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轮状病毒（RV）非结构蛋白4（NSP4）是一种具有多种功能的病毒离子通道蛋白和肠毒素，同时在病毒粒子组装中发挥必不可少的结构作用，因此既是核心毒力因子，也是潜在的治疗靶点。然而，由于基因组片段10（gs10）5'端存在必需的RNA包装信号，以及其C端存在双链RNA颗粒（DLP）结合结构域，常规诱变受到双重限制，从而阻碍了在感染性病毒背景下对NSP4的研究。利用基于质粒的反向遗传学系统，我们通过三种策略构建了6种重组轮状病毒（rRVs），使其表达带标签或与报告蛋白融合的NSP4：在双顺反子构型中从替代片段（gs7）表达NSP4；对gs10进行N端加标签，并使翻译起始位点下移至天然包装序列之后；以及保留gs10的5'非翻译区（UTR），将前20个氨基酸与报告蛋白融合，随后以双顺反子形式表达全长NSP4。6种rRVs均具备复制能力，其中基于gs10构建的病毒与野生型病毒的复制动力学高度一致，而基于gs7构建的病毒则表现出轻度减毒，其中一种在传代过程中出现遗传不稳定性。工程化NSP4蛋白均能高效表达、正确糖基化并形成寡聚体。活细胞成像显示，报告蛋白荧光能够可靠地追踪NSP4的合成，并先于NSP4依赖的细胞间钙信号出现。对带标签的NSP4进行亲和纯化，除获得与病毒工厂相关的蛋白和病毒结构蛋白外，还鉴定出包括ANP32A、ANP32E、PPM1G和H2AC1在内的候选宿主互作因子。这些rRVs构成了一套经验证的工具，可用于在真实感染过程中解析NSP4的功能，并建立了一种可推广的受限轮状病毒基因片段工程改造策略。
轮状病毒（RV）非结构蛋白4（NSP4）是一种多功能 viroporin（病毒孔蛋白）和肠毒素，同时在病毒体组装中发挥必不可少的结构作用，因此既是核心毒力因子，也是潜在的治疗靶点。然而，由于第10基因片段（gs10）5′端存在必需的RNA包装信号，以及其C端具有双层颗粒（DLP）结合结构域，常规诱变受到限制，从而阻碍了在感染性病毒背景下对NSP4的研究。利用基于质粒的反向遗传学系统，我们通过三种策略构建了六种重组轮状病毒（rRV），使其表达带标签或与报告蛋白融合的NSP4：一是在双顺反子构型中从替代基因片段（gs7）表达NSP4；二是在保留天然包装序列的同时对gs10进行N端标记，并将翻译起始位点下移；三是保留gs10的5′非翻译区（UTR），将前20个氨基酸与报告蛋白融合，随后以双顺反子方式表达全长NSP4。六种rRV均具备复制能力，其中基于gs10的构建体与野生型病毒的复制动力学基本一致，而基于gs7的构建体则表现出轻度减毒，其中一种在连续传代过程中出现了遗传不稳定性。工程化NSP4蛋白均能高效表达、正确糖基化并形成寡聚体。活细胞成像显示，报告蛋白荧光能够可靠地反映NSP4的合成，并早于NSP4依赖性的细胞间钙信号出现。对带标签NSP4进行亲和纯化，除获得与病毒工厂相关的蛋白和病毒结构蛋白外，还获得了包括ANP32A、ANP32E、PPM1G和H2AC1在内的候选宿主互作蛋白。这些rRV构成了一套经过验证的工具，可用于在真实感染过程中解析NSP4的功能，并为工程化改造受限的轮状病毒基因片段建立了一种具有普适性的策略。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.04.749488v1?rss=1
🏷️ 轮状病毒 非结构蛋白4（NSP4） 反向遗传学 荧光标记 病毒蛋白互作 宿主因子鉴定