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高效DNA递送仍是工程化非传统酵母面临的最大障碍之一，限制了其遗传驯化及其作为下一代微生物细胞工厂的开发利用。在此，我们提出BRIDGE（Bacteria-to-yeast Rapid Interkingdom DNA Gene Exchange，细菌到酵母的快速跨界DNA基因交换）——一种用于广宿主范围跨界DNA递送的综合性合成生物学平台。BRIDGE以一个紧凑的6 kb Pan/ARS-oriT广宿主范围BRIDGE载体为核心，并由超接合型辅助质粒pSC5提供支持。利用BRIDGE，我们将跨界DNA转移的范围从仅能借助pSC5实现的4个属的代表性物种，扩展至10个具有系统发育多样性的酵母属，包括Saccharomyces、Maudiozyma、Starmerella、Kazachstania、Yarrowia、Zygosaccharomyces、Lachancea、Kluyveromyces、Pichia和Komagataella。为展示BRIDGE的多功能性，我们构建了一个16 kb的可视化报告系统，其中携带来自Chromobacterium violaceum的合成五基因紫色杆菌素生物合成途径。首先利用YeastFab模块化克隆系统构建各个独立的转录单元，随后通过在Saccharomyces cerevisiae中进行一步式体内同源重组，将其组装为完整途径，并利用EASY-C平台快速回收质粒。该报告系统成功递送至上述10个酵母属，证明BRIDGE能够介导完整多基因合成途径的转移。在所测试的6种Saccharomyces物种中均观察到稳健的紫色杆菌素产生，为转化子鉴定提供了快速的可视化标志；与此同时，在Kazachstania和Kluyveromyces中也检测到适度的功能性途径表达。在其余属中，尽管未出现可见的色素形成，但仍成功实现了途径转移，这表明对于亲缘关系较远的酵母而言，异源途径表达的主要决定因素是调控兼容性，而非DNA转移本身。总体而言，BRIDGE建立了一种综合性的“设计—构建—回收—递送”工作流程，将转录单元的模块化体外构建、多基因途径的一步式体内组装、利用EASY-C平台进行的快速质粒回收，以及广宿主范围的跨界DNA递送相结合。该多功能框架能够实现对既往难以进行遗传改造的微生物的快速遗传改造，拓展了面向可持续生物制造和工业生物技术的合成生物学工具箱。
高效DNA递送仍然是工程化非传统酵母所面临的最大障碍之一，限制了其遗传驯化及其作为下一代微生物细胞工厂的开发利用。在此，我们提出BRIDGE（Bacteria-to-yeast Rapid Interkingdom DNA Gene Exchange，细菌到酵母的快速跨界DNA基因交换），这是一个用于广宿主跨界DNA递送的一体化合成生物学平台。BRIDGE以一个紧凑的6 kb Pan/ARS-oriT广宿主BRIDGE载体为核心，并由超接合辅助质粒pSC5提供支持。利用BRIDGE，我们将跨界DNA转移的范围从仅能借助pSC5实现的4个属的代表菌株，扩展至10个具有系统发育多样性的酵母属，包括Saccharomyces、Maudiozyma、Starmerella、Kazachstania、Yarrowia、Zygosaccharomyces、Lachancea、Kluyveromyces、Pichia和Komagataella。为展示BRIDGE的多功能性，我们构建了一个16 kb的可视化报告载体，其中携带来自Chromobacterium violaceum的合成五基因紫色杆菌素生物合成途径。首先利用YeastFab模块化克隆系统构建各个独立的转录单元，随后在Saccharomyces cerevisiae中通过一步法体内同源重组将其组装为完整途径，并进一步利用EASY-C平台快速回收质粒。该报告载体成功递送至上述10个酵母属，证明BRIDGE能够介导完整多基因合成途径的转移。在所测试的6种Saccharomyces物种中均观察到稳健的紫色杆菌素产生，为转化子的鉴定提供了快速的可视化标记；此外，在Kazachstania和Kluyveromyces中也检测到适度的功能性途径表达。在其余各属中，尽管未观察到可见的色素形成，仍成功实现了途径转移，这表明对于亲缘关系较远的酵母而言，异源途径表达的主要决定因素是调控兼容性，而非DNA转移本身。总体而言，BRIDGE建立了一套一体化的“设计—构建—回收—递送”（Design-Build-Recover-Deliver）工作流程，将转录单元的模块化体外构建、多基因途径的一步法体内组装、利用EASY-C平台进行的快速质粒回收，以及广宿主跨界DNA递送加以整合。该通用框架能够实现对以往难以改造的微生物进行快速遗传修饰，从而拓展面向可持续生物制造和工业生物技术的合成生物学工具箱。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.17.752325v1?rss=1
🏷️ 跨界DNA递送 非传统酵母 合成生物学 遗传驯化 多基因途径转移