3-氰基酪氨酸的遗传编码及其在控制荧光蛋白mKate发色团异构状态中的应用

可切换的β-桶型荧光蛋白是超分辨成像中至关重要的基因编码探针。发色团顺反异构化所需的空间也为在酚环3位引入体积更大的化学基团提供了可能性。在此，据我们所知，我们首次报道了3-氰基-L-酪氨酸（3CNY）在蛋白质中的成功基因编码。利用遗传密码子扩展技术，这种含氰基氨基酸被直接引入到mKate——一种pH依赖性可切换红色荧光蛋白——的发色团中。在mKate中，发色团在生理pH下呈现具有荧光的酚盐顺式状态，并在酸性条件下转变为酚式反式状态。以3CNY替代天然酪氨酸后，得到的功能性蛋白表现出发生蓝移的光谱性质。含时密度泛函理论（TD-DFT）计算表明，在pH 8时，引入3CNY会导致其处于反式状态。与mKate不同的是，该反式状态具有荧光。相比之下，引入3-氯-L-酪氨酸（3ClY）则保留了对顺式酚盐状态的偏好。分子模拟表明，氰基可与残基S143和S158形成稳定性的氢键，从而促进反式构型。DFT分析进一步指出，吸电子氰基会扰动发色团上的共轭，可能降低顺反异构化的能垒。相反，野生型和3ClY变体在顺式状态下保持了极化的HOMO和LUMO分布，这支持了更强的共轭以及更小的HOMO-LUMO能隙。总体而言，将可基因编码的3-CNY酪氨酸类似物引入荧光蛋白发色团，不仅拓展了我们对其作用机制的理解，也使一种新的化学标签能够被直接引入发色团中。

可切换的β-桶型荧光蛋白是超分辨成像中必不可少的基因编码探针。发色团顺反异构化所需的空间也为在酚环3位引入体积更大的化学基团提供了机会。本文据我们所知，首次报道了3-氰基-L-酪氨酸（3CNY）在蛋白质中的成功遗传编码。利用遗传密码子扩展技术，这种含氰基的氨基酸被直接引入到mKate（一种pH依赖性的可切换红色荧光蛋白）的发色团中。在mKate中，发色团在生理pH下呈现荧光性的酚盐顺式状态，而在酸性条件下转变为酚式反式状态。以3CNY替代天然酪氨酸后，所得蛋白仍具有功能，但其光谱性质发生了向短波方向移动。含时密度泛函理论（TD-DFT）计算表明，在pH 8条件下，3CNY的引入导致发色团呈现反式状态。与mKate不同，该反式状态具有荧光。相比之下，3-氯-L-酪氨酸（3ClY）的引入则保留了对顺式酚盐状态的偏好。分子建模表明，氰基可与残基S143和S158形成稳定性氢键，从而促进反式构型。DFT分析进一步指出，吸电子性的氰基会扰动发色团上的共轭作用，可能降低顺反异构化的能垒。相反，野生型和3ClY变体在顺式状态下保持了极化的HOMO和LUMO分布，这支持了更强的共轭作用以及更小的HOMO-LUMO能隙。总体而言，将可遗传编码的3-CNY酪氨酸类似物引入荧光蛋白发色团，不仅扩展了我们对其作用机制的理解，还使一种新的化学标记能够被直接整合到发色团中。

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