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在使用既有流程处理相同数据时，人们往往默认测序分析具有可重复性，然而，分析结果可能取决于用户并未被明确告知的文库假设。在此，我们考察了新生RNA测序中常用的分析流程。在公开的人类PRO-seq数据集中，相同输入产生了转录谱的结构性差异。通过对处理组合进行诊断性分析，我们将这种差异追溯为双端文库设计、UMI组织方式以及流程内嵌的关于读段修剪、比对和信号生成的假设之间的相互作用。这一模式在独立的人类和猪PRO-seq文库中持续存在，这些文库共享双端UMI设计，反映出由流程所定义、且无法通过用户指定参数被完全访问的假设。 除PRO-seq之外，GRO-seq分析表明，即使不进行UMI处理，特异于实验方法的文库结构也会扭曲位置性信号谱；而PRO-cap和重新注释的PRO-seq数据集则表明，不完整的元数据可能阻止流程运行，或导致无提示的信号丢失。综上，这些结果界定了由文库设计、流程假设和元数据可用性共同塑造的可重复性状态。
1 华中农业大学动物科学技术学院，中华人民共和国湖北省武汉市 430070； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者 崔峰
2 崖州湾国家实验室，中华人民共和国海南省三亚市 572024； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者 赵一昕
3 崖州湾国家实验室 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者 Yixin Zhao 的 ORCID 记录
通讯请联系： gzbyzyx2011{at}gmail.com
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摘要 通常认为，当使用既定流程处理相同数据时，测序分析具有可重复性，然而，分析结果可能取决于用户并不明确知晓的文库假设。在本研究中，我们考察了新生 RNA 测序中常用的分析流程。在公开的人类 PRO-seq 数据集中，相同输入产生了转录谱的结构性差异。通过诊断性处理组合，我们将这种差异追溯到双端文库设计、UMI 组织方式以及流程中嵌入的关于读段修剪、比对和信号生成的假设之间的相互作用。该模式在独立的人类和猪 PRO-seq 文库中持续存在，这些文库共享双端 UMI 设计，反映出流程所定义的假设并不能完全通过用户指定参数加以访问。除 PRO-seq 外，GRO-seq 分析显示，即使不进行 UMI 处理，特定检测方法的文库结构也会扭曲位置性信号谱；而 PRO-cap 和重新注释的 PRO-seq 数据集则表明，不完整的元数据可能阻止流程运行或导致无提示的信号丢失。综上，这些结果界定了由文库设计、流程假设和元数据可获得性共同塑造的可重复性状态。
利益冲突声明 已声明的资助信息 崖州湾国家实验室基础研究项目
版权 本预印本的。 本作品依据 CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可协议 公开提供。
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发表于 2026 年 7 月 17 日。 下载 PDF 补充材料 电子邮件
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Xinbo Zhou
， Cui Feng
， Yixin Zhao
bioRxiv 2026.07.13.738089； doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.13.738089
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Xinbo Zhou
， Cui Feng
， Yixin Zhao
bioRxiv 2026.07.13.738089； doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.13.738089
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