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越来越多的研究认识到，改变mRNA剪接的非编码变异是孟德尔遗传病的重要病因之一。能够激活隐匿外显子（cryptic exons，CEs）的深度内含子变异（deep intronic variants，DIVs）导致约20%的遗传性视网膜疾病（inherited retinal diseases，IRDs）病例，但目前仍难以准确预测内含子变异的致病性。因此，我们采用高通量剪接检测（high-throughput splicing assay，HTSA）评估伴有一个已确认致病变异的隐性IRDs中罕见深度内含子变异的影响。在76例患者中，我们选取了640个极罕见的深度内含子变异，这些变异与已知突变处于反式位置。我们使用HTSA对其进行检测。该检测系统由一个split-GFP微基因构成，其中插入了SMN1基因的一个内含子，并将包含DIV侧翼序列的270 bp片段克隆至该内含子中。随后，将质粒文库转染至293HEK细胞，48小时后从转染细胞中提取总RNA。通过RT-PCR扩增由HTSA微基因产生的RNA转录本并进行测序，进而鉴定并定量剪接于两个GFP外显子之间的内含子序列。在改变型寡核苷酸中，98个变异诱导的CE激活水平较参考寡核苷酸高出100倍以上，因此在该实验条件下被归类为致病性变异；在更长的序列背景中进行验证后，26个变异被归类为临床意义未明变异（VUS）。值得注意的是，在90个变异中，仅有6个（6.6%）被计算机模拟算法（SpliceAI）预测为致病性变异，这表明预测算法仍有很大的改进空间。该实验结果为78例患者中的50例（64%）确诊提供了支持。因此，研究显示19.4%的深度内含子变异可导致CE激活。由此可以推断，相当一部分尚未确诊的隐性IRDs患者携带能够致病的内含子突变。
隐性遗传性视网膜疾病深部内含子变异的体外致病性评估 | bioRxiv
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隐性遗传性视网膜疾病深部内含子变异的体外致病性评估
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Marianna Weener
， Kevin Valestil
， Emily Place
， Sudeep Mehrotra
， Daniel Navarro
， Hilary Scott
， Kinga Bujakowska
， Eric Pierce
doi： https://doi.org/10.64898/2026.09.18.752412
Marianna Weener 眼科基因组学研究所，麻省眼耳医院，哈佛医学院
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通讯作者： marianna.weener{at}gmail.com
Kevin Valestil 眼科基因组学研究所，麻省眼耳医院，哈佛医学院
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Emily Place 眼科基因组学研究所，麻省眼耳医院，哈佛医学院
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Sudeep Mehrotra 眼科基因组学研究所，麻省眼耳医院，哈佛医学院
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Daniel Navarro 眼科基因组学研究所，麻省眼耳医院，哈佛医学院
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Hilary Scott 眼科基因组学研究所，麻省眼耳医院，哈佛医学院
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Kinga Bujakowska 眼科基因组学研究所，麻省眼耳医院，哈佛医学院
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Eric Pierce 眼科基因组学研究所，麻省眼耳医院，哈佛医学院
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摘要
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摘要
越来越多的研究表明，改变信使 RNA 剪接的非编码变异是孟德尔遗传病的重要病因。能够激活隐匿外显子（cryptic exons，CEs）的深部内含子变异（deep intronic variants，DIVs）约占遗传性视网膜疾病（inherited retinal diseases，IRDs）病例的20%。然而，目前仍难以准确预测内含子变异的致病性。因此，我们采用高通量剪接分析（high-throughput splicing assay，HTSA），检测隐性遗传性视网膜疾病中罕见深部内含子变异的影响；这些病例均携带一个已确认的致病变异。研究从76名患者中筛选出640个极罕见的深部内含子变异，这些变异与已知突变处于反式位置。我们使用HTSA对其进行检测。该检测系统由一个split-GFP微基因构成，其中插入了一个SMN1基因内含子，并将围绕DIV的270 bp侧翼序列克隆至该内含子中。随后，将质粒文库转染至293HEK细胞中，并在48小时后从转染细胞中提取总RNA。通过RT-PCR扩增HTSA微基因产生的RNA转录本并进行测序，从而鉴定并定量位于两个GFP外显子之间的内含子序列剪接情况。共有98个变异在变异寡核苷酸中的隐匿外显子激活水平较参考寡核苷酸高100倍以上，因此在该实验条件下被归类为致病性变异；在更长序列背景中进行验证后，另有26个变异被归类为意义未明变异（VUS）。值得注意的是，在90个变异中，只有6个（6.6%）被计算机预测算法（SpliceAI）预测为致病性变异，这表明变异致病性预测算法仍有较大的改进空间。该实验结果确认了78名患者中50名（64%）的诊断。因此，研究显示，19.4%的深部内含子变异可导致隐匿外显子激活。由此可以推断，部分尚未确诊的隐性遗传性视网膜疾病患者携带能够致病的内含子突变，并由此导致疾病发生。
利益冲突声明
脚注
https://github.com/meei-ogi/intron-variant-effect
基金信息声明
美国国立卫生研究院国家眼科研究所 EY012910 EY020902
版权
。 保留所有权利。未经许可不得重复使用。
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发布于2026年9月24日。
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隐性遗传性视网膜疾病深部内含子变异的体外致病性评估
Marianna Weener
， Kevin Valestil
， Emily Place
， Sudeep Mehrotra
， Daniel Navarro
， Hilary Scott
， Kinga Bujakowska
， Eric Pierce
bioRxiv 2026.09.18.752412； doi： https://doi.org/10.64898/2026.09.18.752412
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隐性遗传性视网膜疾病深部内含子变异的体外致病性评估
Marianna Weener
， Kevin Valestil
， Emily Place
， Sudeep Mehrotra
， Daniel Navarro
， Hilary Scott
， Kinga Bujakowska
， Eric Pierce
bioRxiv 2026.09.18.752412； doi： https://doi.org/10.64898/2026.09.18.752412
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.18.752412v1?rss=1
🏷️ 深部内含子变异 遗传性视网膜疾病 RNA剪接 隐匿外显子激活 高通量剪接检测 变异致病性评估