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亲脂性染料被广泛用于追踪细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），然而，其对真正的小型EV（small EVs, sEVs）的标记效率仍缺乏明确界定。在本研究中，我们利用一种无血清HEK293F体系对这一效率进行了严格再评估。该体系可产生内源性荧光蛋白标记的sEVs（sEVs-FPT），作为明确无歧义的阳性参照，从而最大限度减少与囊泡共同分离、但可被染料标记的非囊泡性细胞外颗粒（non-vesicular extracellular particles, NVEPs）所造成的干扰。我们采用了两种正交方法——纳米流式细胞术和荧光显微镜——进行交叉验证。结果发现，无论囊泡异质性如何，PKH26、PKH67和DiD对sEVs-FPT的标记比例均低于0.5%。体内追踪进一步证实，染料来源的信号远弱于FPT信号，且显著未与后者发生共定位。初步机制性证据表明，这种失败归因于sEVs无法主动内化染料聚集体。我们的研究结果对基于亲脂性染料的EV追踪方法的有效性提出了严重质疑，并呼吁对相关文献进行批判性重新评估。
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脂溶性染料标记的批判性再评估揭示：源自无血清培养细胞的小细胞外囊泡几乎不掺入染料
Yuhua Ji， Qiuhong Ji， Juling Ji， Yuting Shentu， lingling Zhou， Jingrong Wu， Qian Shao， Wei Xu， Chenhao Zhang， Mi Shen， Qiuling Xie
doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.04.722344
Yuhua Ji 1 暨南大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者 Yuhua Ji 的 ORCID 记录 通讯作者： tjiyuhua{at}126.com
Qiuhong Ji 2 南通大学附属医院神经内科，中国南通； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者 Qiuhong Ji 的 ORCID 记录
Juling Ji 3 南通大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者
Yuting Shentu 4 南通大学附属医院； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者
lingling Zhou 5 南通大学附属医院； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者
Jingrong Wu 2 南通大学附属医院神经内科，中国南通； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者
Qian Shao 6 南通大学附属医院临床医学研究中心，中国南通； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者
Wei Xu 7 暨南大学生命科学与技术学院免疫生物学与微生物学系，中国广州； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者
Chenhao Zhang 7 暨南大学生命科学与技术学院免疫生物学与微生物学系，中国广州； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者
Mi Shen 8 江苏省及教育部神经再生重点实验室，南通大学，中国南通； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者
Qiuling Xie 9 暨南大学生命科学与技术学院细胞生物学研究所，中国广州 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者
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摘要
脂溶性染料被广泛用于追踪细胞外囊泡（EV），然而其对真实小细胞外囊泡（sEV）的标记效率仍缺乏明确界定。在本研究中，我们利用无血清 HEK293F 体系对此效率进行了批判性再评估。该体系可产生内源性荧光蛋白标记的小细胞外囊泡（sEVs-FPT），作为明确无歧义的阳性参照，从而最大限度减少与染料可标记的非囊泡性细胞外颗粒（NVEP）共分离所带来的干扰。我们采用纳米流式细胞术和荧光显微镜两种正交方法进行交叉验证。结果发现，无论囊泡异质性如何，PKH26、PKH67 和 DiD 标记的 sEVs-FPT 均少于 0.5%。体内追踪进一步证实，源于染料的信号远弱于 FPT 信号，且显著未能与后者共定位。初步机制性证据表明，这种失败源于 sEV 无法主动内化染料聚集体。我们的研究结果对基于脂溶性染料的 EV 追踪有效性提出了严重质疑，并呼吁对相关文献进行批判性重新评估。
利益冲突声明
已声明的资助信息
中国国家自然科学基金 82071553 81761128018 81272027
江苏省自然科学基金 BK20151277
江苏省医学创新中心 CXZX202212
江苏省研究型医院 YJXYY202204
江苏省“六大人才高峰”项目 2017-WSN-094
南通市自然科学基金 MS 32015026
江苏省研究生科研与实践创新计划 KYCX24_3604
版权
本预印本的。
本文按照 CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可协议 提供。
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发布于 2026 年 7 月 8 日。
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Yuhua Ji， Qiuhong Ji， Juling Ji， Yuting Shentu， lingling Zhou， Jingrong Wu， Qian Shao， Wei Xu， Chenhao Zhang， Mi Shen， Qiuling Xie
bioRxiv 2026.07.04.722344； doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.04.722344
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脂溶性染料标记的批判性再评估揭示：源自无血清培养细胞的小细胞外囊泡几乎不掺入染料
Yuhua Ji， Qiuhong Ji， Juling Ji， Yuting Shentu， lingling Zhou， Jingrong Wu， Qian Shao， Wei Xu， Chenhao Zhang， Mi Shen， Qiuling Xie
bioRxiv 2026.07.04.722344； doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.04.722344
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.04.722344v1?rss=1
🏷️ 细胞外囊泡 脂溶性染料 纳米流式细胞术 无血清培养 荧光追踪