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受限大环肽能够结合蛋白质表面上既难以被小分子靶向、也难以被生物制剂识别的区域，但要在文库规模上制备此类肽，仍依赖化学合成和大环化流程，而这些流程通常耗时、专业性强且难以实现并行化。我们描述了一种适用于96孔板的重组二硫键桥联环肽制备流程，从而降低了这一技术门槛。肽编码序列通过延伸PCR和体内组装（IVA）克隆导入，每个变体的成本约为2美元；随后将其表达为小泛素样修饰蛋白（SUMO）融合蛋白，并分泌至具有氧化环境的周质空间，在其中分子内二硫键自发形成；最后通过固定化金属亲和层析（IMAC）纯化，并结合分析型尺寸排阻色谱（SEC）进行分析。从设计方案列表到获得经过表征的材料，整个流程约需一周，其中大部分时间无需人工干预。将该流程应用于针对9种蛋白质靶标的60种设计组成的文库后，60种设计均获得了纯化产物；每6 mL培养液的总可溶性产物中位产量约为135微克（范围为9至261微克），且产量因靶标而异。对其中38种设计进行Ellman试剂测定显示，二硫键形成失败由序列驱动，且与产量不相关，从而检测出一种色谱分析无法显现的失败模式。表面等离子体共振实验确认了靶标结合，并表明重组SUMO融合构建体保留了与相应单独肽形式相当的亲和力。作为通用型重组平台的补充，该流程能够实现更高通量的二硫键大环肽筛选，并适用于部分或完全自动化的工作流程。
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摘要
受约束的宏环肽能够结合小分子和生物制剂均难以作用的蛋白质表面，但要实现其文库规模的制备，目前仍依赖化学合成和宏环化流程，而这些流程速度较慢、专业要求高且难以并行化。我们描述了一种适用于 96 孔板的二硫键稳定环肽重组制备流程，从而降低了这一门槛。通过延伸 PCR 和体内组装（IVA）克隆引入肽编码序列，单个变体的成本约为 2 美元；随后将其表达为小泛素样修饰蛋白（SUMO）融合蛋白，并分泌至具有氧化环境的周质空间，在此处分子内二硫键自发形成；最后通过固定化金属亲和层析（IMAC）纯化，并结合分析型体积排阻色谱（SEC）进行分析。从设计方案列表到获得经表征的材料，整个流程约需一周，其中大部分时间无需人工操作。将该流程应用于针对 9 个蛋白质靶标的 60 个设计组成的文库时，所有 60 个设计均获得了纯化产物；每 6 mL 培养物的总可溶性产量中位数约为 135 微克（范围为 9–261 微克），且因靶标不同而有所变化。针对 38 个设计进行的 Ellman 测定表明，二硫键形成失败由序列驱动，与产量不相关；该测定能够检测出色谱分析无法显现的失败模式。表面等离子体共振证实了靶标结合，并显示重组 SUMO 融合构建体保留了与相应的仅含肽形式相当的亲和力。作为通用重组平台的补充，该流程能够实现更高通量的二硫键宏环筛选，并适用于部分或完全自动化的工作流程。
利益冲突声明
DB 和 GB 是 Vilya Therapeutics 的联合创始人、顾问及股东。Vilya Therapeutics 是一家生物技术公司。
脚注
https://doi.org/10.5281/zenodo.23035383
https://github.com/yensiflores/dsPep-pipeline
资助者信息声明
欧盟委员会 ，101059124
美国国立卫生研究院 ，5R21AI178088-02
美国国立普通医学科学研究院 ，R35GM163670
霍华德·休斯医学研究所， https://ror.org/006w34k90
版权
本预印本的。
本预印本依据 CC-BY 4.0 国际许可协议 公开发布。
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发布于 2026 年 9 月 30 日。
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一种可扩展的二硫键稳定肽重组制备流程
Yensi Flores Bueso
，
Gizem Gokce-Alpkilic
，
Jihun Jeung
，
Stephen Rettie
，
Xinting Li
，
Mark Tangney
，
David Baker
，
Gaurav Bhardwaj
bioRxiv 2026.09.29.755317； doi： https://doi.org/10.64898/2026.09.29.755317
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，
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，
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，
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，
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，
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bioRxiv 2026.09.29.755317； doi： https://doi.org/10.64898/2026.09.29.755317
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.29.755317v1?rss=1
🏷️ 二硫键交联肽 大环肽重组制备 SUMO融合表达 高通量筛选 周质分泌表达 蛋白质工程