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背景。靶向切割并利用核酸酶释放（cleavage under targets and release using nuclease，CUT&RUN）可绘制染色质相关蛋白在全基因组范围内的定位图谱，并为序列特异性转录因子结合位点的分析提供了优于染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）的替代方法。识别这些结合位点对于理解基因调控具有重要作用；由于转录因子具有明确的序列基序，其可作为内置对照，用于评估分析性能，因此为方法基准评测提供了理想场景。与ChIP-seq相比，CUT&RUN无需交联和整体沉淀，因而具有更高的分辨率和更低的背景信号。然而，CUT&RUN独特的片段长度及切割特征限制了现有计算工具的直接迁移，这些工具主要针对ChIP-seq数据开发。此类工具在CUT&RUN数据上的性能可能高度依赖于预处理策略。在本研究中，我们考察了转录因子CUT&RUN数据的预处理策略，重点关注片段长度过滤和外源标准品校准，旨在提高峰识别能力并提供实用的分析指导。 结果。我们设计了一种基准评测方法，用于评估CUT&RUN数据的峰识别流程及预处理方法（包括片段长度过滤和外源标准品校准）的影响。我们通过评估基序富集程度——即所识别峰中包含预期转录因子结合基序的程度——对目前最广泛使用的两种峰识别工具MACS2和SEACR进行了基准比较。总体而言，筛选长度不超过120 bp的片段可提高目标基序的富集程度。使用异源酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DNA进行外源标准品校准，能够显著改善MACS2的基序解析效果，但对SEACR的益处较小。相比之下，使用大肠杆菌（Escherichia coli）DNA作为外源标准品时，除非能够严格控制大肠杆菌污染，否则通常无法获得有效结果。MACS2在不同样本中均表现出较强的稳健性。SEACR在背景稀疏且洁净的数据集上表现尤为出色，但在部分背景信号较为密集的数据集上表现较差，并且常常产生大量表观假阳性结果。尽管在片段长度过滤方面进行轻微调整时，MACS2仍能提供稳健结果，但SEACR对这类变化表现出更高的敏感性。 讨论。本研究的基准评测凸显了峰识别工具的选择和预处理策略如何共同影响转录因子CUT&RUN数据的分析结果。通过比较两种广泛使用的峰识别工具的稳健性及其局限性，我们就片段长度过滤、外源标准品校准和工具选择提供了实用指导。这些发现有助于改进CUT&RUN数据的处理与解读，使研究人员能够更快速、更可靠地应用这一新技术。我们预计，本研究将为CUT&RUN分析中更为明智的选择提供指导，并推动更完善计算方法的开发。
背景。靶向切割并利用核酸酶释放（cleavage under targets and release using nuclease，CUT&RUN）可绘制染色质相关蛋白在全基因组范围内的定位，并为分析序列特异性转录因子结合位点提供一种优于染色质免疫共沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）的替代方法。识别这些结合位点对于理解基因调控具有重要意义；此外，转录因子具有明确的序列基序，因此为性能基准评估提供了内置对照。与ChIP-seq相比，CUT&RUN通过避免交联和整体沉淀，实现了更高的分辨率和更低的背景信号。然而，其独特的片段长度和切割特征限制了现有计算工具的直接迁移，因为这些工具主要针对ChIP-seq数据开发。此类工具在CUT&RUN数据上的表现可能高度依赖于预处理方案。在本研究中，我们考察了转录因子CUT&RUN的预处理策略，重点关注片段长度过滤和外源加入（spike-in）校准，旨在提高峰检测效果并为数据分析提供实用指导。
结果。我们设计了一种基准评估方法，用于评价CUT&RUN数据的峰识别流程以及预处理方法（包括片段长度过滤和外源加入校准）的影响。我们通过评估基序富集程度——即所识别的峰中包含预期转录因子结合基序的程度——对目前使用最广泛的两种峰识别工具MACS2和SEACR进行了基准比较。总体而言，筛选长度不超过120 bp的片段可提高目标基序的富集程度。使用异源酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DNA进行外源加入校准，可显著改善MACS2的基序识别效果，但对SEACR的益处很小。相比之下，使用大肠杆菌（Escherichia coli）DNA作为外源加入对照时，除非能够严格控制大肠杆菌污染，否则往往无法获得有效结果。MACS2在不同样本中均表现出良好的稳健性。SEACR在背景稀疏且干净的数据集上表现尤为出色，但在部分背景信号较为密集的数据集上表现较差，并且经常产生大量表观假阳性。在片段长度过滤发生轻微变化的情况下，MACS2仍能提供稳健结果，而SEACR对这类变化表现出更高的敏感性。
讨论。本研究的基准评估凸显了峰识别工具的选择和预处理策略如何共同影响转录因子CUT&RUN数据的分析。通过比较两种广泛使用的峰识别工具的稳健性及其局限性，我们为片段长度过滤、外源加入校准和工具选择提供了实用指导。这些发现有助于改进CUT&RUN数据的处理与解读，使研究人员能够更迅速、更可靠地利用这项新技术。我们预计，本研究将为CUT&RUN分析中的知情决策提供指导，并推动更完善计算方法的发展。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.09.749495v1?rss=1
🏷️ CUT&RUN测序 转录因子结合位点 基序富集分析 峰识别 MACS2与SEACR 外源标准品校准