G-四链体折叠使Cas12a的顺式激活与附带的反式切割解耦

CRISPR/Cas12a 系统因 Cas12a 能够将向导介导的顺式靶标识别与对单链 DNA（ssDNA）的非特异性附带式反式切割相耦联，而被广泛用于核酸诊断。通过 DNA 结构调控这些活性可对诊断信号进行精细调节。G-四链体（G4）是强有力的结构调控元件，然而其调节 Cas12a 激活及附带切割的能力仍未明确。在本研究中，我们聚焦于 G4 骨架 (TGGG)n，并采用实时切割实验、圆二色性、FRET 以及变性 PAGE，对其在 LbCas12a 和 AsCas12a 体系中的作用进行了测试。 在顺式位置上，紧凑的 (TGGG)n G4 可激活 Cas12a；对于最稳定的 (TGGG)5，LbCas12a 和 AsCas12a 的 kcat/KM 分别为 5.9*10(4) 和 8.9*10(4) M(-1) s(-1)。K+ 可使顺式激活速率降低约 10 倍，具体取决于骨架类型和温度。FRET 和变性 PAGE 表明，有效的顺式识别涉及 G4 的解折叠，随后发生靶链切割。 在反式位置上，紧凑型 G4 可完全抵抗附带性报告分子切割。核心结构破坏以及富 G 的非 G4 对照均可恢复报告分子切割，表明这种抗性取决于 G4 的构型架构，而非鸟嘌呤含量。这些数据界定了一种紧凑型 G4 骨架，其在保持向导依赖性顺式靶标识别能力的同时，在功能上仍对反式切割具有抗性。因此，紧凑型 G4 折叠为将 Cas12a 激活与报告分子切割相分离提供了一种可编程的结构机制，为信号门控型诊断设计开辟了新路径。

伊琳娜·V. 萨芬科娃 俄罗斯科学院生物技术研究中心 A.N. 巴赫生物化学研究所 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在持有人为作者/资助方，其已授予 bioRxiv 永久展示该预印本的许可。 本文依据 CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可协议 提供。

返回顶部 上一篇 下一篇

发布于 2026 年 7 月 24 日。 下载 PDF 补充材料 电子邮件

感谢您有兴趣帮助传播 bioRxiv。 您的电子邮件 *

您的姓名 *

发送至 *

请输入多个地址，每行一个，或以逗号分隔。

您将通过电子邮件发送以下内容

G-四链体折叠使 Cas12a 的顺式激活与附带反式切割解偶联

邮件主题

（您的姓名）已从 bioRxiv 向您转发了一个页面

邮件正文

（您的姓名）认为您会希望查看 bioRxiv 网站上的此页面。

您的个人留言

验证码

此问题用于测试您是否为人工访问者，并防止自动垃圾信息提交。

分享

G-四链体折叠使 Cas12a 的顺式激活与附带反式切割解偶联

伊琳娜·V. 萨芬科娃， 玛丽亚·V. 卡米翁斯卡娅， 阿列克谢·V. 萨莫赫瓦洛夫， 阿纳托利·V. 热尔杰夫， 鲍里斯·B. 赞季耶夫

bioRxiv 2026.07.23.740342； doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.23.740342

分享本文： 复制

引文工具

G-四链体折叠使 Cas12a 的顺式激活与附带反式切割解偶联

伊琳娜·V. 萨芬科娃， 玛丽亚·V. 卡米翁斯卡娅， 阿列克谢·V. 萨莫赫瓦洛夫， 阿纳托利·V. 热尔杰夫， 鲍里斯·B. 赞季耶夫

bioRxiv 2026.07.23.740342； doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.23.740342

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.23.740342v1?rss=1

🏷️ CRISPR/Cas12a G-四链体 顺式激活 反式切割 核酸诊断 DNA结构调控