可用于鉴定BMP4响应基因，以及与BMP信号发挥调控作用的其他发育情境相关的基因组区域（图4）。总体而言，这些发现开始揭示Smad第二信使如何将共同的上游信号转化为多样化的细胞结局。功能特异性至少部分是通过各个下游信号转导因子彼此不同且非冗余的活性实现的。
Smad1/Smad5功能模型
Smad5是介导BMP4驱动dP1/dP2命运指定和dI1/dI2分化的关键因子，这一观察结果与我们此前的体内研究总体一致（Hazen et al., 2012）。这些研究利用条件性遗传学方法，在胚胎第10.5天（E10.5）的小鼠胚胎中分别去除Smad1或Smad5。我们发现，Smad5缺失而非Smad1缺失会导致Atoh1（Math1）⁺ dP1祖细胞和Lhx2⁺ dI1神经元数量减少。本次体外研究更进一步，因为我们不仅能够以更精细的分辨率解析对受体调控型Smad（R-Smad）的需求（图6I、6L），还能够更全面地考察所有背侧祖细胞（dP）的分化行为（图7N），从而更完整地揭示dI分化对Smad5与Smad1的不同需求。我们此前研究的另一项主要发现是，Smad1缺失而非Smad5缺失会导致轴突生长缺陷（Hazen et al., 2012）。尽管轴突导向表型并非本次研究的重点，但我们确实观察到，在第9天的Smad1Δ培养物中，轴突生长受到严重损害（图6K），并且
与轴突发生相关的转录特征下调（数据未显示）。支持 Smad1 发挥这一作用的是，已有研究表明，Smad1 是再生相关基因（regeneration-associated gene，RAG）应答的一部分；RAG 是一组轴突损伤后轴突生长所必需的基因（Saijilafu et al., 2013；Zou et al., 2009）。
另一种相反的模型认为，决定 BMP 信号应答结果的是 Smad1/5 活性的综合强度，而不是单个 R-Smad 的身份（Le Dreau et al., 2012；Le Dréau et al., 2014）。我们的研究结果对将信号强度视为调控变量这一概念提出了两点解释上的疑虑。第一，先前被解释为定量性信号强度效应的现象，实际上可能反映了 Smad1 和 Smad5 在不同细胞过程中发挥的性质不同的作用之总和，而这些作用在体内很难加以区分。第二，在我们的体外模型系统中，在外源性 BMP4 信号条件下，即在分化方案中直接补充 BMP4 时，与 RA 方案中 BMP 信号的内源性激活相比，我们观察到了明显不同的结果。只有在 RA+BMP4 方案中，Smad1 和 Smad5 才似乎在 dI 指定过程中发挥冗余作用（图 6D、6E、6G、6H）。我们提出，提高 BMP4 浓度（可能达到饱和水平）或许会掩盖各个 R-Smad 所发挥的不同功能。这一解释与信号强度模型存在一个重要差异：我们并不认为信号强度决定细胞命运结果且 R-Smad 可相互替代，而是提出，信号强度决定了这两个 R-Smad 在功能上彼此区别的程度。在 BMP 通路激活水平较高时，这一水平可能会……
在非生理性条件下，Smad1 和 Smad5 的功能具有冗余性。相比之下，在较低的信号强度下，即可能更接近生理水平的条件下，R-Smad 对神经祖细胞行为产生定性不同的影响。
对 BMP 信号转导机制的启示
尽管既往研究曾提出 Smad1 和 Smad5 在功能上具有冗余性（Arnold et al., 2006；Retting et al., 2009；Wong et al., 2012），我们的研究表明，二者可以通过彼此不同且互不重叠的机制发挥作用。这一发现对当前的主流观点提出了挑战。该观点认为，BMP 通路的特异性主要源于配体–受体组合或细胞外调节因子；而我们的研究则强调，R-Smad 的差异性利用是信号多样性中一个长期未被充分认识的来源。未来的研究将进一步确定，在其他组织中，BMP 通路的选择性在多大程度上依赖于特定的 R-Smad，并探讨这一现象是否也适用于介导 TGF-β 信号传导的 R-Smad——Smad2 和 Smad3。既往研究表明，Smad1 和 Smad5 在造血过程中也具有不同的功能（McReynolds et al., 2007）。
尽管我们的研究结果表明，Smad1 和 Smad5 对转录具有差异性调控作用，但造成这些差异的机制仍有待阐明。R-Smad 本身的 DNA 结合亲和力较弱，其基因组结合主要通过与辅助因子的相互作用得到稳定（Budi et al., 2017；Shi et al., 1998；Yoon et al., 2011）。如果 Smad1 和 Smad5 在招募辅助因子的能力方面存在差异，那么二者不同的转录作用可能源于 DNA 结合亲和力或结合位点选择性的改变。R-Smad/co-Smad4 复合物的化学计量关系也可能影响 DNA 结合亲和力或特定的转录输出。最后，磷酸化和
已有研究表明，连接 R-Smad 的 MH1 和 MH2 结构域的富脯氨酸连接区中的泛素化位点可改变 R-Smad 的核输入和核输出（Kamato et al., 2020；Wrighton et al., 2009）。这些位点在 Smad1 和 Smad5 之间存在差异，可能导致二者进出细胞核的转运过程受到不同调控，从而促成其各自不同的功能作用。
Smad5 的非经典作用
这些研究也支持此前的观察结果，即 Smad5 具有不同于 Smad1 的非经典功能。最值得注意的是，细胞内 pH 的波动可驱动未活化的 Smad5 进入细胞质，并在其中与己糖激酶 1 结合，以增强糖酵解并维持细胞生物能量稳态（Fang et al., 2017）。我们的生物信息学数据集一致显示，与 Smad1 缺失相比，Smad5 缺失会导致更广泛的转录组紊乱（图 4）。经 BMP4 处理 24 小时后，Smad5Δ 图谱中有 1054 个基因出现特异性表达失调（图 4P），而 Smad1Δ 图谱中仅有 175 个（图 4O）。GO 分析显示，下调基因涉及“线粒体 ATP 合成”和“对营养水平的响应”等功能类别，支持 Smad5 在细胞能量代谢中发挥作用（图 4P）。鉴于代谢程序与神经祖细胞的增殖和分化紧密耦联，这种生物能量缺陷可能解释了为何 Smad5Δ 祖细胞的 RNA 速率普遍降低。综上，受 Smad5 调控的基因集将成为进一步探究 Smad5 其他非经典功能的宝贵资源。
RNA 速率分析为 dI 发育提供的新见解
我们进行了 RNA 速率分析，以评估 R-Smad 是否对 dI 发育的转录动态产生不同影响。这
分析得出了若干出乎意料的发现。首先，我们鉴定出一个在转录层面具有独特特征的细胞簇，即多能背侧祖细胞（mdP）群体，速度矢量提示该群体可产生dP2–dP6群体（图7A）。这一细胞簇可能代表了背侧中间神经元（dI）发育过程中一种长期以来被推测存在、但始终难以捕捉的多能中间态，具有产生特定类别背侧祖细胞（dP）的潜能。这一发现还提示，dP1的产生独立于mdP，可能发生得更早，或经由不同于其他dP亚型的独立谱系产生。其次，主要由Smad5介导的BMP信号传导，是在dP分化过程中维持全局速度场强度所必需的（图7G–7J）。在缺失Smad5的情况下，所有dP细胞簇的转录动态均有所减弱，其中也包括此前被认为不依赖BMP的亚型（图7N）（Gupta and Butler, 2021）。因此，BMP信号传导对祖细胞状态转换的调控范围比以往认识的更为广泛。它既维持驱动dP完成分化过程的转录程序，也指导最背侧dI的模式形成。
最后，我们观察到，dI在分化时通常表现出转录动态减弱。但有两个显著的例外：dI4和早期dI5亚型仍保持较高的速度幅值（图7C）。值得注意的是，在哺乳动物脊髓体内，dI4和dI5是数量最多的中间神经元群体（Gupta et al., 2025；Roome et al., 2026），这提示其持续的转录动态可能是其数量扩增的基础，使这些群体能够达到在脊髓神经回路中发挥功能所需的规模。与持续的转录活性相一致，这些
随着时间的推移，这些细胞群体分化为数量惊人的、功能各异的亚型（Gupta et al., 2025）。未来的研究将确定，在这些谱系中观察到的较高速度是否反映了持续的命运细化、持续的增殖活动，或终末分化的延迟。
用于鉴定调控脊髓背侧发育关键基因的新资源
塑造脊髓背侧模式并由此指定不同 dP 和 dI 细胞群体的机制，目前尚未得到充分阐明。这些研究还建立了多种资源，可用于鉴定调控 BMP 信号传导并驱动 dP/dI 命运指定的基因。
我们构建了一个 ATAC-Seq 图谱，描绘 BMP4 处理所引起的染色质可及性变化，并获得了来自对照、Smad1Δ 和 Smad5Δ 细胞系的配套群体 RNA-Seq 数据。这些资源相结合，使我们能够将 BMP 依赖性的染色质重塑与转录反应直接关联起来。利用这一方法，我们鉴定出 Wfikkn1 是发育中脊髓背侧内受 BMP4 诱导表达的基因。Wfikkn1 是一种分泌蛋白，能够与 BMP2 和 BMP4 结合，但其作用是将二者隔离，而非拮抗其活性（Szlama et al., 2010）。因此，Wfikkn1 可能发挥微调 BMP4 信号传导的作用，而非充当经典的拮抗因子。在这一模型中，Wfikkn1 参与负反馈环路：BMP4 诱导其表达，而它通过隔离 BMP4，进而塑造脊髓背侧发育过程中 BMP 信号的空间作用范围。这一模型与 FGF 和 Hedgehog 信号通路类似，后两者也分别诱导自身的信号减弱因子 Sprouty 和 Patched。未来的研究将在体内评估 Wfikkn1 在发育中脊髓内的作用，包括确定其空间分布。
我们还构建了一个
RNA速率图谱可用于鉴定特定dP细胞群中具有动态转录模式的基因。这些dP特异性候选驱动基因可能发挥关键作用，促使祖细胞向各自的dP亚型转变，从而填补我们对脊髓背侧发育认识中的一个重要空白。鉴定这些驱动基因具有转化应用潜力：现有的定向分化方案无法产生纯的dI亚型，且某些谱系的细胞比例不足。通过阐明引导dP发育进程的转录程序和发育轨迹，可利用这些基因优化现有分化策略，并生成明确的dI细胞群，用于再生医学或细胞替代治疗。
总结
综上所述，这些发现表明，Smad1和Smad5在脊髓背侧具有各自独特的作用，而非在功能上可以相互替代。我们还建立了重要的研究资源，有助于未来研究揭示导致这些差异的遗传机制。
利益冲突
无利益冲突需要声明。
作者贡献
S.G.¹、S.G.²和S.J.B.构思了本研究。S.G.²设计并主导了用于构建Smad1Δ和Smad5Δ小鼠胚胎干细胞（mESC）系的CRISPR实验，B.C.和A.D.提供协助。S.G.¹完成了所有体外分化实验，G.G.D.R.和C.R.协助进行细胞培养维护和样本采集。S.G.¹分析了批量RNA测序和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，Y.V.进行了ATAC-seq分析。S.G.¹进行了免疫组织化学（IHC）分析，C.R.进行了蛋白质印迹分析。本文由S.G.¹和S.J.B.撰写，并由S.G.¹、S.G.²和S.J.B.修订。
致谢
我们谨向Aparna Bhaduri、Bill Lowry致谢，
感谢 Karen Lyons、Bennett Novitch 以及 Butler 和 Novitch 实验室的成员参与讨论。本研究获得以下资助：授予 S.G.¹ 的 Whitcome 博士研究生奖学金及美国国立卫生研究院（NIH）基因组分析与解读培训项目（T32HG002536）奖学金；授予 S.G.² 的加利福尼亚大学洛杉矶分校（UCLA）Broad 干细胞研究中心（BSCRC）博士后奖学金；授予 A.D. 的 Lawrence Kruger 本科生研究奖学金；授予 B.C.、C.R.、G. G. del R. 和 Y.V. 的加利福尼亚再生医学研究所（CIRM）“研究桥梁”项目（EDUC2-12718）资助；以及授予 S.J.B. 的 NIH（R01NS123187）和 Marcus 基金会（4492）研究经费。
已声明的资助方信息
美国国立卫生研究院（NIH），T32HG002536，R01NS123187
加利福尼亚再生医学研究所（CIRM），EDUC2-12718
Marcus 基金会，4492
加利福尼亚大学洛杉矶分校 Broad 干细胞研究中心
Lawrence Kruger 本科生研究奖学金
脚注
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关键词：BMP信号转导 · Smad1与Smad5 · 胚胎干细胞分化 · 背侧中间神经元 · 细胞命运决定 · 脊髓发育
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