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精确量化肌丝蛋白磷酸化对于理解健康与疾病状态下心脏收缩功能的调控至关重要。尽管 Phos-tag SDS-PAGE 被广泛用于分离磷酸化蛋白亚型，但其重复性和定量可靠性通常受到关键实验因素变异的限制，包括凝胶组成、电泳条件、蛋白上样量以及样品制备过程。在此，我们建立了一套针对心脏肌丝蛋白优化的标准化锰离子（Mn²⁺）-Phos-tag SDS-PAGE 流程，并以肌球蛋白调节轻链2（myosin regulatory light chain 2，MLC2）和心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）作为模型靶标。我们系统评估了包括 Mn²⁺和 Phos-tag 浓度、丙烯酰胺组成、电泳模式、缓冲液化学组成、蛋白上样量以及 EDTA 介导的转膜等在内的关键参数，从而确定能够在保持定量准确性的同时最大化磷酸化物种分辨率的实验条件。我们进一步证明，电泳速率、样品上样量和提取策略会显著影响条带形态、信号强度以及磷酸化物种的表观分布。 作为应用示例，我们比较了三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）提取的小鼠左心室匀浆与采用广泛应用的 Triton X-100 组织去膜化方案制备的肌原纤维。肌原纤维制备过程在最早阶段即伴随着 MLC2 磷酸化水平的显著降低，而 cTnI 则表现出高阶、低化学计量比磷酸化形式的明显减少。进一步对肌球蛋白结合蛋白C（myosin-binding protein C，MyBP-C）的评估显示，其磷酸化水平在24小时内持续下降。我们认为，TCA 提取的心脏标准样品结合 Phos-tag 凝胶，可为肌原纤维制备物的磷酸化状态提供有价值的质量控制；此外，在未来的肌原纤维力学研究中，加入高亲和力的 PP2A 和 PP1 磷酸酶抑制剂，如冈田酸（okadaic acid），可能具有益处。
精准定量肌丝蛋白磷酸化对于理解健康与疾病状态下心脏收缩力的调控至关重要。尽管 Phos-tag SDS-PAGE 被广泛用于分离磷酸化蛋白异构体，但其重现性和定量可靠性常受到关键实验因素变异的限制，包括凝胶组成、电泳条件、蛋白上样量以及样品制备过程。在此，我们建立了一套针对心肌肌丝蛋白优化的标准化锰离子（Mn²⁺）-Phos-tag SDS-PAGE 工作流程，并以肌球蛋白调节轻链2（MLC2）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）作为模型靶蛋白。我们系统评估了包括 Mn²⁺和 Phos-tag 浓度、丙烯酰胺组成、电泳模式、缓冲液化学组成、蛋白上样量以及 EDTA 介导的转膜等关键参数，从而确定能够在保持定量准确性的同时最大限度提高磷酸化物种分辨率的实验条件。我们进一步证明，电泳速率、样品上样量和提取策略会显著影响条带形态、信号强度以及磷酸化物种的表观分布。
作为应用示例，我们比较了三氯乙酸（TCA）提取的小鼠左心室匀浆与采用广泛应用的 Triton X-100 组织去膜方案制备的肌原纤维。肌原纤维制备在最初阶段即伴随着 MLC2 磷酸化程度的显著降低，而 cTnI 则表现出高阶、低化学计量比磷酸化形式的明显减少。对肌球蛋白结合蛋白C（MyBP-C）的进一步评估显示，其磷酸化水平在24小时内呈进行性丧失。我们认为，将 TCA 提取的心脏标准样品与 Phos-tag 凝胶结合使用，可为肌原纤维制备物的磷酸化状态提供有价值的质量控制；此外，在未来的肌原纤维力学研究中，加入高亲和力的 PP2A 和 PP1 磷酸酶抑制剂冈田酸可能具有益处。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.08.21.746362v1?rss=1
🏷️ Mn²⁺-Phos-tag SDS-PAGE 肌丝蛋白磷酸化 肌原纤维制备 心肌肌钙蛋白I 肌球蛋白调节轻链2 磷酸化质量控制