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铜绿假单胞菌依赖血红素摄取，以维持其在宿主铁限制环境中的生长和毒力；尤其是在囊性纤维化患者的酸性气道中，抗生素的疗效显著降低。Has血红素同化系统由分泌型血红素载体蛋白HasA启动，该蛋白能够结合细胞外血红素，并将其递送至外膜受体HasR。在感染过程中，HasA会发生蛋白水解加工，生成一种截短形式，而该形式才是具有生物学相关性的蛋白种类。在本研究中，我们表征了疾病相关酸性条件（pH 6.5）下截短型HasA的结构与功能特性，并采用理性设计的指数富集配体系统进化（Systemic Evolution of Ligands by EXponential enrichment，SELEX）方法，鉴定能够结合该血红素载体蛋白的DNA适配体。生物物理学分析表明，截短型HasA处于折叠状态，呈现混合型α/β二级结构，并以浓度依赖的单体与结构域交换二聚体混合物形式存在。圆二色谱和纳米差示扫描荧光法鉴定出两个热转变过程，这与脱辅基/全载体以及单体/二聚体物种共存的现象一致。脱辅基蛋白能够以高亲和力结合血红素（KD = 113 nM），化学计量比为1:1，证实其功能性结合机制得以保留。经过12轮SELEX，并结合靶标转换和平台转换策略，获得了高度富集的适配体库，其中主要由两条序列HasA_1和HasA_2构成。ELONA（酶联寡核苷酸分析）实验表明，两种适配体均能特异性结合截短型HasA；生物层干涉实验显示其解离常数处于纳摩尔范围（分别为KD = 0.59 M和0.32 M）。这些适配体不结合全长HasA、BSA或对照序列，证实在酸性条件下进行筛选促使其特异性识别血红素载体蛋白的生理相关形式。我们的研究鉴定出了能够结合HasA并在抗生素效力受损的酸性环境中保持功能的DNA适配体，凸显了其作为分子工具、干扰铜绿假单胞菌血红素摄取过程的潜力。本研究为开发靶向Has系统的适配体抗菌策略奠定了基础，尤其适用于传统抗生素疗效受损的酸性条件。
铜绿假单胞菌依赖血红素获取来维持其在宿主铁限制环境中的生长与毒力，尤其是在囊性纤维化患者的酸性气道中，此时抗生素的疗效会显著降低。Has血红素同化系统由分泌型血红素载体HasA启动；HasA能够结合细胞外血红素，并将其递送至外膜受体HasR。在感染过程中，HasA会发生蛋白水解加工，生成一种截短形式，该形式构成其具有生物学相关性的分子种类。本研究在疾病相关的酸性条件（pH 6.5）下，对截短型HasA的结构与功能特性进行了表征，并采用理性设计的指数富集配体系统进化（Systemic Evolution of Ligands by EXponential enrichment，SELEX）方法，鉴定能够结合该血红素载体的DNA适配体。生物物理学分析表明，截短型HasA具有折叠结构，呈现混合型α/β二级结构，并以浓度依赖性的单体与结构域交换二聚体混合物形式存在。圆二色谱和纳米差示扫描荧光法鉴定出两个热转变过程，这与脱辅基/全血红素以及单体/二聚体物种共存的现象一致。脱辅基蛋白能够以高亲和力结合血红素（KD = 113 nM），化学计量比为1:1，证实其功能性结合机制得以保留。经过12轮SELEX筛选，并结合靶标切换和平台切换策略，获得了高度富集的适配体库，其中主要由两条序列HasA_1和HasA_2构成。ELONA（酶联寡核苷酸分析）实验表明，这两种适配体均能特异性结合截短型HasA；生物层干涉分析显示，其解离常数处于纳摩尔范围（分别为KD = 0.59 M和0.32 M）。这些适配体不与全长HasA、牛血清白蛋白（BSA）或对照序列结合，证实在酸性条件下进行筛选促使其特异性指向血红素载体的生理相关形式。本研究鉴定出了能够结合HasA并在抗生素效力受损的酸性环境中保持功能的DNA适配体，凸显了其作为干扰铜绿假单胞菌血红素获取过程的分子工具的潜力。本工作为开发靶向Has系统的适配体抗菌策略奠定了基础，尤其适用于传统抗生素疗效受损的酸性条件。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.03.749098v1?rss=1
🏷️ 铜绿假单胞菌 血红素摄取 HasA血红素载体蛋白 DNA适配体 SELEX筛选 抗菌策略