激酶组范围的CRISPR/Cas9敲除筛选揭示了加压素V2受体信号传导中的关键蛋白激酶

信号网络的鉴定是系统生物学中的一个核心目标。在本研究中，我们采用 CRISPR/Cas9 基因敲除筛选（使用覆盖整个激酶组的 sgRNA 文库），以一个研究充分的 Gs 依赖性 G 蛋白偶联受体（GPCR）信号模型——即加压素 V2 受体（V2R）通路——来鉴定在功能上至关重要的蛋白激酶。筛选通过一种专门设计的基于荧光的报告细胞系完成，其中绿色荧光蛋白（GFP）与 Aqp2 共同转录；Aqp2 的转录依赖于加压素介导的蛋白激酶 A（PKA）激活。正调控因子（n=14）包括 PKA 催化亚基（Prkaca）和 Dyrk1a（minibrain 同源物）。负调控因子（n=12）包括 I 型 PKA 调节亚基、Stk11（肝激酶 B1［LKB1］复合物的催化亚基）以及 3 个 TGF-β 受体亚基（Tgfbr1、Tgfbr2、Tgfbr3）（完整名单见 https://esbl.nhlbi.nih.gov/Databases/Kinome-CRISPR-screen/）。Dyrk1a 敲除细胞系无法表达 AQP2 蛋白，并表现出 AQP2 mRNA 的显著下降。RNA 测序显示细胞周期相关转录本广泛增加，并伴随普遍的细胞分化缺陷，这解释了 AQP2 的缺失。将 TGF-β 作用于未转化细胞会导致 V2R 和 AQP2 mRNA 丰度显著下降，同时多个 V2R-PKA 信号传导的其他转录靶点也发生变化，这与先前关于 TGF-β 介导的加压素逃逸的发现一致。Stk11/LKB1 敲除细胞系即使在无加压素存在的情况下，也表现出 AQP2 蛋白和 mRNA 的显著增加。RNA 测序表明，在未转化细胞中，Stk11/LKB1 缺失所引起的应答与加压素暴露所引起的应答高度相似。磷酸化蛋白质组学数据表明，在 V2R-PKA 信号传导引发的转录应答中，Stk11/LKB1 和 PKA 在调控 cAMP 反应性转录共激活因子（CRTC）蛋白方面发挥相反作用。 意义声明 全身各处的细胞都受到诸如激素加压素之类的细胞外信号调控。激素对细胞功能的影响由膜受体介导，这些受体会触发生化改变，通常是通过诱导构成单个蛋白质的氨基酸发生化学修饰来实现，例如添加能够改变功能的磷酸基团（磷酸化）。蛋白质磷酸化由称为“蛋白激酶”的酶介导。在本研究中，我们利用现代 CRISPR/Cas9 技术对所有已知蛋白激酶进行了筛选，以鉴定参与肾脏中加压素作用的蛋白激酶。正如基于既往知识所预期的那样，该筛选鉴定出了蛋白激酶 A 及其一个调节亚基，但同时也鉴定出了若干此前尚未被认为与肾脏中加压素作用相关的蛋白激酶。

信号网络的鉴定是系统生物学中的一个核心目标。在此，我们采用CRISPR/Cas9敲除筛选（使用覆盖整个激酶组的sgRNA文库）来鉴定一个研究充分的G

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🏷️ CRISPR敲除筛选 激酶组 加压素V2受体 GPCR信号传导 蛋白激酶 磷酸化蛋白质组学