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有机氟化合物广泛存在于现代社会中，但其持久性对环境和健康构成了重大风险。氟乙酸脱卤酶（FAcD）能够在温和条件下高效水解 C–F 键，因此是多氟化物生物修复的有力候选。然而，它们对偕二氟代羧酸（如 2,2-二氟乙酸（F2A））的活性通常较低，其反应速率比对单氟代底物（如氟乙酸）的反应速率低数个数量级。在本研究中，我们结合动力学研究、质谱与生化分析以及计算建模，确定了 F2A 诱导催化性天冬氨酸（Asp105）发生异构化是导致酶失活的主要途径之一，并严重限制了 F2A 的持续转化。为克服这一抑制机制，我们发现高度保守的组氨酸（His104）充当了维持 F2A 活性的“守门员”。以非经典氨基酸 N3-甲基组氨酸替换 His104 后，酶活性提高了 14 倍；而将其替换为天冬酰胺后，酶活性提高了近 50 倍，获得了一种强效的 F2A 脱氟酶，其初始降解速率达到 0.3 s⁻¹。计算研究表明，这些替换重塑了 Asp105 的构象景观，在保留有利于 F2A 转化的催化有效构象的同时，抑制了促进异天冬氨酸形成的构象。值得注意的是，将 His 替换为 Asn 的突变移植到两个同源 FAcD 中后，二者的活性均大幅降低，表明 H1 是工程化促进 F2A 兼性转化的独特适宜支架。总体而言，本研究证明，针对机制层面的精细特征进行改造能够显著提升 FAcD 对 F2A 的催化性能，并为进一步工程化改造 H1 以降解多氟化污染物奠定了基础。
以保守组氨酸替代缓解氟乙酸脱卤酶中由二氟乙酸依赖的异天冬氨酸形成｜bioRxiv
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以保守组氨酸替代缓解氟乙酸脱卤酶中由二氟乙酸依赖的异天冬氨酸形成
查看 ORCID 记录 Suzanne C. Jansen ， 查看 ORCID 记录 Luis F. Guerra ， 查看 ORCID 记录 Cristina Duran ， 查看 ORCID 记录 Manuel M. Muelller ， 查看 ORCID 记录 Silvia Osuna ， 查看 ORCID 记录 Clemens Mayer
doi： https://doi.org/10.64898/2026.09.12.751135
Suzanne C. Jansen 1 格罗宁根大学； 在 Google Scholar 中查找该作者 在 PubMed 中查找该作者 在本网站中搜索该作者 Suzanne C. Jansen 的 ORCID 记录
Luis F. Guerra 2 伦敦国王学院； 在 Google Scholar 中查找该作者 在 PubMed 中查找该作者 在本网站中搜索该作者 Luis F. Guerra 的 ORCID 记录
Cristina Duran 3 赫罗纳大学； 在 Google Scholar 中查找该作者 在 PubMed 中查找该作者 在本网站中搜索该作者 Cristina Duran 的 ORCID 记录
Manuel M. Muelller 2 伦敦国王学院； 在 Google Scholar 中查找该作者 在 PubMed 中查找该作者 在本网站中搜索该作者 Manuel M. Muelller 的 ORCID 记录
Silvia Osuna 4 赫罗纳大学与加泰罗尼亚研究与高等研究院（ICREA） 在 Google Scholar 中查找该作者 在 PubMed 中查找该作者 在本网站中搜索该作者 Silvia Osuna 的 ORCID 记录
Clemens Mayer 1 格罗宁根大学； 在 Google Scholar 中查找该作者 在 PubMed 中查找该作者 在本网站中搜索该作者 Clemens Mayer 的 ORCID 记录
通讯作者： c.mayer{at}rug.nl
摘要
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摘要
有机氟化物广泛存在于现代社会中，但其持久性对环境和健康构成了重大风险。氟乙酸脱卤酶（FAcD）能够在温和条件下高效水解 C–F 键，因此是多氟化物生物修复的有前景候选者。然而，它们对偕二氟代羧酸（如 2,2-二氟乙酸（F₂A））的活性通常较弱，其反应速率比对单氟化底物（如氟乙酸）的反应速率低几个数量级。本研究结合动力学研究、质谱与生化分析以及计算建模，确定了由 F₂A 诱导的催化性天冬氨酸（Asp105）异构化，是严重限制 F₂A 持续周转的主要失活途径。为克服这一抑制机制，我们发现一种高度保守的组氨酸（His104）是维持 F₂A 活性的“守门员”。将 His104 替换为非天然氨基酸 N³-甲基组氨酸后，活性提高了 14 倍；而将其替换为天冬酰胺则使活性提高了近 50 倍，得到了一种高效的 F₂A 脱氟酶，其初始降解速率达到 0.3 s⁻¹。计算研究表明，这些替换重塑了 Asp105 的构象能景观，在保留有利于 F₂A 转化的催化有效构象的同时，抑制了促进异天冬氨酸形成的构象。值得注意的是，将 His-to-Asn 替换引入两种同源 FAcD 后，其活性大幅降低，这凸显了 H1 是工程化改造以实现多功能 F₂A 转化的独特适宜支架。总体而言，本研究表明，针对机制层面的精细特征进行改造能够显著提升 FAcD 对 F₂A 的催化性能，并为进一步改造 H1 以降解多氟化污染物奠定了基础。
利益冲突声明
已声明的资助信息
欧洲研究委员会， https://ror.org/0472cxd90 ERC-2024-COG 101125957 ERC-2022-CoG-101088032 ERC-2022-POC-101112805 ERC-2023-POC-101158166
荷兰研究委员会， OCENW.M20.278 OCENW.XS24-4.245
英国研究与创新机构， EPSRC EP/Z000823/1
加泰罗尼亚政府， SGR 2021 00487
科学、创新与大学部， https://ror.org/05r0vyz12 PID2021-129034NB-I00 PDC2022-133950-I00
版权
。
该内容依据 CC-BY 4.0 国际许可协议 公开提供。
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发布于 2026 年 9 月 18 日。
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Suzanne C. Jansen ， Luis F. Guerra ， Cristina Duran ， Manuel M. Muelller ， Silvia Osuna ， Clemens Mayer
bioRxiv 2026.09.12.751135； doi： https://doi.org/10.64898/2026.09.12.751135
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以保守组氨酸替代缓解氟乙酸脱卤酶中由二氟乙酸依赖的异天冬氨酸形成
Suzanne C. Jansen ， Luis F. Guerra ， Cristina Duran ， Manuel M. Muelller ， Silvia Osuna ， Clemens Mayer
bioRxiv 2026.09.12.751135； doi： https://doi.org/10.64898/2026.09.12.751135
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.12.751135v1?rss=1
🏷️ 氟乙酸脱卤酶 酶工程改造 异天冬氨酸形成 二氟乙酸脱氟 蛋白质定向改造