生物正交调控水凝胶刚度促进传代软骨细胞的分区再分化

构建能够重现天然关节软骨深度依赖性表型、结构和功能的生物工程软骨仍然是一项挑战。尽管软骨富含聚集蛋白聚糖和II型胶原，但其正常功能依赖于深度依赖性的蛋白表达。浅表层软骨细胞（SZCs）分泌蛋白聚糖4（PRG4）以润滑软骨表面。深层软骨细胞产生X型胶原（COLX），以支持压缩负荷并将载荷传递至软骨下骨。我们此前证明，经传代的全层软骨细胞（FTCs）和分区软骨细胞在无支架三维（3D）培养并置于再分化培养基中后，能够重新表达软骨及分区特异性标志物。然而，在缺乏指导性基质的情况下，细胞仅表达较低水平的分区特异性蛋白，且表现出有限的深度依赖性组织结构。我们假设，具有分区特异性微环境线索的合成细胞外基质将引导分区分化。 为此，将传代培养的原代牛软骨细胞包埋于一种柔软的、基于透明质酸（HA）、具有细胞黏附性且可被蛋白酶降解的水凝胶中；该水凝胶通过生物正交四嗪（Tz）与降冰片烯（Nb）的连接反应构建而成。在补充转化生长因子β3（TGFβ3）的条件下，FTCs沉积了聚集蛋白聚糖和II型胶原，而I型胶原极少。在细胞培养过程中应用四嗪与反式环辛烯（TCO）的界面连接反应可导致基质刚度增加，并进而上调COLX的表达。相反，在柔软水凝胶中培养的SZCs表现出最高的PRG4表达。通过扩散控制反应构建具有区域特异性刚度的三层结构，可在特定区域促进PRG4和COLX的表达。 综上，这些研究结果表明，可调控的HA基水凝胶能够增强软骨细胞的分区特异性表型，并促进分区组织化软骨的形成。

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通过生物正交调控水凝胶刚度促进传代软骨细胞的分区再分化

Thomas J. Manzoni， Aditya Natu， John E Caputo， Anh Ho， Isabella Ewine， Lilly Smull， Yinzhi Fang， Joseph M Fox， Alvin W Su， Xinqiao Jia， Justin Parreno

doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.02.736090

Thomas J. Manzoni 1 特拉华大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站搜索该作者 Thomas J. Manzoni 的 ORCID 记录

Aditya Natu 1 特拉华大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站搜索该作者 Aditya Natu 的 ORCID 记录

John E Caputo 1 特拉华大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站搜索该作者

Anh Ho 1 特拉华大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站搜索该作者

Isabella Ewine 1 特拉华大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站搜索该作者

Lilly Smull 1 特拉华大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站搜索该作者

Yinzhi Fang 1 特拉华大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站搜索该作者

Joseph M Fox 1 特拉华大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站搜索该作者

Alvin W Su 2 特拉华州尼穆尔儿童医院 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站搜索该作者 Alvin W Su 的 ORCID 记录

Xinqiao Jia 1 特拉华大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站搜索该作者 Xinqiao Jia 的 ORCID 记录

Justin Parreno 1 特拉华大学； 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站搜索该作者 Justin Parreno 的 ORCID 记录

通信作者： jparreno{at}udel.edu

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摘要

构建能够重现天然关节软骨深度依赖性表型、结构和功能的生物工程化软骨仍然是一项挑战。尽管软骨富含聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，但其正常功能依赖于深度依赖性的蛋白表达。表层区软骨细胞（SZCs）分泌蛋白聚糖-4（PRG4），以润滑软骨表面。深层区软骨细胞产生Ⅹ型胶原（COLX），以支持压缩负荷并将载荷传递至软骨下骨。我们此前已证明，传代的全层软骨细胞（FTCs）和分区软骨细胞在无支架三维（3D）培养并置于再分化培养基中后，能够重新表达软骨及区特异性标志物。然而，在缺乏指导性基质的情况下，细胞的区特异性蛋白表达水平较低，且表现出有限的深度依赖性组织结构。我们假设，具有区特异性微环境线索的合成细胞外基质将引导分区分化。为此，将传代原代牛软骨细胞包埋于一种柔软的、基于透明质酸（HA）的、具有细胞黏附性且可被蛋白酶降解的水凝胶中；该水凝胶通过四嗪（Tz）与降冰片烯（Nb）之间的生物正交连接反应构建而成。在补充 TGFβ3 后，FTCs 沉积了聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，而Ⅰ型胶原极少。在细胞培养过程中施加四嗪与反式环辛烯（TCO）之间的界面连接反应可导致基质硬化，并进而上调 COLX 表达。相反，在柔软水凝胶中培养的 SZCs 表现出最高的 PRG4 表达。通过扩散控制反应建立具有区域特异性刚度的三层构建体，可促进特定区域中的 PRG4 和 COLX 表达。综上，这些发现表明，可调控的 HA 基水凝胶能够增强软骨细胞的区特异性表型，并促进形成具有分区组织结构的软骨。

利益冲突声明

已声明的资助信息

骨科研究与教育基金会， https://ror.org/029xgej46 ，26-010

美国国立卫生研究院， https://ror.org/01cwqze88 ，R01DE029655 ，R01DC014461 ，P20 GM103446 ，P20 GM139760

美国国家科学基金会 ，DMR 2011824 ，IIA-1301765

版权

该预印本的。 本文依据 CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可协议 公开提供。

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发表于 2026 年 7 月 3 日。

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bioRxiv 2026.07.02.736090； doi： https://doi.org/10.64898/2026.07.02.736090

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📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.02.736090v1?rss=1

🏷️ 生物正交 透明质酸水凝胶 软骨细胞再分化 基质刚度调控 软骨组织工程