组合式 CRISPR/Cas12a 以极低效率切除哺乳动物基因组中的靶向位点

CRISPR/Cas12a系统能够从单个启动子加工产生多个引导RNA（gRNA），因此已成为一种极具实用价值的基因组编辑工具。本研究通过在靶向外显子的上游和下游诱导双链断裂（DSB），探讨了组合式CRISPR/Cas12a系统切除哺乳动物基因组中特定位点的潜力。我们设计了一个gRNA对文库，分别靶向18个必需基因的54个外显子和10个非必需基因的17个外显子两侧的内含子区域，旨在评估Cas12切除靶向位点的效率。尽管直接靶向必需外显子的单个gRNA会在细胞中产生预期的适应度缺陷，但靶向侧翼内含子区域的gRNA对仅导致了轻微的存活率影响，这表明位点切除很少发生。进一步分析显示，gRNA效率、方向、GC含量或切割位点几何构型与位点切除成功率之间均不存在有意义的相关性。这些结果表明，在所测试的条件下，Cas12a系统无法以满足高灵敏度负向选择实验要求的效率实现位点切除。

CRISPR/Cas12a系统因能够从单一启动子加工产生多个向导RNA（gRNA），已成为一种极具实用价值的基因组编辑工具。在本研究中，我们通过在目标外显子的上游和下游诱导双链断裂（DSB），探究了组合式CRISPR/Cas12a切除哺乳动物基因组中特定位点的潜力。我们设计了一个gRNA对文库，分别靶向18个必需基因的54个外显子和10个非必需基因的17个外显子两侧的内含子区域，旨在评估Cas12切除目标位点的效率。尽管直接靶向必需外显子的单个gRNA可在细胞中产生预期的适应性缺陷，但靶向两侧内含子区域的gRNA对仅导致极其轻微的细胞存活率影响，这表明目标位点很少发生切除。进一步分析显示，gRNA的效率、方向、GC含量或切割位点几何构型与位点切除的成功之间均不存在有意义的相关性。这些结果表明，在所测试的条件下，Cas12a系统无法以满足高灵敏度负向选择实验要求的效率实现位点切除。

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.21.753273v1?rss=1

🏷️ CRISPR/Cas12a 基因组编辑 引导RNA 双链断裂 外显子切除 哺乳动物细胞