通过同源蛋白引导探索与机器学习辅助优先级排序，改造高活性嗜热F1-ATP酶

旋转马达F₁-ATPase已被广泛研究为一种分子机器模型，但由于ATP水解受到远程亚基间变构作用和大尺度构象转变的调控，对其催化活性进行理性工程改造仍然具有挑战性。在本研究中，我们开发了一种同源蛋白指导的工程策略，以提高嗜热芽孢杆菌PS3 F₁-ATPase（TF₁）的最大旋转速率。首先，通过比较TF₁与同源酶牛线粒体F₁（bMF₁）和反硝化副球菌F₁（PdF₁）来鉴定候选突变位点；后两者的最大旋转速率均高于TF₁。对这些位点进行系统探索后，鉴定出四个可增强活性的热点位点，随后对热点位点进行了重点探索，并借助机器学习对组合突变体进行优先级排序。最佳突变体TF₁（βY313L/βE332S）的最大旋转速率为TF₁（WT）的1.8倍，同时保留了其功能性热稳定性。有趣的是，增强活性的替换并不局限于bMF₁和PdF₁中共同保守的残基，这表明，bMF₁-PdF₁共识替换能够有效鉴定增强活性的热点位点，但并不能唯一确定最优氨基酸。尽管预测性能受到相对较小的训练数据集以及突变间上位性相互作用的限制，机器学习辅助探索仍能有效地优先筛选出高活性突变体。动力学和结构比较进一步揭示了工程化突变体催化活性增强的机制。综上，这些结果通过结合同源蛋白指导的热点位点鉴定与重点热点探索，确立了一种工程改造复杂分子马达的实用策略。

旋转马达F1-ATP酶作为一种模型分子机器已得到广泛研究，然而，由于ATP水解受到远距离亚基间变构作用和大尺度构象转变的调控，对其催化活性进行理性工程改造仍然具有挑战性。在本研究中，我们开发了一种同源蛋白指导的工程策略，以提高嗜热菌Bacillus PS3 F1-ATP酶（TF1）的最大旋转速率。首先，通过比较TF1与同源酶牛线粒体F1（bMF1）和反硝化副球菌F1（PdF1）来鉴定候选突变位点；这两种同源酶的最大旋转速率均高于TF1。对这些位点进行系统性探索后，鉴定出4个能够增强活性的热点位点；随后，我们进一步对热点位点进行定向探索，并借助机器学习对组合突变体进行优先筛选。最佳突变体TF1（βY313L/βE332S）的最大旋转速率达到TF1（WT）的1.8倍，同时保留了其功能性热稳定性。有趣的是，增强活性的替换并不局限于bMF1和PdF1中均保持保守的残基，这表明，bMF1-PdF1共识替换能够有效识别增强活性的热点区域，但并不能唯一确定最优氨基酸。机器学习辅助的探索能够高效地优先筛选出高活性突变体，尽管其预测性能受到相对较小的训练数据集以及突变之间上位性相互作用的限制。动力学和结构比较进一步揭示了工程化突变体催化活性增强的机制。综上，这些结果通过将同源蛋白指导的热点鉴定与定向热点探索相结合，建立了一种工程改造复杂分子马达的实用策略。

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.08.27.747693v1?rss=1

🏷️ F1-ATP酶 蛋白质工程 酶活性改造 同源蛋白引导 机器学习辅助筛选 分子马达