探究从头设计的α-螺旋桶状生物催化剂对序列变异的耐受性

近年来，从头设计的酶已在全新蛋白质骨架中实现了较高的催化活性和立体选择性，同时表现出优异的热稳定性。其中，α-螺旋桶状蛋白骨架因其结构简洁、热稳定性高以及序列模式具有理性可解释性，成为生物催化领域颇具吸引力的结构。然而，在保持骨架结构、稳定性和催化活性的同时，对此类骨架进行大幅度结构重构，并进一步提高可溶性蛋白的表达产量，仍是重大挑战，也引出了一个根本性问题：从头设计的骨架–序列组合具有多大的可工程化程度？在此，我们结合基于深度学习的方法与经典计算蛋白质设计方法，对从头设计的α-螺旋桶状生物催化剂进行改造和优化。以此前报道的六螺旋桶状蛋白6H5L为模型骨架，AlphaFold2指导的RosettaRemodel实现了一种截短变体的设计，其晶体结构与设计模型高度吻合。进一步利用ProteinMPNN进行序列重设计，获得了一个在大肠杆菌中可溶性蛋白产量提高十倍的变体。生化、生物物理学和结构分析表明，这两种变体均保留了整体桶状结构、高热稳定性以及在纯化蛋白和全细胞体系中的催化活性。对这些变体进行的详细动力学分析显示，kcat和Km均发生了变化，反映出催化周转和底物结合能力的改变。总体而言，这些方法为进一步改造具有功能的从头设计α-螺旋桶状蛋白提供了新的认识和可能性，揭示了其承受大幅度序列变化的能力，并拓展了其在生物催化和生物技术领域中的应用前景。

从头设计的酶近期已在全新蛋白质骨架中实现了较高的催化活性和立体选择性，同时展现出卓越的热稳定性。其中，α-螺旋桶状蛋白骨架因其结构简单、热稳定性高以及序列模式可进行理性设计，成为极具吸引力的生物催化结构。然而，如何在维持这些骨架的结构、稳定性和催化活性的同时，对其进行大幅度的结构重构，并进一步提高可溶性蛋白的产量，仍是主要挑战；这也提出了一个根本性问题：从头设计的骨架—序列组合究竟具有多大的可工程化空间。在此，我们结合基于深度学习的方法与经典计算蛋白质设计方法，对从头设计的α-螺旋桶状生物催化剂进行改造和优化。以此前报道的六螺旋桶状蛋白6H5L作为模型骨架，在AlphaFold2指导下采用RosettaRemodel，成功设计出一种截短变体，其晶体结构与设计模型高度吻合。进一步利用ProteinMPNN进行序列重新设计，获得了一个在大肠杆菌中可溶性蛋白产量提高十倍的变体。生化、生物物理学和结构分析表明，这两种变体均保留了整体桶状结构、高热稳定性以及在纯化蛋白体系和全细胞体系中的催化活性。对这些变体进行的详细动力学分析显示，二者的kcat和Km均发生了变化，反映出催化周转和底物结合能力的改变。总体而言，这些方法为进一步改造具有功能的从头设计α-螺旋桶状蛋白提供了新的见解和可能性，揭示了其承受大幅度序列变化的能力，并拓展了其在生物催化和生物技术领域中的应用前景。

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🏷️ 从头蛋白质设计 α-螺旋桶状蛋白 蛋白质工程 序列变异耐受性 生物催化 计算蛋白质设计