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RNA引导核酸酶（RNA-guided nucleases，RGNs），如化脓性链球菌（*Streptococcus pyogenes*）来源的Cas9（SpCas9），已广泛应用于植物基因组编辑。此前针对脱靶效应（即对与预期靶标具有相似性的非预期靶标进行修饰）的研究表明，SpCas9在植物细胞中具有较高的特异性。然而，针对经过效率优化的编辑系统联合大规模多重编辑的脱靶效应尚未进行评估，而这种组合可能会增加在非预期位点发生切割的可能性。因此，我们分析了拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）品系，这些品系利用zCas9i进行了大规模诱变，经过数轮编辑，最多使用29条gRNA，靶向超过45个位点。我们采用短读长和长读长测序技术对基因组进行了测序，并对全基因组变异进行了编目。我们的变异检测流程能够可靠地检测出RGN在靶向位点诱导的突变。在排除这些靶向位点修饰后，我们在编辑品系中检测到的变异频率与此前报道的自发突变频率相近。在进一步分析中，我们未发现任何证据表明这些变异源于RGN活性。因此，我们的数据与SpCas9具有高特异性的结论一致。相比之下，我们在两个复杂位点RPP1和RPP7的编辑过程中检测到基因组重组事件，这两个位点包含多个同源基因；此外，我们还通过全基因组测序（WGS）鉴定出一个通过扩增子测序未能检测到的等位基因。我们据此得出结论：尽管可以通过选择特异性gRNA有效避免脱靶事件，但靶向位点的修饰可能比预期更为广泛，尤其是在复杂位点和/或进行多重编辑时。
RNA引导的核酸酶（RNA-guided nucleases，RGNs），例如来源于化脓性链球菌（*Streptococcus pyogenes*）的Cas9（SpCas9），已广泛用于植物基因组编辑。以往针对脱靶效应的调查——即对与预期靶标具有相似性的非预期靶位点进行修饰——表明，SpCas9在植物细胞中具有较高的特异性。然而，对于结合广泛多重化的效率优化型编辑系统，尚未开展脱靶效应评估，而这种组合可能会增加在非预期位点发生切割的可能性。因此，我们分析了拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）品系。这些品系采用zCas9i进行广泛诱变，并在数轮编辑过程中使用多达29条gRNA，针对超过45个靶位点。研究采用短读长和长读长测序技术对基因组进行测序，并对全基因组变异进行了编目。
我们的变异检测流程能够可靠地检测出RGN在靶位点诱导的突变。在排除这些靶位点修饰后，编辑品系中检测到的变异频率与此前报道的自发突变频率相近。在进一步分析中，我们未发现任何证据表明这些变异源于RGN活性。因此，我们的数据与SpCas9具有高特异性的结论一致。相比之下，我们在两个复杂位点RPP1和RPP7处检测到编辑诱导的基因组重组事件；这两个位点均包含多个同源基因。此外，我们还通过全基因组测序（WGS）鉴定出一个采用扩增子测序未能检测到的等位基因。我们得出结论：尽管可以通过筛选特异性gRNA有效避免脱靶位点，但靶位点修饰的范围可能比预期更广，尤其是在复杂位点和/或多重编辑过程中。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.28.754964v1?rss=1
🏷️ 拟南芥 CRISPR/Cas9基因编辑 多重基因编辑 脱靶效应 全基因组测序 gRNA特异性