多色液滴数字PCR检测可实现异质性基因组编辑结果的等位基因特异性定量

对基因组编辑结果进行精确表征仍然是一项重大挑战，因为经编辑的细胞群体包含由同源定向修复、非同源末端连接（NHEJ）或碱基编辑产生的多样化等位基因。尽管下一代测序能够实现全面分析，但其常规应用仍受到成本和周转时间的限制。在此，我们开发了一种多色液滴数字PCR（ddPCR）检测方法，利用六色荧光检测在单次反应中定量区分多种编辑等位基因。基于CRISPR-Cas9和碱基编辑模型系统，我们设计了序列特异性探针组，可区分由CRISPR-Cas9编辑产生的重复性NHEJ等位基因，以及由碱基编辑产生的靶向和旁系等位基因。该检测方法能够定量解析常规桑格测序无法区分的单个编辑结果。综上，这些结果确立了多色ddPCR作为一种快速、可扩展且具有序列特异性的方法，可用于多种编辑模式下基因组编辑结果的定量分析。

由于经同源定向修复、非同源末端连接（NHEJ）或碱基编辑产生的已编辑细胞群体中包含多样化的等位基因，因此对基因组编辑结果进行精确表征仍然是一项重大挑战。尽管下一代测序能够实现全面分析，但其常规应用受制于成本和周转时间。在此，我们开发了一种多色液滴数字PCR（ddPCR）检测方法，该方法利用六色荧光检测在单次反应中定量区分多种已编辑等位基因。利用CRISPR-Cas9和碱基编辑模型系统，我们设计了序列特异性探针组，可区分由CRISPR-Cas9编辑产生的重复出现的NHEJ等位基因，以及由碱基编辑产生的目标等位基因和旁观者等位基因。该方法能够定量解析传统桑格测序无法区分的个体编辑结果。综上，这些结果表明，多色ddPCR是一种快速、可扩展且具有序列特异性的策略，可用于跨多种编辑模式对基因组编辑结果进行定量分析。

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.08.20.745440v1?rss=1

🏷️ 液滴数字PCR 基因组编辑 CRISPR-Cas9 碱基编辑 等位基因定量 多色荧光检测