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环状RNA（circRNA）由真核生物蛋白编码转录本经反向剪接产生，可调控微RNA和RNA结合蛋白，或作为翻译模板。其共价闭合结构使其能够抵抗外切核酸酶介导的降解，从而延长半衰期，并支持其作为RNA治疗药物的开发。然而，现有的过表达方法通常会产生大量污染性线性RNA，限制了其应用价值。在本研究中，我们在人细胞中系统比较了基于质粒的circRNA过表达策略，针对包含广泛使用的侧翼序列的构建体，对比了剪接体介导机制与核酶介导机制。基于核酶的Tornado系统产生的circRNA产量最高，但会在成熟产物中引入额外的“分子疤痕”。相比之下，利用果蝇Laccase2基因中的内含子进行剪接体介导的环化——这些内含子含有不完全互补的重复序列——能够生成无疤痕circRNA，并显著降低线性RNA污染。通过将初级转录本设计为以非多聚腺苷化末端终止，进一步增强其对外切核酸酶的敏感性，可进一步减少线性RNA。在此优化系统的基础上，我们开发了一种双输出平台，可由单一启动子共同表达线性荧光报告分子和circRNA（CIRCUS，circRNA and upstream linear system），从而能够高效筛选由circRNA驱动的细胞表型，包括对靶mRNA进行位点特异性A-to-I编辑。总之，该工具箱能够高纯度地产生circRNA，适用于机制研究以及基于circRNA的治疗开发。
通过工程化环状 RNA 表达系统减少污染性线性 RNA 副产物 | bioRxiv
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https://doi.org/10.64898/2026.09.07.749908
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jeremy.wilusz{at}bcm.edu
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环状 RNA（circRNA）由真核蛋白编码转录本经反向剪接产生，可调控微 RNA 和 RNA 结合蛋白，或充当翻译模板。其共价闭合结构使其能够抵抗外切核酸酶介导的降解，从而延长半衰期，并支持其作为 RNA 治疗剂的开发。然而，现有的过表达方法通常会产生大量污染性线性 RNA，限制了其应用价值。在本研究中，我们系统评估了人细胞中基于质粒的 circRNA 过表达策略，比较了采用常用侧翼序列的构建体中由剪接体介导和核酶介导的两种机制。基于核酶的 Tornado 系统产生的 circRNA 产量最高，但会在成熟产物中引入额外的“分子疤痕”。相比之下，利用果蝇 Laccase2 基因内含子进行剪接体介导的环化，可产生无疤痕 circRNA，并显著降低线性 RNA 污染；这些内含子含有不完全互补的重复序列。通过将初级转录本工程化为以非聚腺苷酸化末端终止，进一步提高其对外切核酸酶的敏感性，从而进一步减少线性 RNA。基于这一优化系统，我们开发了一种双输出平台，可由单一启动子共同表达线性荧光报告基因和 circRNA。该平台称为 CIRCUS（circRNA and upstream linear system，circRNA 与上游线性系统），能够高效筛选由 circRNA 驱动的细胞表型，包括对靶 mRNA 进行位点特异性 A-to-I 编辑。总体而言，这一工具体系可实现高纯度 circRNA 的制备，适用于机制研究及基于 circRNA 的治疗开发。
利益冲突声明
J.E.W. 持有 Sail Biomedicines（前身为 Laronde）的股权，并曾担任该公司的顾问。J.E.W. 是与利用三链体稳定 RNA 3' 端相关专利的共同发明人，并从麻省理工学院获得专利使用费。其他已声明的资助机构信息
美国国立卫生研究院 ，R35-GM119735 ，CA125123 ，OD036336 ，OD038251
德克萨斯州癌症预防与研究所 ，RR210031 ，RP240432
国家卫生与医学研究委员会 ，GNT1198014 ，GNT2042423
版权
本预印本的。
本预印本依据
CC-BY 4.0 国际许可协议
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发布于 2026 年 9 月 11 日。
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Jeremy E Wilusz
bioRxiv 2026.09.07.749908；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.09.07.749908
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bioRxiv 2026.09.07.749908；
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https://doi.org/10.64898/2026.09.07.749908
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.07.749908v1?rss=1
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