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基于质谱的免疫肽组学受到肽段鉴定能力的限制。HLA I类配体是非胰蛋白酶切肽，通常带有较低的电荷态，并且常常发生不完全碎裂；然而，几乎所有工作流程都依赖单一的活化方法，即高能碰撞解离（higher-energy collisional dissociation，HCD）。不同于蛋白质组学中通过多个肽段推断蛋白质，在免疫肽组学中，肽段本身既是分析物，也是候选治疗靶标，因此，一个未被鉴定的配体就意味着一个未被发现的靶标。在此，我们评估了两种替代性活化化学方法——离子阱碰撞诱导解离（collision-induced dissociation，CID）和红外多光子解离（infrared multiphoton dissociation，IRMPD）——能否挽回HCD无法鉴定的配体。据我们所知，这是上述任一方法首次应用于HLA I类免疫肽组学；Orbitrap Tribrid Apex MultiOmics集成的红外激光器使该应用成为可能。我们对4种经过HLA分型的细胞系进行了技术重复分析，并分别以标准人类蛋白质组数据库和基于Ribo-seq获得的隐匿开放阅读框（ORF）数据库作为检索空间。由于碎片强度预测模型几乎完全基于HCD谱进行训练，我们针对每种方法分别对AlphaPeptDeep进行了微调；微调和Percolator重新评分使每种细胞系与方法组合中的独特肽段鉴定数均有所增加（标准蛋白质组的中位增幅为+17.1%，隐匿ORF的中位增幅为+54.5%）；微调后的模型还可跨细胞系迁移使用，中位损失仅为0.4%，从而使3种方法处于共同的分析基准之上。在这一基准下，3种方法获得的免疫肽组规模和组成相近，但每种方法都能鉴定出其他方法遗漏的肽段。HCD产生最完整的碎片离子梯，并从具有碱性末端锚定位点的等位基因A*11:01和A*33:03中鉴定出更多肽段；这两种等位基因均属于A3超型。对于不含赖氨酸、精氨酸或组氨酸的肽段，CID和IRMPD在4种细胞系中的3种细胞系中鉴定出更大比例的不具有碱性C末端锚定位点的等位基因，并获得更高的检索评分以及更多匹配的b/y离子电流。因此，每种方法都贡献了其他方法无法获得的特异性肽段；在固定使用3次LC-MS/MS运行的条件下，每种方法各运行1次，在全部4种细胞系中平均获得的独特肽段数均多于采用单一方法进行3次重复运行（增幅为+0.4%至+10.9%）。在两种癌细胞系（HCT116和MDA-MB-231）中发现的239个新型、预测可与HLA结合且未被Immune Epitope Database收录的标准蛋白质组来源配体中，55%仅由一种方法检测到；其中9个来源于癌症相关抗原。因此，CID和IRMPD能够提供仅凭HCD可能无法鉴定的序列，或为一类具有特定化学特征的配体提供质量更高的谱图。它们的价值在于与HCD协同，而不是取代HCD；要实现这一价值，需要构建针对这些化学方法的碎片强度模型和数据采集方案，而非将HCD模型和方案直接加以改造。
基于质谱的免疫肽组学受限于肽段鉴定。HLA I类配体为非胰蛋白酶切肽，通常带有较低的电荷态，且常常无法实现完全碎裂；然而，几乎所有工作流程都依赖单一的活化方法，即高能碰撞解离（higher-energy collisional dissociation，HCD）。与蛋白质组学不同，在蛋白质组学中，通常依据多个肽段推断蛋白质；而在免疫肽组学中，肽段本身既是分析物，也是候选治疗靶点。因此，一个未被鉴定的配体，就意味着一个未被发现的靶点。在本研究中，我们评估了两种替代性的活化化学方法——离子阱碰撞诱导解离（collision-induced dissociation，CID）和红外多光子解离（infrared multiphoton dissociation，IRMPD）——能否鉴定出HCD无法鉴定的配体。据我们所知，这是上述任一方法首次应用于HLA I类免疫肽组学；Orbitrap Tribrid Apex MultiOmics集成的红外激光器使这一应用成为可能。我们选取了4种经HLA分型的细胞系，针对规范人类蛋白质组数据库和基于Ribo-seq构建的隐匿性开放阅读框（cryptic ORF）数据库，分别进行了3次技术重复分析。由于碎片强度预测模型几乎完全基于HCD谱图训练，我们针对每种方法分别对AlphaPeptDeep进行了微调；微调和Percolator重新评分使每种细胞系与方法组合中的独特肽段鉴定数均有所增加（规范蛋白质组的中位数增幅为+17.1%，隐匿性ORF的中位数增幅为+54.5%）；此外，微调后的模型可跨细胞系迁移使用，鉴定数量的中位数损失仅为0.4%，从而使这3种方法处于共同的分析基准之上。在这一共同基准下，3种方法获得的免疫肽组在规模和组成上相近，但每种方法都能鉴定出其他方法遗漏的肽段。HCD产生最完整的碎片离子梯，并从具有碱性锚定位点的等位基因A*11:01和A*33:03中鉴定出更多肽段；这两个等位基因均属于A3超型。对于不含赖氨酸、精氨酸或组氨酸的肽段，CID和IRMPD在4种细胞系中的3种细胞系中均获得了更高的检索评分以及更多匹配的b/y离子流；同时，这两种方法从不具有碱性C端锚定位点的等位基因中鉴定出的肽段比例更高。因此，每种方法都贡献了其他方法无法鉴定的特异性肽段；在固定进行3次LC-MS/MS运行的预算下，每种方法各进行1次运行，在全部4种细胞系中平均鉴定到的独特肽段数均高于单一方法进行3次重复运行（增加+0.4%至+10.9%）。在两种癌细胞系（HCT116和MDA-MB-231）中，有239个新发现的、预测可结合HLA的规范蛋白质组肽段未被收录于Immune Epitope Database，其中55%仅由一种方法检测到；其中9个来源于癌症相关抗原。因此，CID和IRMPD能够提供仅凭HCD可能无法鉴定的肽段序列，或针对化学性质明确的一类配体获得质量更高的谱图。它们的价值在于与HCD协同使用，而不是取代HCD；要充分发挥这些方法的价值，需要构建针对其自身化学特性的碎片强度模型和采集方案，而非从HCD方法改造而来。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.24.754253v1?rss=1
🏷️ HLA I类免疫肽组学 质谱碎裂方法 HCD/CID/IRMPD 隐匿开放阅读框 碎片强度预测