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采用靶向肿瘤抗原的T细胞受体（TCR）的过继性细胞治疗，由于具有广泛的抗原可及性以及靶向癌症特异性新抗原的能力，为治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤提供了一种极具吸引力的策略。然而，与临床上已获验证、携带内置共刺激信号模块（即4-1BB或CD28）的第二代CAR-T细胞不同，TCR-T细胞在大多数肿瘤微环境中几乎得不到或完全得不到共刺激，从而导致细胞反应减弱。此外，被工程化为表达HLA-I类限制性TCR的CD4+ TCR-T细胞几乎不具备T辅助细胞活性，因此无法有效动员CD8+ TCR-T细胞或宿主抗肿瘤免疫反应。为解决这些局限性，我们利用CRISPR-Cas9对TCR-T细胞进行工程改造，定点整合含有胞内共刺激结构域的嵌合CD8构建体。我们发现，在HLA-I类限制性TCR-T细胞中，表达野生型CD8β而非CD8α，能够促进CD4+ T细胞活性。然而，在使用高亲和力WT1靶向TCR时，这种作用仍不足以在具有挑战性的肿瘤小鼠模型中驱动持久的抗肿瘤反应。为此，我们设计并筛选了若干含有CD28或4-1BB胞内结构域的CD8共刺激融合构建体，并鉴定出两种基于CD8-4-1BB的嵌合体，其相较于野生型CD8β可显著增强TCR-T细胞活性。共表达CD8-4-1BB融合体的WT1-TCR-T细胞不仅表现出增强的CD4+活性，包括强烈且极化的Th1型细胞因子分泌，还增强了CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的增殖、细胞因子释放和细胞毒作用。值得注意的是，当与TGFBR2基因破坏相结合时，共表达CD8-4-1BB受体的WT1-TCR-T细胞能够使已建立的细胞系来源卵巢肿瘤完全消退，表现出强大的体内扩增与持久性，并提供对肿瘤再次攻击的长期保护。重要的是，WT1-TCR的特异性谱，包括其HLA-A*02:01限制性和WT1肽识别基序，在表达CD8-4-1BB后仍得以保留。为简化临床应用中的细胞工程流程，我们构建了一个同源定向修复（HDR）盒，以便通过CRISPR-Cas9在TRAC位点一步高效插入TCR和CD8-4-1BB两种转基因，效率超过80%。最后，我们利用第二种具有临床相关性的、靶向PRAME的TCR验证了CD8-4-1BB表达所赋予的增强活性，提示该平台可作为提升基于TCR的细胞治疗治疗潜力的通用策略。
采用靶向肿瘤抗原的T细胞受体（TCR）的过继性细胞治疗，凭借其广泛的抗原可及性以及靶向肿瘤特异性新抗原的能力，为治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤提供了一种极具吸引力的策略。然而，与携带内置共刺激信号模块（即4-1BB或CD28）的、已获临床验证的第二代CAR-T细胞不同，TCR-T细胞在大多数肿瘤微环境中几乎得不到共刺激信号，从而导致细胞反应减弱。此外，经工程化使其表达HLA-I类限制性TCR的CD4+ TCR-T细胞几乎不具备T辅助细胞活性，因此无法有效动员CD8+ TCR-T细胞或宿主抗肿瘤免疫反应。为了解决这些局限性，我们采用CRISPR-Cas9对TCR-T细胞进行工程化改造，靶向整合含有胞内共刺激结构域的嵌合CD8构建体。我们发现，在HLA-I类限制性TCR-T细胞中，表达野生型CD8αβ而非CD8αα能够促进CD4+ T细胞活性。然而，在采用高亲和力WT1靶向TCR时，这仍不足以在具有挑战性的肿瘤小鼠模型中驱动持久的抗肿瘤反应。为此，我们设计并筛选了数种含有CD28或4-1BB胞内结构域的CD8共刺激融合构建体，鉴定出两种基于CD8-4-1BB的嵌合体，与野生型CD8αβ相比，其可显著增强TCR-T细胞活性。共表达CD8-4-1BB融合体的WT1-TCR-T细胞不仅表现出增强的CD4+活性，包括强烈且偏向Th1型的细胞因子分泌，还增强了CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的增殖、细胞因子释放和细胞毒作用。值得注意的是，当与TGFBR2基因破坏相结合时，共表达CD8-4-1BB受体的WT1-TCR-T细胞能够使已建立的来源于细胞系的卵巢肿瘤完全消退，表现出强劲的体内扩增与持续性，并可提供针对肿瘤再次攻击的长期保护。重要的是，WT1-TCR的特异性特征，包括其HLA-A*02:01限制性和WT1肽识别基序，在表达CD8-4-1BB后仍得以保留。为简化临床应用中的细胞工程流程，我们构建了一个同源定向修复（HDR）盒，使得基于CRISPR-Cas9的TCR和CD8-4-1BB转基因能够以单一步骤高效插入TRAC位点，效率超过80%。最后，我们利用第二种具有临床相关性的、靶向PRAME的TCR验证了CD8-4-1BB表达所赋予的增强活性，提示该平台可作为一种通用策略，以提升基于TCR的细胞治疗的治疗潜力。
ID、JO、LC、AL、PS、IB、JP、IM、JB、LM、JP、ES、DL、QZ、LSL、BS 和 AP 均为 Intellia Therapeutics 的现任或前任员工。AP 和 BS 已提交与 CD8 共受体相关的专利申请。EFL 已接受 Intellia Therapeutics 的研究经费资助。CB 曾担任 Intellia、TxCell、Novartis、GSK、Allogene、Kite/Gilead、Kiadis、Evir、Janssen、Genyo、Epsilen 的顾问委员会成员和顾问，并接受过 Intellia Therapeutics 的研究支持。CB 和 ER 是与癌症免疫治疗和基因工程相关不同专利的发明人。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.27.739613v1?rss=1
🏷️ TCR-T细胞治疗 CRISPR-Cas9工程化 4-1BB共刺激 抗肿瘤免疫 CD4辅助性T细胞 TRAC位点定点整合