特异性识别 M1 连接型泛素链的多功能单域抗体的开发与表征

泛素信号传导由结构各异的多聚泛素链介导，这些链编码着不同的细胞功能。对这一泛素密码的解析，尤其是对丰度较低的非典型链类型的解析，一直受限于缺乏通用且具链类型特异性的亲和试剂。在此，我们证明人源单结构域抗体（sdAb）可作为一种通用平台，用于生成泛素连接类型特异性的结合分子。利用噬菌体展示和合成人源 sdAb 文库，我们鉴定出 2A6——一种可特异性识别甲硫氨酸-1（M1）连接泛素链的 sdAb。据我们所知，2A6 是首个被报道的、对明确同型泛素链连接具有特异性的 sdAb。2A6 以纳摩尔级亲和力结合 M1 连接泛素链，并且在二聚泛素和长链多聚泛素两个层面上均对 M1 连接链表现出特异性。AlphaFold3 建模结合饱和诱变结果预测，2A6 通过同时识别近端和远端泛素部分以及 M1 连接附近区域来实现结合。在功能上，2A6 可在多种应用中实现对 M1 连接泛素的特异性检测与富集，包括 ELISA、免疫印迹、半变性条件下的免疫沉淀、底物泛素化分析以及免疫荧光显微镜观察。该 sdAb 可通过单一表达质粒在大肠杆菌中便捷制备，从而为研究 M1 连接泛素信号传导提供了一种易于操作、成本效益高且用途广泛的试剂。我们的工作确立了 sdAb 作为泛素连接特异性亲和试剂通用平台的地位，并为开发专门靶向其他泛素连接类型或构型的类似结合分子提供了框架。

泛素信号传导由结构上各异的多聚泛素链介导，这些链编码了不同的细胞功能。在解析这一泛素密码的过程中，尤其是对于丰度较低的非典型链类型，进展一直受到缺乏多功能、链类型特异性亲和试剂的限制。在此，我们证明人源单结构域抗体（sdAb）可作为构建泛素连接特异性结合物的多功能支架。

利用噬菌体展示和合成人源 sdAb 文库，我们鉴定出 2A6——一种可特异性识别甲硫氨酸-1（M1）连接泛素链的 sdAb。据我们所知，2A6 是首个被报道对明确同型泛素链连接方式具有特异性的 sdAb。2A6 以纳摩尔亲和力结合 M1 连接泛素链，并且无论在二聚泛素还是长链多聚泛素层面，均对 M1 连接链表现出特异性。AlphaFold3 建模结合饱和诱变结果预测，2A6 可同时识别近端和远端泛素部分，以及 M1 连接位点附近区域。

在功能上，2A6 能够在多种应用中实现对 M1 连接泛素的特异性检测与富集，包括 ELISA、免疫印迹、半变性条件下的免疫沉淀、底物泛素化分析以及免疫荧光显微镜观察。该 sdAb 可通过单一表达质粒在大肠杆菌中便捷制备，从而为研究 M1 连接泛素信号传导提供了一种易于操作、成本效益高且用途广泛的试剂。我们的研究确立了 sdAb 作为泛素连接特异性亲和试剂多功能支架的地位，并为开发可特异性靶向其他泛素连接类型或构型的类似结合物提供了框架。

📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.05.736589v1?rss=1

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