滤泡性淋巴瘤中诱发复发的癌症持留细胞|北京沫之东生物技术有限公司

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摘要

滤泡性淋巴瘤（FL）是一种无法治愈、典型的复发缓解型癌症，这意味着存在能够在一线治疗后存活并促使疾病复发的治疗持续性细胞¹⁻³。然而，由于治疗结束后立即采样在伦理和实践层面均存在困难，这类持续细胞仍难以在患者中直接研究。我们利用一种经过遗传学定义的小鼠模型，可在一线 R-CHOP 治疗后立即采集持续细胞，并前瞻性分离和进行功能性鉴定，确定了能够促成复发的癌症持续细胞（CPC）。CPC 是一种具有较强生发中心再进入能力、类似 IgM 记忆 B 细胞的细胞状态。该状态是异质性残留细胞群中的一个独立组成部分，表明残留病灶具有多克隆性，复发潜能可能取决于哪些细胞存活下来，而不仅仅取决于残留肿瘤负荷。通过整合小鼠 CPC 与人类 FL 数据集，我们发现，在诊断时即可检测到类似的转录程序，且在多个独立队列中，该程序在临床结局较差的患者中富集⁴˒⁵。这些发现支持这样一种观点：复发风险与一种保守、与基因型无关且在治疗前已存在的 CPC 程序相关。为探索其治疗脆弱性，我们建立了可扩展的体外平台来模拟 CPC 样状态，并利用该平台发现此类细胞对组蛋白去乙酰化酶抑制敏感。罗米地辛和帕比司他在体外杀伤 CPC 样细胞，并减少了 R-CHOP 治疗后体内及患者来源类器官中的治疗持续性细胞。综上，这些数据界定了 FL 中一种可操作的 CPC 状态，并提供了经验证的临床指标和可立即检验的治疗切入点，为通过靶向 CPC 实现 FL 的持久控制开辟了策略。

法国里昂国际感染病研究中心淋巴瘤免疫生物学团队，法国国家健康与医学研究院（INSERM）U1111/法国国家科学研究中心（CNRS）UMR5308

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Gilles Salles

美国纽约州纽约市纪念斯隆凯特琳癌症中心医学部淋巴瘤科

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Michael Howell

英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所高通量筛选平台

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Hans Christian Reinhardt

德国北莱茵-威斯特法伦州埃森大学医院血液科与造血干细胞移植科

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Jude Fitzgibbon

英国伦敦玛丽女王大学巴茨癌症研究所癌症演化中心

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Jessica Okosun

英国伦敦玛丽女王大学巴茨癌症研究所血液肿瘤中心

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Lingling Zhang

英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所免疫与癌症实验室

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通信作者：

dinis.calado{at}crick.ac.uk

Dinis Pedro Calado

英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所免疫与癌症实验室

英国剑桥巴布拉汉姆研究园区巴布拉汉姆研究所免疫与癌症实验室免疫学项目

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摘要

滤泡性淋巴瘤（FL）是一种无法治愈、典型的复发缓解型癌症，这意味着存在能够在一线治疗后存活并引发疾病复发的治疗持留细胞¹⁻³。然而，由于治疗后立即取样在伦理和实践层面均颇具挑战，因此难以直接在患者中研究这些持留细胞。我们利用一种遗传学定义的小鼠模型，可在一线 R-CHOP 治疗后立即采集持留细胞，并据此前瞻性分离出引发复发的癌症持留细胞（CPC），并对其进行功能性鉴定。CPC 是一种 IgM⁺、具有记忆样特征的 B 细胞，具有较强的重新进入生发中心的能力。这一状态是异质性残留细胞群中的一个独立组成部分，表明残留病灶具有多克隆性，且复发潜能可能取决于哪些细胞得以存活，而不仅仅取决于残留肿瘤负荷。通过整合小鼠 CPC 与人类 FL 数据集，我们发现，在诊断时即可检测到相似的转录程序，且在多个独立队列中，该程序在临床结局较差的患者中富集⁴˒⁵。这些发现支持如下观点：复发风险与一种在治疗前即已存在、且不受基因型影响的保守 CPC 程序相关。为探索其治疗易感性，我们开发了一种可扩展的体外平台，用于模拟 CPC 样状态，并借此发现其对组蛋白去乙酰化酶抑制的敏感性。Romidepsin 和 panobinostat 可在体外杀伤 CPC 样细胞，并在体内及患者来源的类器官中减少 R-CHOP 治疗后的治疗持留细胞。总之，这些

这些数据界定了 FL 中一种可进行研究的 CPC 状态，并提供了经验证的临床读出指标和可立即检验的治疗切入点，为通过靶向 CPC 实现 FL 持久控制开辟了新策略。

正文

滤泡性淋巴瘤（FL）是最常见的惰性非霍奇金淋巴瘤，也是典型的缓解复发型癌症，目前仍无法治愈。以利妥昔单抗为基础的一线免疫化疗（R-CHOP：利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松龙；或 R-苯达莫司汀）可使大多数患者达到缓解。然而，24 个月内早期复发（POD24）以及转化为侵袭性弥漫大 B 细胞淋巴瘤均与不良预后相关。由于现有临床

和分子工具

的前瞻性应用价值有限，这些患者只能在事后识别

，从而限制了根据风险进行早期干预的机会。若有一种在诊断时即可测量、且在机制上与复发相关的细胞生物标志物，便可实现合理的风险分层。

缓解复发型癌症意味着存在一群能够在治疗后持续存活的细胞。在 FL 中，纵向系统发育分析支持存在一种形成复发的癌症持留细胞（CPC）

–

；这类细胞携带标志性的 t(14;18) 易位，以及染色质修饰基因（如 CREBBP 和 KMT2D）的早期改变

–

。CPC 可持续存在数年，甚至存在于其他方面健康的个体中

–

。尽管如此，CPC 从未被分离或进行功能性定义，因此无法开展靶向 CPC 的治疗

。一个核心障碍是，在患者中无法于 R-CHOP 治疗后立即采样获取治疗后持续存活的细胞。

在此，我们通过采用以小鼠为先的研究设计克服了这一障碍，使治疗后可立即采集持续存活的细胞，从而能够对其进行前瞻性分离和功能性定义。

因此，复发起始CPC来源于异质性残留细胞库，从而将“残留疾病”与“复发潜能”区分开来。CPC是一种类似IgM⁺记忆B细胞（MBC）的亚群，具有较强的再次进入生发中心（GC）的潜能，这与FL发病机制以GC为中心的生物学特征相一致

–

。我们将CPC程序转化为患者层面的基因特征，该特征可在诊断时定位这一细胞状态，并在独立队列中对风险进行分层

，提示存在一种不依赖基因型的起始细胞程序，可立即用于基线分析和纵向监测。借助可扩展的类CPC平台，我们揭示了其对组蛋白去乙酰化酶活性的依赖，并证明罗米地辛和帕比司他可杀伤CPC，由此确定了一条可用于实现持久疾病控制的可干预治疗轴。

一线免疫化疗揭示持续存在的细胞

在整合的FL患者数据集中（n=76），组蛋白修饰基因的克隆性改变较为常见，且在诊断、复发和转化时均可检测到，表明这些改变在FL演进早期即已出现

–

。据推断，CREBBP和KMT2D改变分别存在于67%和62%的病例中，并位于CPC储库内；51%的患者携带≥2个染色质相关基因突变，其中最常见的是CREBBP-KMT2D突变组合（

图1a,b

）。这些模式表明，表观遗传失调是复发起始细胞状态的标志性特征。

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图1：

一线治疗揭示持续存在的细胞。（a）

整合公开可用的配对样本外显子组测序数据，包括诊断时、复发FL及转化FL样本。

（b）

UpSet图展示携带≥2个染色质修饰基因（

CREBBP

、

KMT2D

、

EP300

和

EZH2

）突变的患者中各突变的频率及共现情况。

（c）

等位基因示意图】【。

WT 和 BCK 小鼠中的构型。两者均携带 Rosa26 等位基因，其中包含 loxP-stop-loxP-eYFP（WT）或 BCL2-IRES-GFP（BCK）盒。BCK 小鼠还携带由 loxP 位点侧翼包围的 CREBBP 第 9 外显子和 KMT2D 第 16–19 外显子。

(d) Kaplan–Meier 生存曲线比较 BCK（n=22）和 WT（n=10）小鼠。

(e) 脾脏切片的代表性免疫组织化学（IHC）图像；比例尺 = 400 μm。

(f) 实验时间线。

(g) 安慰剂（同型对照抗体 + 生理盐水）或 R-CHOP 治疗小鼠中，每 10⁶ 个脾细胞所含宿主来源（CD45.1⁺）B 细胞的绝对数量。均值 ± SEM；安慰剂组 n=7，R-CHOP 组 n=8。

(h) 供体来源（CD45.2⁺）B 细胞的流式细胞术门控策略。

(i) R-CHOP 治疗小鼠中，每 10⁶ 个脾细胞所含供体来源（CD45.2⁺）B 细胞的绝对数量。均值 ± SEM；WT 组 n=8，BCK 组 n=8。

(j, k) 安慰剂治疗受体小鼠中，BCK 供体细胞内生发中心 B 细胞（GCB）和记忆 B 细胞（MBC）的门控策略及定量分析。均值 ± SEM；n=7。

(l, m) R-CHOP 治疗受体小鼠中，BCK 供体细胞内 GCB 和 MBC 的门控策略及定量分析。均值 ± SEM；n=8。

(n–p) 安慰剂或 R-CHOP 治疗小鼠中，BCK MBC 内 IgM⁺ 和 IgM⁻ 细胞的门控策略及定量分析。均值 ± SEM；安慰剂组 n=7，R-CHOP 组 n=8。

每个点代表一只小鼠。(d) 中的数据采用双侧 log-rank 检验；(g, k, m, o 和 p) 中的数据代表两次独立实验。*P ≤ 0.05；P ≤ 0.01；*P ≤ 0.001；**P ≤ 0.0001；ns，差异无统计学意义（双侧 Student’s t 检验）。(i) 采用双侧 Mann–Whitney 检验。*P ≤ 0.001。

为模拟这一状态，我们构建了 BCK 小鼠（Cd79a-cre；R26-BCL2^LSL；Crebbp^+/fl；Kmt2d^fl/fl）²¹–²⁴，并通过 GFP 表达标记 cre-loxP 重组（图 1c）。不同于既往策略²⁵，该设计从早期前 B 细胞阶段开始驱动 BCL2 表达，处于……

t(14;18)的发育窗口

，并重现了FL中常见的CREBBP杂合性缺失与KMT2D纯合性缺失组合

。与Cd79a-cre; R26-YFP^LSL对照组（WT）相比，BCK小鼠的生存期缩短（约22周），并出现脾肿大以及具有滤泡增生性结构的FL样组织形态（Fig. 1d,e）。

鉴于FL的发病机制以生发中心（GC）为核心

，我们将BCK与SWHEL免疫球蛋白敲入模型结合，通过抗原特异性鸡卵清溶菌酶（HEL）免疫

，同步并精确控制细胞进入GC。随后，我们将初始BCK和WT CD45.2⁺ B细胞进行竞争性过继转移，移入完全具备免疫功能的同基因背景CD45.1⁺宿主（Supp. Fig. 1a）；供体细胞占总B细胞的比例不超过2%，以模拟健康个体中观察到的低频突变细胞

–

。该实验设计可明确追踪供体克隆的命运，同时避免新生成突变细胞带来的混杂影响。经HEL免疫

后，BCK细胞促使GC增生，向记忆B细胞（MBC）和浆细胞的分化减少，暗区（DZ）与明区（LZ）之比升高（Supp. Fig. 1b-g）；这与CREBBP和KMT2D在GC退出及B细胞分化中的已知作用一致

–

。与WT相比，BCK细胞的增殖和凋亡均减少，这与BCL2的抗凋亡和抗增殖作用相符

（Supp. Fig. 1i,k）。

为检验能否识别治疗后持续存留的细胞

–

，我们将来自无肿瘤供体（约8周龄）的初始BCK或WT B细胞转移至免疫功能完整的宿主。免疫后第7天，小鼠接受适用于小鼠的R-CHOP治疗；第14天取脾脏进行分析（Fig. 1f）。R-CHOP有效清除了宿主内源性CD45.1⁺ B细胞，并根除了WT供体B细胞（Fig. 1g-i）。其中

相反，部分 BCK 供体细胞得以存留（图 1h,i），且主要呈 MBC 样表型（CD38^hi^ CD95^lo^ IgD^neg^）；GC BCK 细胞则被有效清除（图 1j–m）。存活细胞表现出显著的 IgM 保留现象^19,35,36^（图 1n–p）。这些数据表明，IgM 表达与 CPC 持续存留有关。

遗传学、建模及治疗挑战实验共同表明，携带 CREBBP/KMT2D 缺失并伴有 BCL2 过表达的 B 细胞，能够以 IgM⁺、MBC 样细胞群的形式在一线免疫化疗后存活，由此形成一种治疗后持续存在的状态，其特征符合复发奠基细胞的身份。

残留病灶可分为三种 MBC 样状态

为界定治疗后持续存留的细胞，我们对接受 R-CHOP 治疗的受体小鼠中 CD45.2⁺ 供体来源的 BCK 细胞进行了 scRNA-seq 分析，并同时分析了安慰剂处理小鼠中的 BCK 细胞及自发形成的 BCK 肿瘤（图 2a）。InferCNV 分析显示，R-CHOP 大幅清除了肿瘤中存在大规模染色体改变的细胞，使残留细胞群的拷贝数改变相对较少（图 2b,c）。因此，治疗后持续存留的细胞在分子特征上不同于完全转化的细胞，这与其祖细胞样状态相符。

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图 2：残留病灶可分为三种 MBC 样状态。（a）实验设计。从年轻 BCK 小鼠脾脏中分离初始 B 细胞，并将其转移至 CD45.1⁺ 野生型受体小鼠体内。受体小鼠经 SRBC-HEL3X 免疫后，于第 7 天接受 R-CHOP 或安慰剂处理。第 14 天处死小鼠，并通过 FACS 从脾脏中分选供体来源的 B 细胞，用于单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。此外，还对从自发进展为明显 FL 的老年 BCK 小鼠中分离的恶性 B 细胞进行了 scRNA-seq 分析。

(b)

所有细胞的 inferCNV 分析，按样本类型分组。R-CHOP：接受 R-CHOP 治疗后从 CD45.1⁺ 受体小鼠中分离的 CD45.2⁺ 细胞（n=9）；安慰剂：来自接受安慰剂处理小鼠的 BCK 细胞（n=3）；肿瘤：未经治疗的 BCK 小鼠自发形成的淋巴瘤（n=3）。

(c)

每个细胞的 CNV 谱与肿瘤细胞平均 CNV 谱之间的相关性。

(d)

整合全部 58,497 个细胞的 scRNA-seq 数据所得的 UMAP 图，显示 13 个不同的转录组簇。

(e)

按样本类型区分的细胞：安慰剂处理组（安慰剂受体小鼠的 BCK 细胞）、R-CHOP 后持续存在组（接受 R-CHOP 治疗的受体小鼠的 BCK 细胞）和肿瘤来源组（老龄小鼠的 BCK 肿瘤细胞）。

(f)

点图显示各定义 B 细胞亚型中所选标志基因的平均表达量及表达该基因的细胞比例。

(g)

各样本类型的簇组成，显示属于 13 个已鉴定簇的细胞比例。

(h)

记忆细胞簇 1、2 和 6 中的 BCR 同种型使用情况。

(i)

CNV 相关性分析：将记忆细胞簇 1、2 和 6 以及恶性细胞簇 0、5、8 和 10 中各个细胞的 inferCNV 谱，与肿瘤平均 CNV 谱进行比较。

整合所有数据集后，获得包含 13 个簇的共同 UMAP（图 2d-f）。安慰剂处理小鼠的 BCK 细胞以暗区生发中心（DZ GC）表型为主，而 R-CHOP 治疗后残留的 BCK 细胞中，≥80% 分布于三个类记忆细胞簇（1、2、6）（图 2g）。值得注意的是，在安慰剂和 R-CHOP 条件下，簇 2 均保留 IgM 表达（图 2h），提示表达 IgM 的类 MBC 亚群可能是一种优先存活状态。在自发性肿瘤中也能检测到相同的类 MBC 细胞簇，但频率较低，其中簇 2 的占比仍然最高（图 2g）。拷贝数模式

这些状态呈现分层分布：cluster-1 在基因组层面总体正常，而 cluster-2 和 cluster-6 的 CNV 负荷处于中等水平，这与癌前进展早期发生染色体改变相符（图 2i）。

综上，这些数据表明，R-CHOP 治疗后的细胞储库在转录层面具有异质性，呈记忆样特征，且整体拷贝数较为稳定；其中，保留 IgM 的记忆细胞亚群逐渐成为治疗后持续存在的主要状态。

保守的 CPC 程序可识别高风险患者

在小鼠中发现 MBC 样的治疗后持续存在细胞后，我们进一步探究人类 FL 中是否也存在类似群体。我们分析了一个包含结局数据的 FL 诊断期 scRNA-seq 数据集³⁷，并将患者 B 细胞映射至小鼠参考图谱（图 3a）。整合比对识别出 BCK 来源状态在人类中的对应群体（图 2e、图 3a），其中包括 R-CHOP 治疗后富集的三个 MBC 样簇（1、2、6）。在发生 POD24 的患者肿瘤中，唯一保留 IgM 的 cluster-2 占比更高（图 3b），提示一种保守的、保留 IgM 的 MBC 样持续存在状态可能构成 CPC 储库。

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图 3：保守的 CPC 程序可识别高风险患者。 (a) 将 Radtke 等人¹⁷ 的人类 FL scRNA-seq 数据跨物种映射至本研究定义的小鼠簇。

(b) Radtke 数据集中各患者肿瘤细胞在小鼠定义簇中的分布，显示不同患者间簇组成存在异质性。

MBCs 显示于底行。HR 和 p 值基于多变量 Cox 回归模型（CoxPH）计算。

（d、e）

基于 CPC 特征富集程度，对 FFS（BCCA 训练队列）和无进展生存期（PFS；PRIMA 验证队列）进行 Kaplan–Meier 生存分析。p 值基于对数似然比检验计算。

为检验其预后相关性，我们分析了 BCCA⁴ 试验队列的 RNA-seq 数据（n=137）。与簇 2 相关的基因集富集程度与较差的无失败生存期（FFS）相关（HR 1.40，p=0.059），而其他簇程序均未能预测不良结局（图 3c）。随后，我们使用弹性网回归筛选出簇 2 程序中与不良预后关联最强的基因子集，从而构建了 CPC 特征（图 3c）。将 CPC 特征应用于 BCCA 队列后，可将患者划分为不同风险组。CPC 特征富集程度高的患者（n=67/137，48.9%）其 5 年 FFS 显著较差（图 3d）（HR 5.80，p<0.001；图 3c）。在具有 m7-FLIPI 数据的患者中（n=106），CPC 特征在预测较差 FFS 方面优于 m7-FLIPI（C 统计量：0.834 vs 0.677；图 3c）。我们在独立的 PRIMA⁵ 试验队列（n=149）中验证了 CPC 特征。CPC 特征富集程度高（n=78/149，52.35%）预示着较差的 5 年 PFS（图 3d）。

综上，这些结果表明，小鼠治疗后观察到的保留 IgM 的 MBC 样状态（簇 2）在人类 FL 中具有保守的转录程序，能够前瞻性地识别高风险患者。CPC 程序提供了一种具有生物学依据的风险分层生物标志物，并为靶向复发起始细胞状态提供了理论依据。

iCPC 平台揭示了对 HDAC 的依赖性

为发现能够靶向 CPC 程序的疗法，我们首先着手解决一项局限……

我们的体内系统存在功能和药理学测试通量较低的问题。因此，我们开发了一种可扩展的体外扩增平台，可生成适用于高通量筛选的CPC样细胞。基于可获得GC样（iGCB）和记忆样（iMBC）B细胞的培养方案⁽³⁸˒³⁹⁾，我们优化培养条件，使BCK模型中的细胞优先形成MBC样CPC，建立了一个操作性iCPC系统。

从BCK小鼠中分离的初始B细胞在表达CD40L和促存活细胞因子BAFF的40LB饲养细胞上培养（图4a）。先给予IL-4处理，再给予IL-21处理后，BCK B细胞呈现CD95^hi^CD38^lo^表型，这是GCB的典型特征（图4b、c）；随后进入第三阶段的无细胞因子培养（称为iMBC阶段），细胞则形成MBC样表型（CD95^lo^CD38^hi^）（图4a–c）。与iMBC相比，iGCB细胞增殖更活跃，BCL6表达水平也更高（补充图2a–d）。BCL6是一种对GC B细胞身份至关重要、但对MBC并非必需的转录因子⁽⁴⁰˒⁴¹⁾。

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图4：iCPC平台揭示了对HDAC的依赖性。

(a) 优化后的体外生发中心B细胞（iGB）培养系统示意图。

(b、c) 流式细胞术图及相应定量结果，显示体外生成的iGCB（CD38^lo^FAS^hi^）和iMBC（CD38^hi^FAS^lo^）细胞。数据表示为3个技术重复的均值±SEM。

(d) 热图显示体外生成的iMBC的RNA-seq转录组与单细胞RNA-seq定义的MBC簇1、2和6的伪批量表达谱之间的相似性。生物学重复数n = 3。

(e) GC再进入实验设计：将BCK或WT iMBC过继转移至经SRBC预处理的µMT受体小鼠中，随后对其进行免疫接种，采用的是……

SRBC-HEL3X。于3.5天后评估生发中心（GC）再进入。

(f, g) 流式细胞术设门分析及定量结果，显示抗原再次刺激后，BCK iMBCs 优先分化为 GC B 细胞。均值 ± SEM；WT，n = 6；BCK，n = 8。

(h) iCPC（BCK iMBC）经一组表观遗传修饰化合物处理24小时后的存活率热图，采用 CellTiter-Glo® 发光法测定。数值以 DMSO 对照归一化；图中显示三个技术重复的均值。

(i, j) 流式细胞术设门分析及定量结果，显示经 Romidepsin、Panobinostat 或 DMSO 处理24小时后的 cleaved Caspase-3⁺ iCPC。数据以三个生物学重复的均值 ± SEM 表示。

(k, l) 对 HDAC 抑制剂（HDACi）处理与 DMSO 处理的 iCPC 进行基因集富集分析（GSEA），分析对象为与 cluster-2 MBC（CPC）相关的基因。NES = 标准化富集分数；p 值由经验置换检验得出；FDR 根据基因集大小和多重比较进行校正。

(g) 和 (j) 中的每个点代表一只小鼠。*P ≤ 0.05；P ≤ 0.01；*P ≤ 0.001；****P ≤ 0.0001；ns = 差异无统计学意义（双尾 Student’s t 检验）。

BCK 来源的 iMBC 在转录特征上与 cluster-2 相似（图4d）；该群体是在体内模型中鉴定出的推定 CPC 群体。这些细胞还表现出更强的 GC 再进入能力，这是 CPC 的一个标志性特征⁴²。将其转移至 μMT 受体小鼠⁴³后，免疫接种时，BCK iMBC 产生的 GC B 细胞显著多于 WT iMBC，证实其具备 GC 再进入能力（图4e–g）；这一结果也符合祖细胞反复播散演化的特征。这些发现支持在体外筛选中使用 BCK iMBC（下文称 iCPC）作为 CPC 的功能和转录替代模型。

鉴于 FL 中表观遗传修饰因子的改变早期即已发生并呈克隆性¹⁶（

图1a），我们据此推测其存在表观遗传依赖性。对20种表观遗传药物进行聚焦筛选后发现，HDAC抑制剂对iCPC具有毒性（图4h）。HDAC1/2选择性抑制剂罗米地辛和泛HDAC抑制剂帕比司他均表现出显著的单药毒性，在低纳摩尔浓度（5–10 nM）下作用尤为明显（图4h）。通过检测裂解型Caspase-3，进一步验证了这种细胞毒性，证实罗米地辛或帕比司他处理可诱导iCPC发生凋亡（图4i、j）。为探究这种毒性的分子基础，我们对经罗米地辛或帕比司他处理的iCPC进行了RNA-seq分析。基因集富集分析（GSEA）显示，两种药物均显著抑制CPC转录程序（cluster-2；图4k、l）。

综上，这些数据确立了一个稳健、可扩展的iCPC平台，该平台能够忠实模拟CPC生物学特征，并揭示出一种可干预的HDAC依赖性。该系统可用于高通量筛选优先级较高的CPC靶向疗法，以清除在FL中导致复发的、持续存活的治疗耐受细胞。

HDAC抑制剂在体内及患者来源的类器官中靶向CPC

鉴于罗米地辛和帕比司他可有效抑制CPC程序，我们进一步检测了它们在体内对CPC的作用。在治疗模型中，将未经处理的BCK细胞过继转移至受体小鼠，随后以HEL进行免疫，并于第7天给予R-CHOP（图5a）。第11天给予单剂量罗米地辛、帕比司他或溶剂，并于第14天分析脾脏（图5a）。与单用R-CHOP相比，两种药物均显著减少了残留BCK细胞数量；其中，帕比司他在不同动物中的清除效果更为稳定（图5b、c）。

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图5：

HDAC抑制在体内及患者来源的……中靶向CPC

类器官（a）HDAC 抑制剂活性的体内评估实验设计。（b）代表性流式细胞术图及门控策略，用于定量受体小鼠体内供体来源的 BCK 细胞（GFP⁺ CD45.2⁺）。（c）接受 R-CHOP ± Romidepsin 或 Panobinostat 治疗的小鼠脾脏中残留 BCK 细胞的定量。残留细胞数以仅接受 R-CHOP 治疗小鼠的 BCK 细胞平均数为基准，以百分比表示。数据以浮动柱表示（最小值至最大值），横线表示均值；R-CHOP，n = 3；Romidepsin，n = 4；Panobinostat，n = 3。（d）患者来源淋巴瘤类器官（PDLO）的构建：将 FL 活检样本解离并冻存，随后培养 4 天，再单独给予 R-CHOP 治疗，或联合 Romidepsin 或 Panobinostat 治疗。（e）明场显微镜图像显示培养 4 天后 PDLO 聚集体的形成。比例尺 = 400 μm。（f，g）流式细胞术定量第 7 天 PDLO 中的存活 FL 细胞。淋巴瘤细胞定义为存活的 CD19⁺、BCL2⁺ 细胞，且具有克隆受限的 BCR 轻链。（h）治疗效果定量：Romidepsin 或 Panobinostat 治疗后残留 FL 细胞数量的减少，以仅接受 R-CHOP 治疗的对照组为基准进行归一化。（c）中每个点代表一只小鼠。P 值采用双尾 Student’s t 检验计算。

为评估其与人类疾病的相关性，我们在患者来源淋巴瘤类器官（PDLO）中评估了这两种药物。PDLO 由携带 t(14;18)、CREBBP 和 KMT2D 突变的冻存 FL 活检样本建立⁴⁴（补充表 1）。PDLO 接受体外适配的 R-CHOP 方案⁴⁵,⁴⁶，并同时给予 romidepsin、panobinostat 或载体对照（图 5d、e）。PDLO 中的 FL 细胞被鉴定为具有轻链限制性的 CD19⁺ BCL2⁺ 细胞，与患者诊断时的特征一致。

免疫表型（图 5f、g）。与单独使用 R-CHOP 相比，罗米地辛和帕比司他均减少了残留 FL 细胞（图 5h）。

因此，HDAC 抑制不仅能在体外杀伤 iCPC，还能在体内及人源类器官中清除治疗后持续存在的残留细胞，从而靶向一种与早期肿瘤发生改变相关的表观遗传依赖性。这些数据为将 HDAC 抑制剂纳入一线、以 CPC 为靶点的治疗策略提供了临床前依据，旨在清除 FL 中引发复发的细胞储库。

讨论

治愈 FL 需要根除引发复发的 CPC。研究进展受限于两大障碍：（i）CPC 的生物学特征尚未明确；（ii）缺乏能够前瞻性分离并靶向这一细胞群的实用工具。在此，我们采用以小鼠模型为先导的策略克服了这两项障碍，实现了在患者中难以做到的研究：在类似 R-CHOP 的治疗后立即采样治疗后持续存在的细胞，前瞻性分离 CPC，并对其脆弱性进行功能性检测。

在一个遗传特征高度忠实的早期 FL 模型中，CPC 对应于一种 IgM⁺、类似 MBC 的状态，具有显著的再次进入 GC 的能力。这种行为与抗原再次刺激相符⁴⁷，也符合 FL 中由反复发生的体细胞高频突变驱动的克隆演化特征²⁰˒³⁵˒⁴⁸˒⁴⁹。该状态在早期复发患者确诊时已呈富集，并在一线免疫化疗后持续存在于异质性的残留细胞群中。因此，残留病灶具有多克隆性；仅凭细胞存活并不能判定其是否具有复发潜能。相比之下，由 CPC 程序所表征的细胞身份更能解释临床结局。这提示应依据分子特征界定残留病灶，以指导风险分层和干预。

尽管我们聚焦于 t(14;18)、CREBBP、KMT2D 模型，因为该模型能够模拟……

除最常见的早期改变外，CPC程序似乎是一种趋同且不依赖基因型的细胞状态。在一项突变组合多样的单细胞FL数据集中检测到了CPC样细胞；在大型患者队列中，CPC特征富集也始终与较差的预后相关。就临床而言，CPC生物学可提供一种生物标志物和潜在治疗靶点，且似乎适用于不同的突变背景。基线分析可识别CPC高表达患者，以实施风险适配的强化治疗或加用CPC靶向药物；CPC特征的动态变化则可能作为药效学标志物，并可灵敏地反映残留病灶，为监测和维持治疗提供依据。前瞻性研究可按诊断时的CPC负荷进行分层，预先设定CPC特征变化为探索性终点，并评估加用CPC靶向治疗能否在不受基因型影响的情况下改善结局，从而补充现有的临床遗传学工具。

从机制上看，我们的数据提示，散装样本中检测到CPC，反映的是细胞状态占比，而非细胞绝对数量。生发中心（GC）表型细胞会被R-CHOP清除，而CPC程序仍持续存在，这表明CPC是一种动态且治疗后持续存在的状态。CPC可能在具备GC分化能力、对治疗敏感的阶段与受微环境支持的静息阶段之间转换；遗传因素决定其可行状态范围，而肿瘤微环境的空间线索则调控其状态占比。阐明这些状态转换的调控机制，有望改进风险评估、实现动态监测，并指导CPC靶向治疗的时机与方案选择。

我们发现，CPC与恶性FL细胞共存

，并可能占据多个解剖学生态位，包括继发淋巴组织

和骨髓

，且可能进入循环并娱乐主管

持续存在于非淋巴组织部位^51。绘制这些生态位将有助于阐明空间异质性、潜伏状态和复发途径，并可能揭示生态位特异性脆弱性。

最后，通过在体外将CPC生物学转化为可操作体系（iCPCs），我们发现了一种可干预的HDAC依赖性：romidepsin和panobinostat能够清除iCPCs，并在体内及患者来源的类器官中耗竭R-CHOP持留细胞。鉴于大多数患者对标准治疗有反应，不加选择地使用HDAC抑制剂不太可能带来广泛获益。相反，我们的结果支持一种精准治疗策略：在诊断时识别CPC水平较高的患者，将HDAC抑制剂作为针对CPC的加用治疗，并将CPC特征谱的动态变化作为药效学终点进行追踪。此类生物标志物指导的试验为清除复发起始细胞储库提供了可信路径，并最终实现FL的持久疾病控制。

方法

小鼠

BCL2敲入小鼠（Rosa26^LSL-BCL2.IRES.GFP）此前已有报道^22。为了研究FL背景下生发中心（GC）成熟过程中治疗持留细胞的形成，我们将这些模型与SW_HEL等位基因系统整合，从而能够在HEL免疫后对进入GC进行精确的时间控制和抗原特异性控制^29。以下小鼠品系购自杰克逊实验室（美国缅因州巴港）：C57BL/6J（CD45.2，品系编号#000664，在克里克研究所内繁育）、B6.SJL-Ptprc^aPepc^b/BoyJ（CD45.1，品系编号#002014，在克里克研究所内繁育）、Cd79a-Cre（品系编号#020505）^21、Crebbp^FL（品系编号#025178）^23以及Kmt2d^FL小鼠（品系编号#032152）^24。

在相关实验中，Cd79a-Cre和Rosa26^LSL-YFP小鼠用作对照。实验包括雄性和雌性小鼠，并在每项实验中对各组进行了性别匹配。所有动物均进行了繁育，并且

按照英国《内政部》法规，在弗朗西斯·克里克研究所生物研究设施的特定病原体阴性（SPF）条件下饲养，并经弗朗西斯·克里克研究所伦理审查委员会批准。

细胞分离

从淋巴组织制备单细胞悬液，并使用 ACK 裂解缓冲液裂解红细胞。采用 CD43（Ly-48）磁珠（Miltenyi Biotec）通过阴性分选从脾脏中分离初始 B 细胞，随后将未标记细胞组分通过 MACS LS 分选柱（Miltenyi Biotec）。该流程通常可获得纯度 >97% 的 B 细胞。

iGB 细胞培养及 iMBC 细胞制备

将纯化的 B 细胞（每皿 5 × 10⁵ 个）接种于 10 cm 组织培养皿（BD Falcon）中，与经丝裂霉素 C 处理的 40LB 饲养细胞共同培养（每皿 3 × 10⁶ 个；Abcam，预处理条件为 10 μg/ml、2 h）。培养使用高糖 DMEM（Gibco），并补充 GlutaMAX™、10% 胎牛血清（FCS）、5.5 × 10⁻⁵ M 2-巯基乙醇、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸钠、1× MEM 非必需氨基酸、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素（Gibco）。为制备 iGC B 细胞，在初代培养中加入重组 IL-4（PeproTech），培养 3 天。第 3 天，将细胞重新接种至新鲜饲养细胞层，并加入重组 IL-21（PeproTech）继续培养 3 天。第三次培养时，将细胞转移至新的饲养细胞层，在不额外添加细胞因子的条件下再培养 3 天，从而制备供后续实验和高通量药物筛选使用的 iMBC 细胞。每个培养阶段均采用台盼蓝排斥法定量活 B 细胞数量。所有培养均在 37 °C、5% CO₂ 的湿润环境中进行。

化合物筛选

每种化合物最初都】【。

以 20 μM 起始浓度进行测试，采用 14 个浓度点、每级 2 倍的系列稀释。首先使用 Myra 液体处理系统（Bio Molecular Systems），将化合物从 10 mM 储备液起在 Echo® Qualified 384 孔低死体积（LDV）源微孔板（Labcyte）中以 DMSO 进行 5 个浓度点、每级 8 倍的稀释。随后，使用 Echo 650T 声学液体处理系统（Beckman Coulter），将各稀释液分别以 100 nL、50 nL 和 25 nL 的体积声学转移至检测板（Greiner Bio-One CELLSTAR® 384 孔微孔板）。通过补加 DMSO，使 50 μL 检测体系中的最终 DMSO 浓度统一为 0.2%。使用细胞解离缓冲液（Gibco）从 40LB 饲养层收获 iMBC 细胞，并将其重悬于含重组小鼠 BAFF（200 ng/ml；Bio-Techne）和重组小鼠 CD40L（1 μg/ml；Bio-Techne）的 B 细胞培养基中，最终细胞密度为 2 × 10⁵ 个细胞/mL。使用 ViaFill 分液器（Integra）向每孔接种 10,000 个细胞，体积为 50 μL。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时后，使用 CellTiter-Glo® 检测试剂（Promega）测定细胞内 ATP 水平，以评估细胞活力。每孔加入 40 μL CellTiter-Glo 试剂后，将微孔板于室温孵育 20 分钟，再使用 EnSight 微孔板读数仪（Revvity）读取发光信号。细胞活力以相对于 DMSO 处理对照孔的百分比表示。

免疫、处理与过继转移

如前所述²⁹，将供体小鼠的脾细胞与 CD43（Ly-48）MicroBeads（Miltenyi Biotec；130-049-801）孵育，并使用 MACS LS 柱（Miltenyi Biotec）通过阴性选择富集 B 细胞。所得 CD19⁺B220⁺细胞群的纯度通常超过 97%。为定量测定 the

为测定 HEL 特异性 B 细胞的频率，将 0.5 × 10⁶ 个细胞与 200 ng/ml HEL 在冰上孵育 20 分钟，用 FACS 缓冲液洗涤两次，然后用 HyHEL9-Alexa Fluor® 647 染色。通过流式细胞术定量 HEL 结合性 B 细胞。将总计 1–2 × 10⁶ 个 HEL 特异性 B 细胞经静脉转移至 CD45.1⁺ B6.SJL 受体小鼠体内。同日，经静脉给予小鼠 2 × 10⁸ 个偶联 HEL3X 的 SRBC 进行免疫。HEL3X 蛋白由表达带 His 标签 HEL3X 的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞制备。使用 ÄKTA Pure 层析系统（Cytiva）上的 HisTrap FF 柱（Cytiva），从培养上清液中纯化该蛋白。将洗脱组分浓缩至 0.5 ml（使用截留分子量为 10 kDa 的 Vivaspin 15 浓缩器），随后在 Superdex 200 10/300 柱（Cytiva）上进行体积排阻层析。HEL3X 以单一对称峰洗脱，随后以 1 mg/ml 的浓度速冻，并于 −80 °C 保存至使用。

R-CHOP 治疗

经静脉给予 Ultra-LEAF™ 纯化抗小鼠 CD20 抗体（BioLegend）、环磷酰胺、多柔比星和长春新碱，并每日经口灌胃给予泼尼松龙，连续 5 天；化疗药物剂量依据既往研究⁵²确定。用于腹腔注射的 Panobinostat（BPS Bioscience）溶于 5% DMSO（Sigma）、40% PEG300（MedchemExpress）、5% Tween 80（Sigma-Aldrich）和 50% 双蒸水中。用于腹腔注射的 Romidepsin（Active Motif）溶于 10% DMSO 和 90% 生理盐水中。

采用 EdU 掺入实验（Invitrogen）评估处于 S 期的 B 细胞比例。处死前 1 小时，经腹腔注射给予小鼠 1 mg 溶于 PBS 的 EdU。完成表面标志物染色后，对脾细胞进行固定、通透处理，并进行点击化学……

按照制造商说明，使用 Click-iT™ Plus EdU 流式细胞术检测试剂盒（Pacific Blue 检测；ThermoFisher；C10636），通过荧光标记反应检测已掺入的 EdU。

流式细胞术分析与细胞分选

单核脾细胞的单细胞悬液按以下步骤进行流式细胞术处理：首先，将细胞置于 FACS 缓冲液中，与抗小鼠 CD16/32 抗体（BD Biosciences；553142；稀释比例 1:200）孵育，以阻断 Fc 受体（4 °C，10 分钟）。随后，将 Zombie NIR 活性染料（BioLegend；423106）加入 FACS 缓冲液中，与细胞孵育 20 分钟（4 °C），以排除死细胞。表面染色时，将一组以 FACS 缓冲液稀释的荧光染料偶联抗小鼠抗体加入细胞中，孵育 30 分钟（4 °C）。为鉴定 HEL 结合性 B 细胞，先用 HEL 蛋白（50 ng/mL）对细胞进行染色，再使用 HyHEL9-Alexa Fluor® 647 检测。进行细胞内染色时，使用 True-Nuclear™ 转录因子缓冲液试剂盒（BioLegend）固定并通透细胞，随后在 4 °C 下与抗体孵育过夜。使用 LSR Fortessa 或 FACSAria（BD Biosciences）进行流式细胞术采集与分析。数据使用 FlowJo v10.8.1 进行分析。进行荧光激活细胞分选（FACS）时，使用配备五种激光器（355、405、488、561、640 nm）的 BD FACSAria II 对抗体标记细胞进行分选。

抗小鼠抗体的稀释比例如下：BUV395 抗 CD45.2（BD 564616，克隆 104，1:200）、BV510 抗 CD95（BD 563646，克隆 Jo2，1:200）、R718 抗 CD95（BD 752226，克隆 Jo2，1:200）、PE-Cy7 抗 CD95（BD 557653，克隆 Jo2，1:200）、AF700 抗 CD38（Invitrogen 56-0381-82，克隆 90，1:200）、BV650 抗 CD38（BD 740489，克隆 90，1:200）、BV605 抗 IgD（BD 405727，克隆 11-26c.2a，1:200）、

BV421 抗 IgD（BD，405725，克隆号 11-26c.2a，1:200）、AF594 抗 IgD（BD，405740，克隆号 11-26c.2a，1:200）、PerCP-EF710 抗 IgM（Invitrogen，46-5790-82，克隆号 II/41，1:200）、BUV805 抗 IgM（BD，749307，克隆号 II/41，1:200）、生物素标记抗活化型 Caspase-3（BD，550557，克隆号 C92-605，1:10）、PE-Cy7 抗 BCL6（BD，563582，克隆号 K112-91，1:20）、PE 抗活化型 Caspase-3（BD，570183，克隆号 C92-605，1:20）、PerCP-EF710 抗 CXCR4（Invitrogen，46-9991-82，克隆号 2B11，1:200）、BV510 抗 B220（BioLegend，103248，克隆号 RA3-6B2，1:200）、BUV737 抗 B220（BD，612838，克隆号 RA3-6B2，1:200）、BV605 抗 CD86（BioLegend，105037，克隆号 GL-1，1:200）、BV786 抗 CD138（BD，740880，克隆号 281-2，1:200）、BUV737 抗 Kappa LC（BD，748499，克隆号 187.1，1:200）、AF700 抗 Kappa LC（BioLegend，409508，克隆号 RMK-45，1:200）。抗人抗体的稀释比为：FITC 抗 Kappa LC（BioLegend，316506，克隆号 MHK-49，1:50）、BV510 抗 Lambda LC（BD，570934，克隆号 1-155-2，1:50）、AF647 抗 BCL2（BioLegend，658706，克隆号 100，1:20）、BV650 抗 CD19（BioLegend，302238，克隆号 HIB19，1:100）。

进行 FACS 分选时，细胞与抗体孵育后，使用配备 5 个激光器（355、405、488、561、640）的 BD Aria II 分选仪进行分选。所有实验均使用 Zombie NIR（BioLegend，423106）排除死细胞。

组织病理学与免疫组织化学

组织在 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）中固定 24 h，随后使用 Tissue-Tek VIP 6 AI 组织处理机处理并包埋于石蜡中。厚度为 3 μm 的组织切片在 60°C 下烘烤 1 h，随后使用 Roche Ventana Discovery Ultra 全自动染色仪进行免疫组织化学染色，所用一抗为兔抗 CD3（Abcam，ab134096）、兔抗 CD19（Abcam，ab245235）或兔抗 BCL6（Cell Signaling Technology，5650S）；使用 DISCOVERY OmniMap 抗兔 HRP（RUO）（Roche，760-4311），并采用 DISCOVERY

ChromoMap DAB Kit（RUO）（Roche，760-159）。使用 DISCOVERY CC1 溶液（Roche，950-500）进行靶标修复。使用 Tissue-Tek Prisma 自动切片染色仪以苏木精对切片进行复染。随后使用 Tissue-Tek Glas g2 自动玻片封片机为切片封片。

BCK 小鼠 B 细胞的单细胞处理

使用 Cellranger multi（v7.1.0）流程将 10x Genomics 原始测序读段比对至 Ensembl 98 基因组并进行定量。随后使用 Python（3.10.12）中的 Scanpy（v1.9.4）对安慰剂处理组、RCHOP 处理组及肿瘤样本的计数矩阵进行联合处理，并移除检出率较低的基因（检出细胞数 <5）。仅对 R-CHOP 处理组的测序数据进行样本拆分，以 MULTIseqDemux() 函数识别来自不同小鼠的单细胞。随后从计数矩阵中排除拆分结果标记为双细胞或阴性的细胞。另应用严格阈值，移除 nFeature_RNA <800，以及 nFeature_RNA、nCount_RNA 和 percent.mt 超出中位数绝对偏差（MAD）5 倍以上的液滴。

为确保分析中 B 细胞的质量，移除血红蛋白读段含量较高（percent.hb >0）及 TCR 读段含量较高（percent.tcr >0.05%）的污染液滴。采用移位对数法对细胞进行归一化，并选取 3,000 个高变特征（HVF）用于主成分分析（PCA）。初步聚类使用前 20 个 PC，并针对各组采用不同分辨率的 Leiden 算法（安慰剂组 = 0.5，RCHOP 组 = 0.3，肿瘤组 = 0.5）；随后从所有处理组中移除对应于 T/NK 细胞（Cd3d、Nkg7）、髓系细胞（Lyz2、Itgam）及浆细胞（Irf4、Prdm1）的簇。质量控制后，共获得 58,497 个】【。

所有治疗组中均可见 B 细胞。

BCK 小鼠 B 细胞的整合与分析

采用解析 Pearson 残差法对高质量 B 细胞进行标准化，并选取 3000 个高变特征（HVF）。对治疗组和肿瘤样本中的 B 细胞进行 PCA 和 Harmony 整合后，使用前 20 个主成分（PC）计算细胞间最近邻，并以 0.6 的分辨率进行 Leiden 聚类。随后采用统一流形近似与投影（UMAP）将单细胞投影至二维空间进行可视化。根据所选标志基因的表达对 B 细胞簇进行人工注释：活化型（Dusp2、Cd69、Fos）、记忆型（Hhex、Cd38、Klf2）、生发中心明区（Il4i1、Cd40、Fcer2a）和暗区（Mef2b、Aicda、Bcl6）。

BCK 小鼠 B 细胞的拷贝数变异推断

采用 inferCNV 算法（v1.21.0）分析 BCK 小鼠 B 细胞中的拷贝数变异（CNV），参数如下：cutoff = 0.1、denoise = TRUE、HMM_type = “i6”。WT 小鼠的 B 细胞作为正常细胞参照，用于建立基线表达水平。为计算 CNV 相关性评分，对肿瘤样本的 CNV 图谱取平均，并计算每个单细胞与该平均图谱之间的 Pearson 相关系数。

单细胞差异表达分析

在 BCK 肿瘤样本中，使用 R（v4.3.2）实现的 Seurat（v5.0.1）函数 FindAllMarkers()，并采用零膨胀广义线性模型方法 MAST（v1.26.0），计算各细胞簇的差异基因表达。采用 Bonferroni 方法对基因的 p 值进行校正；满足 p_val_adj < 0.001、pct.1 > 0.1 且 avg_log2FC > 0.5 的基因被判定为显著上调。

FL scRNA-seq 数据集的处理与参考映射

Radtke 等人研究中的 FL 患者来源 B 细胞按每个……进行标准化。

采用 SCTransform 方法处理样本，参数设置如下：vst.flavor = “v2”，variable.features.n = 3000。基于 RPCA 的批次校正按样本进行，使用 Seurat V4 流程中的 FindIntegrationAnchors() 和 IntegrateData()，整合特征数和 k.weight 分别设为 3000 和 40。

为识别不同物种间的同源细胞类型，使用 Seurat 的 MapQuery() 函数，参数设为 dims = 1:20、method = “rpca”，对患者 B 细胞亚群进行分类，并将其投射到整合后的小鼠 UMAP 空间中。

HDAC 抑制剂处理的 B 细胞 RNA 测序

使用 nf-core 流程（v3.13.2）将 RNA 测序的 Fasta 文件比对至 GRCm39 参考基因组（Ensembl 98），并采用 STAR-Salmon 方法进行转录本比对与定量。对转录本应用方差稳定化转换（VST）进行数据标准化。计算每个基因在所有样本中的平均表达量，并以该分布的第 5 百分位数（quantile = 0.05）为阈值，过滤低表达基因。使用 DESeq2（v1.40.2）的默认设置进行差异表达分析，随后使用 ashr（v2.2-63）进行倍数变化收缩。满足 log2FoldChange >|0.5| 且 padj < 0.05 的基因被视为差异表达基因。

基因集富集分析

根据 log2 倍数变化表达值，对所有数据集中的差异表达基因进行预排序。汇总细胞簇特征基因集以及 MSigDB 的 HALLMARK、KEGG、GOBP 和 REACTOME 集合中的特征基因集，使用 clusterProfiler 软件包（v4.8.2）中的 GSEA() 函数进行基因集富集分析，参数设为：nperm = 1000，min.overlap = 5。通路在 q 值...

< 0.05

FL 类器官

在 Barts Health NHS Trust 接受治疗和护理的患者均签署知情同意书，参与一项经当地机构审查委员会（IRB）批准的血液及组织生物标志物观察性研究（伦理审批编号：21/EE/0123）。所有患者均依照研究方案提供书面知情同意。对于确诊或疑似淋巴瘤患者，在诊断时依据标准临床诊疗流程获取肿瘤活检样本。治疗决策由主治医师根据机构标准酌情作出。本研究纳入的患者于 2012 至 2020 年间入组。患者年龄、性别、疾病类型及临床变量汇总见补充表 S1。FL 类器官按照既往报道的方法制备⁴⁴。简而言之，在诊断时采集经手术切除且含有存活淋巴瘤细胞的淋巴结，并以新鲜组织形式置于生理盐水或 PBS 中。将样本置于冰上，使用无菌研杵和不锈钢细胞解离筛，在 DPBS 中机械解离为单细胞悬液；随后重悬于冻存液（10% DMSO、50% FBS、40% RPMI）中，并保存于液氮，直至制备为免疫类器官。制备类器官时，将冻存细胞复苏，并在解冻过程中以 benzonase 处理（培养基中稀释至 1:10,000；Sigma）去除过量 DNA。细胞用 RPMI+10% FBS 洗涤后，以终浓度 7.5 × 10⁶/ml 接种于平底 96 孔超低吸附板（Corning）中（终体积 100 μl；每孔 7.5 × 10⁵ 个存活细胞）。类器官培养基由含 GlutaMAX 的 RPMI 1640、10% FBS、1× 非必需氨基酸、1× 丙酮酸钠、1× 青霉素–链霉素以及 1× 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）补充剂（Gibco）组成。培养物在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育，且……

湿度和培养基每隔一天通过补加 30 μl 新鲜类器官培养基进行补充。培养第 4 天，采用基于临床可达到的多柔比星浓度、并使用 R-CHOP 方案中利妥昔单抗的体外适应型 R-CHOP 对类器官进行处理⁴⁵˒⁴⁶。

统计分析

用于计算 p 值的统计方法已在相应图注中说明。统计分析使用 GraphPad Prism 9 或指定的 R 语言脚本和程序包完成。除非另有说明，p 值或校正后的 p 值 < 0.05 时，认为数据具有统计学显著性。除非图注另有说明，所有实验均成功完成，且至少包含 3 个生物学重复。未使用统计方法预先确定样本量。偶尔会因样本处理或数据采集存在技术缺陷而将特定样本排除在分析之外。肿瘤接种前，按年龄和性别匹配将小鼠随机分配至各治疗组。数据按组进行分析，且实验期间研究人员对分组分配情况设盲。对于所有采用双尾 Student’s *t* 检验分析的数据，均使用 Kolmogorov-Smirnov 检验检查正态性；当样本量较小时，无法使用 Kolmogorov-Smirnov 检验，则采用 Shapiro-Wilk 检验。对于非正态分布数据，采用双尾 Mann-Whitney 检验。样本量根据既往研究和预实验确定。

经费支持

本研究获得以下资助：授予 D.P.C. 和 J.O. 的 iFLI Moonshot Idea Award；由 Cancer Research UK（资助编号 CC2078）、英国医学研究理事会（资助编号 CC2078）和 Wellcome Trust（资助编号 CC2078）提供核心经费的 FCI；以及 CRUK [C355/A26819]、FC AECC】【。

[C355/A26819]，AIRC [C355/A26819] 加速器奖计划资助 D.P.C.、J.F. 和 J.O.；BSH 基因组学资助 O.A. 和 D.P.C.；英国血癌协会资助（编号：22012）资助 D.P.C.；英国白血病协会资助（Leuka/2018/PG/001）资助 D.P.C. 和 J.F.；BBSRC 研究所战略计划资助（BBS/E/B/000C0427；BBS/E/B/000C0428）资助 D.P.C.；德国研究联合会（DFG）（SFB1399，资助编号：413326622；SFB1430，资助编号：424228829；SFB1530，资助编号：455784452；RE 2246/17-1，资助编号：553375105）资助 H.C.R.；德国癌症援助组织（资助编号：1117240、70113041；Mildred Scheel Nachwuchszentrum 资助编号：70113307；作为临床前药物开发计划（preCDD）组成部分的 TACTIC 联盟，以及卓越资助计划）资助 H.C.R.；德国联邦教育与研究部（BMBF）e:Med 联盟 InCa（资助编号：01ZX1901 和 01ZX2201A）资助 H.C.R.；癌症靶向（CANTAR）项目 NW21-062“Netzwerke 2021”是北莱茵-威斯特法伦州文化与科学部的一项倡议，该项目资助 H.C.R.

作者贡献

概念构思：O.A.、M.S.H.、J.F.、J.O.、L.Z. 和 D.P.C.

方法学：O.A.、M.S.H.、L.Z.、O.S.、B.M.

研究实施：O.A.、M.S.H.、L.Z.、O.S.、B.M.、B.C.、C.E.

资源提供：B.S.、S.H.、G.S.、M.H.、H.C.R.、J.O.

可视化：O.A.、M.S.H.、L.Z.

经费获取：H.C.R.、J.F.、J.O.、O.A.、D.P.C.

监督指导：L.Z. 和 D.P.C.

论文初稿撰写：O.A.、M.H.、L.Z. 和 D.P.C.

论文审阅与编辑：所有作者。

利益冲突

D.P.C. 是一项涉及高 MYC 癌症中 NMT 抑制剂合成致死效应的专利（WO2020128475）的列名发明人；D.P.C. 获得阿斯利康和勃林格殷格翰的研究经费。H.C.R. 曾从 Abbvie、Roche、KinSea、Vitis、Cerus、Lilly、Novartis、Takeda、AstraZeneca、Vertex 和 Merck 获得咨询及讲课费用。H.C.R. 获得了

研究经费由阿斯利康和吉利德制药公司提供。H.C.R. 是 CDL Therapeutics GmbH 的共同创始人。这些竞争性利益与本研究无关。O.A.、M.S.H.、L.Z. 和 D.P.C. 是一项涉及滤泡性淋巴瘤 CPC 基因特征的专利（GB2509744.5）所列发明人。该竞争性利益与本研究相关。所有其他作者均声明不存在竞争性利益。

补充图

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补充图 1.

BCK 小鼠中的生发中心（GC）增生、细胞凋亡减少及分化受损。（a）

过继转移和免疫接种的实验设计。=

（b）

WT 和 BCK 受体中每 10⁶ 个脾细胞内供体来源（CD45.2⁺）B 细胞的定量。均值 ± SEM；WT

= 5，BCK

= 7。

（c）

显示 GC 扩增的脾脏切片代表性免疫组织化学（IHC）图像。比例尺 = 400 μm。

（d）

用于鉴定 GC B 细胞（GCB）和非 GCB 细胞群的流式细胞术设门策略。

（e，f）

免疫接种后第 7 天，通过 FACS 检测记忆 B 细胞（MBC）与 GC B 细胞以及浆细胞（PC）与 GC B 细胞的比值。均值 ± SEM；WT

= 5，BCK

= 7。

（g，h）

GCB 细胞群内暗区与明区（DZ:LZ）比值的设门策略及定量。

（i，j）

以活化型 caspase 3 定义的凋亡 B 细胞比例。

（k，l）

处于 S 期的 B 细胞比例，反映其增殖活性。

每个点代表一只小鼠。*

≤ 0.05；**

≤ 0.01；***

≤ 0.001；****

≤ 0.0001（双侧 Student’s

检验）；ns，无统计学显著性。

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补充图 2：

BCK iCPC 的表型。（a，b）

体外生成的 GC B 细胞（iGCB）和记忆 B 细胞（iMBC）处于 S 期的比例的代表性流式细胞术图及定量，反映其增殖状态。均值 ± SEM；

= 3。

（c，d）

BCL6

iGCB 和 iMBC 细胞中的表达分析，以几何平均荧光强度（gMFI）表示。数据为三个技术重复的均值 ± SEM。(b) 中的每个点代表一只小鼠。*P ≤ 0.05；P ≤ 0.01；*P ≤ 0.001；****P ≤ 0.0001（双侧 Student’s t 检验）；ns 表示差异无统计学意义。

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补充表 1：

用于构建类器官的队列临床特征。

致谢

感谢英国伦敦弗朗西斯·克里克研究所（FCI）免疫与癌症实验室的成员提出重要讨论意见和建议。感谢伦敦玛丽女王大学巴茨癌症研究所（CRUK Barts Cancer Institute, QMUL）的 John Riches 提出重要讨论意见和建议。感谢 FCI 科学平台（生物资源设施、流式细胞术、组织病理学）提供专业建议和技术支持。我们谨此感谢弗朗西斯·克里克研究所基因组学科学技术平台对单细胞捕获实验、文库构建和测序工作的贡献，特别感谢 Hubert Slawinski、Deb Jackson、Sam Jones 和 Marg Crawford。示意图由 BioRender.com 制作。

声明的资助信息

滤泡性淋巴瘤创新研究所（The Institute for Follicular Lymphoma Innovation），iFLI Moonshot Idea Award

英国癌症研究会（Cancer Research UK），https://ror.org/054225q67，资助编号 CC2078

医学研究理事会（Medical Research Council），资助编号 CC2078

惠康基金会（Wellcome Trust），CC2078

英国癌症研究会（Cancer Research UK），https://ror.org/054225q67，资助编号 C355/A26819

西班牙抗癌协会（FC AECC），C355/A26819

意大利癌症研究协会（AIRC），C355/A26819

英国血液学会（British Society for Haematology），BSH Genomics Grant

英国血癌协会（Blood Cancer UK），https://ror.org/0055acf80，资助编号 #22012

英国白血病协会（Leukaemia UK），https://ror.org/00xsz4758，Leuka/2018/PG/001

生物技术与生物科学研究理事会（Biotechnology and Biological Sciences Research Council），BBS/E/B/000C0427，BBS/E/B/000C0428

德国研究联合会（DFG），SFB1399，

资助项目编号 #413326622、SFB1430、#424228829、SFB1530、#455784452；德国癌症援助组织项目 1117240、70113041；Mildred Scheel 青年研究中心项目 70113307；TACTIC 联盟；德国联邦教育与研究部；BMBF e:Med 联盟 InCa 项目，资助编号 01ZX1901 和 01ZX2201A；CANcer TARgeting（CANTAR）项目，NW21-062“Netzwerke 2021”。

脚注

§ 共同资深作者。

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发表于 2026 年 6 月 24 日。

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滤泡性淋巴瘤中奠定复发基础的癌症持留细胞

Oscar Atkins，

Miu Shing Hung，

Ok-Ryul Song，

Baizhi Chen，

Bernard Maybury，

Carina Edmondson，

Bruno Tesson，

Sarah Huet，

Gilles Salles，

Michael Howell，

Hans Christian Reinhardt，

Jude Fitzgibbon，

Jessica Okosun，

Lingling Zhang，

Dinis Pedro Calado

bioRxiv

2026.06.23.734001；

doi：https://doi.org/10.64898/2026.06.23.734001

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滤泡性淋巴瘤中奠定复发基础的癌症持留细胞

Oscar Atkins，

Miu Shing Hung，

Ok-Ryul Song，

Baizhi Chen，

Bernard Maybury，

Carina Edmondson，

Bruno Tesson，

Sarah Huet，

Gilles Salles，

Michael Howell，

Hans Christian Reinhardt，

Jude Fitzgibbon，

Jessica Okosun，

Lingling Zhang，

Dinis Pedro Calado

bioRxiv

2026.06.23.734001；

doi：https://doi.org/10.64898/2026.06.23.734001

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关键词：滤泡性淋巴瘤 · 癌症持留细胞 · 复发机制 · 记忆B细胞 · 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 · R-CHOP治疗

原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.23.734001v1?rss=1

来源出处

滤泡性淋巴瘤中诱发复发的癌症持留细胞 https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.23.734001v1?rss=1