- 5 次围观
摘要 一对通用型内含子向导RNA可在其主要变体中切除 KIAA1549--BRAF 致癌融合，并且在患者来源的胶质瘤细胞中，通过功能获得性PCR证实了可产生连接的切除。一个等位基因特异性向导可在患者来源的儿童低级别胶质瘤细胞中选择性破坏 BRAF V600E。 儿童低级别胶质瘤（pLGG）是儿童期最常见的脑肿瘤，占所有儿童中枢神经系统恶性肿瘤的 30--50%^1。该疾病几乎普遍由 BRAF 丝氨酸/苏氨酸激酶的激活性突变驱动：约 70% 的病例中为染色体串联重复所产生的 KIAA1549--BRAF 致癌融合，约 15% 的病例中为 BRAF V600E 功能获得性点突变^2。当前的靶向药物治疗（包括 RAF 抑制剂 tovorafenib）需要持续给药，不具有等位基因特异性，并且在儿童中存在长期毒性的风险。一次性的基因组干预，能够在保留野生型 BRAF 信号传导的同时永久失活致癌性 BRAF 改变，因此构成一种极具吸引力的治疗替代方案。在本研究中，我们描述了针对 KIAA1549--BRAF 致癌融合和 BRAF V600E 点突变的等位基因特异性 CRISPR 向导RNA的设计与实验验证。对于致癌融合，我们开发了一种双切口内含子切除策略，其中靶向 KIAA1549 第14内含子的向导RNA与靶向 BRAF 第11内含子的向导RNA配对使用。由于四种主要融合变体（KB 16:9、15:9、16:11 和 15:11）的基因组断点均位于这些内含子内，因此单一向导RNA对即可通过一次干预覆盖全部融合异质性谱系。对于 BRAF V600E，我们利用了由第600密码子处致病性 TBA 颠换所产生的独特 PAM 序列，从而实现了等位基因特异性的 SpCas9 和 AsCas12a 向导设计，能够以单核苷酸分辨率区分突变等位基因与野生型等位基因。我们通过在 A375 人黑色素瘤细胞（BRAF V600E 纯合）和患者来源的 3635 PXA 胶质瘤细胞（BRAF V600E 杂合）中进行核糖核蛋白（RNP）核转染，对向导RNA候选体进行了筛选。最佳的 KIAA1549 第14内含子向导 K9_i14_A_Cas9 在 A375 细胞中达到 66% 的 indel 频率。最佳的 BRAF 第11内含子向导 B_i11_A_Cas9 和 B_i11_D_Cas9 分别达到 84% 和 85% 的 indel 频率。对于 BRAF V600E，最佳的等位基因特异性 SpCas9 向导在 A375 细胞中实现了 57% 的编辑，在 3635 PXA 患者来源胶质瘤细胞中实现了 74% 的编辑。KIAA1549--BRAF 连接位点的双切口切除通过一种功能获得性PCR检测得到证实，该检测旨在识别由 NHEJ 介导的 KIAA1549 第14内含子与 BRAF 第11内含子切口末端重新连接后产生的切除连接扩增子（[~]191 bp）。
摘要
一对通用型内含子导向RNA可切除KIAA1549--BRAF致癌融合基因的主要变体，并且通过患者来源胶质瘤细胞中的功能获得性PCR证实了可产生连接位点的切除。一个等位基因特异性导向RNA可在患者来源的儿童低级别胶质瘤细胞中选择性破坏BRAF V600E。
儿童低级别胶质瘤（pLGG）是儿童期最常见的脑肿瘤，占所有儿童中枢神经系统恶性肿瘤的30--50%1。该疾病几乎普遍由BRAF丝氨酸/苏氨酸激酶的激活性突变驱动：约70%的病例中存在由染色体串联重复产生的KIAA1549--BRAF致癌融合，而约15%的病例中存在BRAF V600E功能获得性点突变2。当前的靶向药物治疗（包括RAF抑制剂tovorafenib）需要持续给药，缺乏等位基因特异性，并且在儿童中存在长期毒性的风险。一次性的基因组干预，若能在保留野生型BRAF信号传导的同时永久性失活致癌性BRAF改变，将构成一种极具吸引力的治疗替代方案。在本研究中，我们描述了针对KIAA1549--BRAF致癌融合和BRAF V600E点突变的等位基因特异性CRISPR导向RNA的设计及实验验证。对于致癌融合，我们开发了一种双切口内含子切除策略，其中，靶向KIAA1549第14内含子的导向RNA与靶向BRAF第11内含子的导向RNA配对使用。由于四种主要融合变体（KB 16:9、15:9、16:11和15:11）的基因组断点均位于这些内含子内，因此单一导向RNA对即可在一次干预中覆盖融合异质性的完整谱系。对于BRAF V600E，我们利用了由第600密码子处致病性TBA颠换所产生的独特PAM序列，从而实现了等位基因特异性的SpCas9和AsCas12a导向RNA设计，能够以单核苷酸分辨率区分突变等位基因与野生型等位基因。我们通过核糖核蛋白（RNP）核转染，在A375人黑色素瘤细胞（BRAF V600E纯合）和患者来源的3635 PXA胶质瘤细胞（BRAF V600E杂合）中筛选导向RNA候选分子。最佳KIAA1549第14内含子导向RNA K9_i14_A_Cas9在A375细胞中实现了66%的indel频率。最佳BRAF第11内含子导向RNA B_i11_A_Cas9和B_i11_D_Cas9分别实现了84%和85%的indel频率。对于BRAF V600E，最佳等位基因特异性SpCas9导向RNA在A375细胞中实现了约57%的编辑率，在3635 PXA患者来源胶质瘤细胞中实现了约74%的编辑率。通过一种功能获得性PCR检测证实了KIAA1549--BRAF连接位点的双切口切除，该检测旨在识别由NHEJ介导的KIAA1549第14内含子与BRAF第11内含子切口末端重新连接后产生的切除连接位点扩增子（[~]191 bp）。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.08.12.744431v1?rss=1
🏷️ CRISPR基因编辑 儿童低级别胶质瘤 BRAF致癌突变 KIAA1549-BRAF融合 等位基因特异性靶向