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使用超嗜热嗜酸性古菌（HTA）蛋白酶，可以通过单步、快速（5–30分钟）反应完成蛋白水解。HTA蛋白酶操作方案简便，且在环境储存条件下具有良好的稳定性，从而消除了蛋白质组学分析广泛部署中的诸多后勤障碍。HTA蛋白酶的切割选择性较为复杂，但具有定量可重复性，其产生的肽段与胰蛋白酶产生的肽段几乎没有重叠。胰蛋白酶肽段和HTA蛋白酶肽段各自突出鉴定不同的蛋白质，并在氨基酸序列及翻译后修饰（PTM）位点的覆盖方面形成互补。将样品分取一份，使用HTA蛋白酶进行消化，仅需在基于胰蛋白酶的工作流程中进行少量补充；然而，对于大规模队列，同时对两组肽段进行LC-MS分析并不实际。本研究评估了胰蛋白酶肽段与HTA蛋白酶肽段混合物进行LC-MS分析时的鉴定结果及其可重复性。在未经处理的血浆中，将HTA蛋白酶肽段加入20%的样本后，蛋白质鉴定总数平均增加了24%；与传统的仅使用胰蛋白酶的自下而上蛋白质组学分析相比，额外鉴定出216个非伪影修饰。该方法具有良好的可重复性，且不会增加样品制备或分析时间。每种蛋白酶产生的肽段均为定量重叠蛋白提供了独立机会；研究人员据此开发了一种定量模型：针对每种蛋白质，选择数据最完整的蛋白酶所提供的定量结果，并利用另一种蛋白酶推断缺失值。这种跨蛋白酶推断的准确性高于替代性的最小值、均值或最近邻插补方法。最后，通过HTA蛋白酶肽段发现的生物标志物适用于仅使用HTA蛋白酶的快速蛋白质组学工作流程，从而简化了从发现研究到可现场部署应用的转化过程。
simion.kreimer{at}cshs.org
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摘要
利用超嗜热嗜酸古菌（HTA）蛋白酶，可通过单步、快速（5–30分钟）反应完成蛋白水解。HTA蛋白酶的操作流程简单，且在环境储存条件下具有良好的稳定性，从而消除了蛋白质组学分析广泛应用中的诸多物流障碍。HTA蛋白酶的切割选择性较为复杂，但具有定量可重复性，其产生的肽段与胰蛋白酶产生的肽段几乎不存在重叠。胰蛋白酶肽段和HTA蛋白酶肽段分别突出显示不同的蛋白质，并在氨基酸序列及翻译后修饰（PTM）位点覆盖方面形成互补。使用HTA蛋白酶消化样品的另一份等分样本，只需在基于胰蛋白酶的工作流程中进行少量补充；然而，对于大规模队列，同时对两组肽段进行LC-MS分析并不实际。本研究评估了胰蛋白酶肽段与HTA蛋白酶肽段混合物进行LC-MS分析时的鉴定结果及其可重复性。在未稀释血浆中，将HTA蛋白酶肽段的比例提高至20%，使鉴定到的蛋白质总数平均增加了24%；与传统的仅采用胰蛋白酶的自下而上蛋白质组学分析相比，额外鉴定出216种非伪影修饰。该方法具有良好的可重复性，且不会增加样品制备或分析时间。来自每种蛋白酶的肽段均可为定量具有重叠性的蛋白质提供独立机会。我们据此开发了一种定量模型：针对每种蛋白质，选择数据最完整的蛋白酶进行定量，同时利用另一种蛋白酶推断缺失值。这种跨蛋白酶推断的准确性高于替代性的最小值插补、均值插补或最近邻插补。最后，通过HTA蛋白酶肽段发现的生物标志物适用于快速的仅使用HTA蛋白酶的蛋白质组学工作流程，从而简化了从发现到可现场应用的转化过程。
利益冲突声明
S.K.是CinderBio（HTA蛋白酶制造商）的有偿顾问，同时也是ProteoPulse LLC的创始人。其余脚注
https://github.com/ProteoPulse/Two-Protease-Paper
https://massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/private-dataset.jsp?task=246336a21e…
已声明的资助方信息
国家普通医学科学研究所 ，5R44GM128540
美国国立卫生研究院 ，1R01HL180612-01A1 ，#5U01DK124019-04 ，#5U01DK127403-03
国家心肺血液研究所院内研究部， https://ror.org/023ny1p48 ，T32HL170963-03
版权
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保留所有权利。未经许可不得重复使用。
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发布于2026年10月6日。
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利用胰蛋白酶+HTA蛋白酶工作流程结合蛋白质组的两种视角
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利用胰蛋白酶+HTA蛋白酶工作流程结合蛋白质组的两种视角
Mario Alba ，
Ajay Bharadwaj ，
Lindsey Becker ，
Ethan J Canfield ，
Jonathan E Katz ，
Jennifer E Van Eyk ，
Simion Kreimer
bioRxiv 2026.10.05.756883； doi： https://doi.org/10.64898/2026.10.05.756883
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利用胰蛋白酶+HTA蛋白酶工作流程结合蛋白质组的两种视角
Mario Alba ，
Ajay Bharadwaj ，
Lindsey Becker ，
Ethan J Canfield ，
Jonathan E Katz ，
Jennifer E Van Eyk ，
Simion Kreimer
bioRxiv 2026.10.05.756883； doi： https://doi.org/10.64898/2026.10.05.756883
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.10.05.756883v1?rss=1
🏷️ 蛋白质组学 HTA蛋白酶 胰蛋白酶消化 液相色谱-质谱 肽段互补性 蛋白质定量与缺失值插补