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丝状蓝藻 Nostoc punctiforme 是研究蓝藻生物学多个方面的关键模式生物，其中包括发育、与植物形成固氮共生关系以及次级代谢产物等。尽管 N. punctiforme 可以进行遗传操作，但采用同源重组构建突变株的传统方法过程缓慢，需要在抗生素选择压力下进行长时间扩增培养，以确保获得同基因型的突变群体。近期研究表明，基于 Cpf1（Cas12a）的 CRISPR 基因组编辑是在多种蓝藻中快速构建同基因型突变体的有效手段。 在本研究中，研究人员为 N. punctiforme 开发了基于 Cpf1 的基因组编辑工具。通过 Cpf1 靶向切割结合定向同源修复（HDR），共成功构建了 19 个无标记、保持阅读框的缺失突变体。研究发现，用于 HDR 的同源修复模板（HRT）上的同源臂（HA）长度是成功删除目标基因的关键因素，其中某些基因需要长达 4 kb 的同源臂才能获得突变接合转移子。研究还通过在被删除基因的位置引入外源靶位点，建立了一种等位基因替换策略；随后可对该位点进行靶向切割，并利用含有目标基因改造等位基因的 HRT 进行修复。 此外，研究人员设计了一种单步克隆策略，可实现编辑质粒的快速组装，并优化了从大肠杆菌向 N. punctiforme 进行遗传转移的接合操作流程。总体而言，这些工具和方法有望提高在这一重要模式蓝藻中开展遗传学研究的速度与便利性。
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摘要 丝状蓝细菌点状念珠藻（Nostoc punctiforme）是研究蓝细菌生物学多个方面的关键模式生物，其中包括发育、与植物形成固氮共生关系以及次级代谢产物等。尽管 N. punctiforme 可进行遗传操作，但采用同源重组生成突变株的传统方法较为缓慢，需要在抗生素筛选条件下进行长时间扩增培养，以确保获得同基因型的突变体群体。近期研究表明，基于 Cpf1（Cas12a）的 CRISPR 基因组编辑是在多种蓝细菌中快速生成同基因型突变体的有效方法。在本研究中，研究人员为 N. punctiforme 开发了基于 Cpf1 的基因组编辑工具。利用 Cpf1 靶向切割结合同源定向修复（HDR），成功构建了共 19 个无标记、框内缺失突变体。研究发现，用于 HDR 的同源修复模板（HRT）上的同源臂（HA）长度是成功删除目标基因的关键因素，其中部分基因需要长达 4 kb 的同源臂才能获得突变接合转移子。研究还通过在被删除基因的位置引入外源靶位点，建立了一种等位基因替换策略，随后可对该位点进行靶向切割，并利用含有目标基因改造等位基因的 HRT 进行修复。此外，研究人员设计了一种单步克隆策略，可实现编辑质粒的快速组装，并优化了从大肠杆菌向 N. punctiforme 进行遗传转移的接合转移方案。总体而言，这些工具和方案将有助于提高在这一重要模式蓝细菌中开展遗传学研究的速度和便利性。
利益冲突声明 已声明资助信息 美国国家科学基金会（NSF） 2420339
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发布于 2026 年 7 月 31 日。 下载 PDF
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Jenna R Ryder，Soohan Woo，Ailea A Blahm，Christine N Cummings，Douglas D Risser
bioRxiv 2026.07.31.742098； doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.31.742098
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引文工具 丝状蓝细菌点状念珠藻（Nostoc punctiforme）中基于 Cpf1（Cas12a）的基因组编辑
Jenna R Ryder，Soohan Woo，Ailea A Blahm，Christine N Cummings，Douglas D Risser
bioRxiv 2026.07.31.742098； doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.31.742098
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.31.742098v1?rss=1
🏷️ CRISPR-Cpf1 基因组编辑 丝状蓝藻 同源定向修复 无标记缺失突变