通过位点特异性光交联鉴定26S蛋白酶体的内源性底物

26S蛋白酶体是真核细胞中受调控蛋白质周转的枢纽。通过泛素-蛋白酶体系统进行的蛋白质降解在细胞生物学的各个方面都发挥着关键作用，例如基因转录的调控、翻译与蛋白质折叠的质量控制，以及蛋白质跨膜转运。尽管mRNA水平和蛋白质丰度可以借助一套成熟且稳健的既有工具较为容易地进行测定，但目前仅有少数方法能够鉴定由蛋白酶体而非作为另一条主要周转途径的溶酶体所降解的蛋白质。在本研究中，我们试图通过遗传密码子扩展技术，将一种可发生光交联的非天然氨基酸引入酵母26S蛋白酶体中，并在细胞蛋白质底物穿过蛋白酶体ATP酶马达转运时对其进行捕获，以解决这一问题。 体外生化实验确认这些经修饰的蛋白酶体具有功能性，这使我们能够将其导入活酵母细胞中，进行体内交联，并通过质谱法鉴定富集的ATP依赖性底物。这些实验揭示出一个高度多样化的蛋白酶体底物库，并且该底物库在细胞暴露于内质网应激后发生了显著变化。总体而言，我们的结果为探究蛋白酶体底物谱及其对不同细胞条件和应激反应所发生的变化提供了一条令人振奋的研究途径。

26S蛋白酶体是真核细胞中受调控蛋白质周转的枢纽。通过泛素-蛋白酶体系统介导的蛋白质降解在细胞生物学的各个方面都发挥着关键作用，例如基因转录的调控、翻译与蛋白质折叠的质量控制，以及蛋白质跨膜转运。尽管mRNA水平和蛋白质丰度可以借助一套成熟且稳健的既有工具方便地进行测定，但目前仅有少数方法能够鉴定由蛋白酶体而非作为另一主要周转途径的溶酶体所降解的蛋白质。在此，我们尝试通过遗传密码子扩展技术，将一种可光交联的非天然氨基酸引入酵母26S蛋白酶体中，并在细胞蛋白质底物通过蛋白酶体ATP酶马达转位时对其进行捕获，以解决这一问题。

体外生化实验确认这些经修饰的蛋白酶体具有功能活性，这使我们能够将其引入活酵母细胞中，进行体内交联，并通过质谱鉴定富集的ATP依赖性底物。这些实验揭示了一个高度多样化的蛋白酶体底物库，并且该底物库在细胞暴露于内质网应激后发生了显著变化。总之，我们的结果为探测蛋白酶体底物谱及其在各种细胞条件和应激响应下的变化提供了一条令人振奋的研究途径。

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.19.739412v1?rss=1

🏷️ 26S蛋白酶体 位点特异性光交联 泛素-蛋白酶体系统 非天然氨基酸 质谱鉴定 内质网应激