一种可推广的细菌膜受体纯化及生物物理表征方法

膜嵌入型细菌受体难以以可溶形式表达和纯化，然而其分离结构域却是结构研究和配体发现研究中不可或缺的工具。铜绿假单胞菌依赖TonB依赖性血红素受体HasR获取铁，这一过程对其致病性至关重要。在此，我们报道了一种稳健的策略，用于重组表达、纯化并生物物理表征两个直接参与血红素摄取的可溶性HasR结构域：N端塞状结构域以及Secretin/TonB短N端结构域。每个结构域均在大肠杆菌中单独表达并纯化至均一状态；圆二色谱、NMR波谱和质谱分析证实其均采取良好折叠的构象。 随后，我们构建了同时包含这两个结构域的融合蛋白，并系统评估了多种增溶标签。GST-His双亲和策略实现了该构建体的高效纯化，而单独使用His标签则导致蛋白不溶，HLT标签融合则遭受非特异性蛋白水解。生物物理分析表明，Secretin/TonB短N端结构域在融合构建体中仍保持稳定折叠，而N端塞状结构域则变得部分无序；氢/氘交换质谱进一步支持了这一发现。综上，这些结果建立了一种可推广的工作流程，用于从膜蛋白中制备可溶性受体结构域，并提供了经验证的HasR构建体，适用于下游配体筛选应用，包括适配体和纳米抗体的发现。

膜嵌入型细菌受体难以以可溶形式表达和纯化，然而其分离结构域却是开展结构研究和配体发现研究的重要工具。铜绿假单胞菌依赖TonB依赖性血红素受体HasR获取铁，而这一过程是其致病性的核心环节。在此，我们报道了一种稳健策略，用于直接参与血红素摄取的两个可溶性HasR结构域——N端塞子结构域以及Secretin/TonB短N端结构域——的重组表达、纯化与生物物理表征。每个结构域均在大肠杆菌中单独表达并纯化至均一状态；圆二色谱、NMR光谱和质谱分析证实它们均采取良好折叠的构象。

随后，我们构建了同时包含这两个结构域的融合蛋白，并系统评估了多种增溶标签。GST/His双亲和策略使该构建体得以高效纯化，而单独使用His标签则导致蛋白质不溶，HLT标签融合则受到非特异性蛋白水解的影响。生物物理分析表明，Secretin/TonB短N端结构域在融合构建体中仍保持稳定折叠，而N端塞子结构域则变得部分无序；氢/氘交换质谱进一步支持了这一发现。总体而言，这些结果建立了一种可推广的流程，用于从膜蛋白中制备可溶性受体结构域，并提供了经验证可用于下游配体筛选应用（包括适配体和纳米抗体发现）的HasR构建体。

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.08.12.744447v1?rss=1

🏷️ 细菌膜受体 TonB依赖受体 蛋白纯化 生物物理表征 血红素摄取