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CRISPR Cas9结合靶向位点和非靶向位点的能力，以及其与其他蛋白质和结构域之间的功能相互作用，已通过多种技术进行了研究。这些研究通常受到以下因素的限制：使用寡核苷酸作为底物，或依赖于预测的结合位点。我们展示了电子基因组映射（electronic genome mapping，EGM）如何利用其检测单分子DNA切口的能力，在体外确定gRNA错配如何影响全人类基因组范围内的靶向结合与脱靶结合。研究发现，使用针对该序列的gRNA时，Cas9能够结合位于导致弗里德里希共济失调的FXN重复扩增区域邻近的单个位点；而与重复序列匹配的gRNA则能够结合数百个位点。我们将与gRNA完全匹配位点的结合情况，与gRNA各位置存在错配的位点进行了比较。结果证实，PAM位点及其邻近种子区域的碱基对于结合至关重要。相比之下，位于gRNA 5'端方向的单个错配允许发生脱靶结合。我们还利用EGM确定了结合的dCas9/gRNA复合物相对于邻近DNA修饰位点的最小物理距离，以及在该距离下其仍能保持活性的条件。已结合的CRISPR/dCas9会抑制识别位点距离gRNA/PAM 4–7 bp的切口酶。由于EGM能够同时评估多个存在错配的脱靶位点，这些发现或可拓展至其他CRISPR系统，并有助于优化Cas蛋白和gRNA。这是首次利用EGM对蛋白质和RNA进行表征的研究。同时，这也是首项证明CRISPR与EGM方法学可联合应用，并展示其在检测人类基因组中特定重复区域方面潜在作用的研究；这些重复区域与人类重复扩增疾病相关。
CRISPR-Cas9与靶向位点和非靶向位点结合的能力，以及其与其他蛋白质和结构域之间的功能性相互作用，已通过多种技术进行了研究。这些研究通常受限于以寡核苷酸作为底物，或依赖于预测的结合位点。我们展示了电子基因组图谱技术（electronic genome mapping，EGM）如何利用其检测单分子DNA切口的能力，在体外确定gRNA错配如何影响整个人类基因组范围内的靶向结合与脱靶结合。研究发现，使用针对该序列的gRNA时，Cas9能够结合位于导致弗里德赖希共济失调的FXN重复扩增区域邻近的单个位点；而与重复序列匹配的gRNA则能够结合数百个位点。我们比较了与完全匹配的gRNA位点的结合，以及与gRNA各位置存在错配的位点的结合。结果证实，PAM位点及其邻近的种子区碱基对于结合至关重要。相比之下，位于gRNA 5′端附近的单个错配允许发生脱靶结合。我们还利用EGM确定了结合的dCas9/gRNA复合物与邻近DNA修饰位点之间在物理距离多近的情况下仍能保持活性。结合的CRISPR/dCas9会抑制识别位点距gRNA/PAM 4–7 bp的切口酶。由于EGM能够同时评估多个存在错配的脱靶位点，这些见解可以拓展至其他CRISPR系统，并有助于优化Cas蛋白和gRNA。这是首次利用EGM对蛋白质和RNA进行表征的研究，也是首项展示CRISPR与EGM方法联合应用的研究，并证明了这种联合方法在检测人类基因组中特定重复区域方面的潜在作用；这些重复区域与人类重复扩增疾病相关。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.14.751601v1?rss=1
🏷️ CRISPR/Cas9 电子基因组映射 脱靶效应 gRNA错配 重复扩增疾病 弗里德希共济失调