结合以稳定性为中心的原子尺度设计与机器学习进行靶向酶优化

FuncLib和高通量FuncLib（htFuncLib）通过以稳定性为中心的设计生成多样化且具有功能性的蛋白质文库；然而，这种与底物无关的方法缺乏针对目标的特异性功能约束。我们开发了一种机器学习辅助的酶工程（MLEE）工作流程，通过初始筛选和测序轮次，将底物特异性的功能信息加入htFuncLib。该系统采用先前发表的三种不同蛋白质的四位点适应度景观进行了基准测试。MLEE工作流程成功生成了紧凑型文库，并富集了整体高适应度变体。在初始训练阶段之后，一个仅包含12个变体的MLEE富集文库相较于htFuncLib基线，将全局前0.05%顶级变体的命中率提高了5至12倍。对更大规模的96个变体集合进行筛选时，在61.3–99.4%的模拟中至少回收到了一个此类高性能酶。 随后，我们将MLEE应用于MthUPO催化的β-大马酮羟基化反应。在两个轮次中，共筛选并测序了506个不同变体。尽管初始的、与底物无关的htFuncLib文库中只有14%的变体活性高于野生型，但MLEE富集文库将这一命中率提高到90%（108个变体中有97个活性高于野生型）。最佳变体使4-羟基-β-大马酮的转换数提高了11.8倍，并实现了>99%的区域异构体过量。因此，MLEE能够将为稳定性设计的序列空间转化为底物特异性文库，适用于低通量和中通量筛选，且无需预先定义具有生产性的底物构象。

FuncLib 和高通量 FuncLib（htFuncLib）采用以稳定性为中心的设计策略生成多样化且具有功能性的蛋白质文库；然而，这种与底物无关的方法缺乏针对目标的特异性功能约束。我们开发了一种机器学习辅助的酶工程（MLEE）工作流程，通过初始筛选和测序轮次，将底物特异性的功能信息引入 htFuncLib。该系统使用先前发表的三种不同蛋白质的四位点适应度图谱进行了基准测试。MLEE 工作流程成功生成了富集全局高适应度变体的紧凑型文库。初始训练阶段之后，仅包含 12 个变体的 MLEE 富集文库，相较于 htFuncLib 基线，将全局前 0.05% 顶级变体的命中率提高了 5 至 12 倍。对更大规模的 96 个变体集合进行筛选时，在 61.3–99.4% 的模拟中至少回收到了一个此类高性能酶。

随后，我们将 MLEE 应用于 MthUPO 催化的 β-大马酮羟基化反应。经过两轮迭代，共筛选并测序了 506 个不同变体。尽管初始的、与底物无关的 htFuncLib 文库中，活性高于野生型的变体占比为 14%，但 MLEE 富集文库将这一命中率提高至 90%（108 个变体中有 97 个活性高于野生型）。最佳变体使 4-羟基-β-大马酮的周转数提高了 11.8 倍，并实现了 >99% 的区域异构体过量。因此，MLEE 能够将为稳定性而设计的序列空间转化为底物特异性文库，从而适用于低通量和中等通量筛选，且无需预先定义具有生产性的底物构象。

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.20.739108v1?rss=1

🏷️ 酶工程 机器学习 蛋白质设计 定向进化 底物特异性 高通量筛选