邻近标记辅助的流式细胞术提高细胞外囊泡富集组分中的荧光对比度

细胞外囊泡（EVs）是循环生物标志物的潜在来源，但疾病相关EV通常较为稀少，且其纳米尺度的大小限制了传统流式细胞术对其进行分析。为利用广泛可用的仪器提高疾病相关EV信号的检测能力，我们建立了一种工作流程，将通过体积排阻色谱法制备血清EV富集组分、CHL1介导的酶介导自由基源激活（EMARS）邻近标记技术以及常规流式细胞术相结合。EMARS可在邻近抗体结合的CHL1的分子上沉积荧光素，从而增强由靶标启动的荧光。在一项代表性比较中，EMARS将信噪比从常规抗体标记时的1.21提高至6.28。由于未标记的EV和碎片会干扰分析，我们采用人工智能辅助程序探索用于保留P1事件的FITC-H截断值。ChatGPT基于统计学指标和事件保留指标对65个候选截断值进行了比较，并推荐1000；作者在采用该数值前审阅了完整结果。在这一基于数据选择的截断值下，在28份可评估样本中，间质性肺疾病（ILD）样本的平均荧光强度高于非ILD样本（P = 0.002；受试者工作特征曲线下面积[AUC] = 0.846）；这两个数值均未针对截断值选择进行校正。事后嵌套式留一法交叉验证（LOOCV）中，在每个外层折叠内重复进行截断值选择，所得AUC为0.716，共有29/34份样本可评估。该结果与ILD的关联仍需在独立队列中进行验证，但这些探索性发现提示，邻近标记技术可能增强血清EV富集组分中可测量的荧光对比度，并支持进一步利用常规流式细胞仪评估疾病相关EV信号。

细胞外囊泡（EVs）是循环生物标志物的潜在来源，但疾病相关EV通常较为稀少，且其纳米尺度的大小限制了常规流式细胞术对其进行分析。为利用广泛可获得的仪器提高疾病相关EV信号的检测能力，我们建立了一套工作流程，将通过体积排阻色谱制备血清EV富集组分、由CHL1启动的酶介导自由基源激活（EMARS）邻近标记技术以及常规流式细胞术相结合。EMARS可在邻近抗体结合的CHL1的分子上沉积荧光素，从而增强由靶标启动的荧光。在一项代表性比较中，EMARS将信噪比由常规抗体标记时的1.21提高至6.28。由于未标记的EV和碎片会干扰分析，我们采用AI辅助流程，对保留P1事件的FITC-H截断值进行了探索。ChatGPT根据统计学指标和事件保留指标，对65个候选截断值进行了比较，并推荐1000；作者在采纳该数值前审阅了完整结果。在这一基于数据选择的截断值下，在28份可评估样本中，间质性肺疾病（ILD）样本的平均荧光强度高于非ILD样本（P = 0.002；受试者工作特征曲线下面积[AUC] = 0.846）；上述两项数值均未针对截断值选择进行校正。事后嵌套留一法交叉验证（LOOCV）中，在每个外层折叠内重复进行截断值选择，所得AUC为0.716，共有34份样本中的29份可评估。该结果与ILD之间的关联仍需在独立队列中进行验证，但这些探索性发现提示，邻近标记技术可能增强血清EV富集组分中可测量的荧光对比度，并支持使用常规流式细胞仪进一步评估疾病相关EV信号。

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.15.751677v1?rss=1

🏷️ 细胞外囊泡 邻近标记技术 流式细胞术 间质性肺疾病 生物标志物