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骨组织通过骨细胞与骨髓驻留细胞群体的协同作用，对其力学和生理环境作出适应。由于这些过程依赖于天然组织微环境中的复杂相互作用，活体成像为揭示离体条件下无法被充分捕捉的细胞行为提供了独特机会。然而，矿化骨组织的高散射特性限制了成像深度以及对完整组织内细胞的直接观察。双光子（2P）显微镜已推动骨生物学取得重要进展，而三光子（3P）显微镜已被证明能够提高骨骼组织中的成像深度和图像质量。在本研究中，我们通过量化激光衰减、信噪比、信号背景比和空间分辨率，并评估波前校正的影响，直接比较了2P与3P显微镜在离体小鼠长骨中的成像性能。我们发现，在约50 μm厚的皮质骨范围内，2P和3P显微镜可产生相当的图像质量。然而，超过这一深度后，3P显微镜在亮度、对比度和分辨率方面表现更优，从而能够更清晰地显示皮质深部及皮质—骨髓界面的结构。为评估其与活体成像的兼容性，我们在3P成像过程中检测了细胞应激的内源性标志物。尽管长时间连续成像会降低骨细胞自发性钙信号的幅度并增加自发荧光，但与对照组相比，短时间间歇性成像仅显示出可忽略不计的细胞损伤证据。利用3P显微镜增强的穿透深度，我们进一步展示了在第三跖骨（MT3）和胫骨中，透过完整皮质骨对骨髓腔内免疫细胞迁移的可视化。综上，这些发现证实了3P显微镜是研究活体骨组织中细胞动态变化的强有力工具。通过将成像范围扩展至皮质骨浅表区域之外，并实现透过完整骨组织对骨髓驻留细胞的直接可视化，3P显微镜拓展了在体研究骨细胞生物学、骨髓生态位功能及骨骼适应性的机会。
三光子显微镜穿过完整小鼠皮质骨并成像至骨髓时的深度依赖性优势 | bioRxiv
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三光子显微镜穿过完整小鼠皮质骨并成像至骨髓时的深度依赖性优势
Samantha Bratcher，Michael R.E. Lamont，Christopher B. Schaffer，Karl J. Lewis
doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.31.742087
Samantha Bratcher 康奈尔大学 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在持有人为作者/资助方，其已授权 bioRxiv 永久展示该预印本。 本作品依据 CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可协议提供。
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发布于 2026 年 8 月 03 日。 下载 PDF 补充材料 电子邮件
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三光子显微镜穿过完整小鼠皮质骨并成像至骨髓时的深度依赖性优势 Samantha Bratcher，Michael R.E. Lamont，Christopher B. Schaffer，Karl J. Lewis bioRxiv 2026.07.31.742087； doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.31.742087
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📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.31.742087v1?rss=1
🏷️ 三光子显微镜 双光子显微镜 骨髓成像 皮质骨穿透 活体成像 免疫细胞迁移