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长读长转座子插入测序对于建立基因型与表型之间的联系至关重要，因为短读长方法在复杂基因组区域中往往难以胜任。长读长测序通常需要较高的测序深度或靶向测序，而这两种方式要么需要繁琐的样品制备，要么净效率较低。我们开发了一种简单、低成本的流程，将酶切与自适应采样相结合，显著提高了目标序列回收率并简化了分析过程。通过将 I-SceI 限制性位点引入 mini-Tn5 转座子，在贪铜菌属 Cupriavidus necator 中构建了一个突变体文库。在 Nanopore 测序之前，对基因组 DNA 进行酶切，以便在插入位点精确引入双链断裂，随后结合自适应采样进行测序。该流程通过一项生物被膜筛选实验得到了验证。将 I-SceI 酶切与自适应采样相结合后，获得了有效的 11.3 倍富集（经孔道占用率标准化后）。高深度测序覆盖了 97.1% 的全部基因。由于测序读段始终从精确的插入位点开始，因此无需进行生物信息学修剪。该生物被膜筛选成功鉴定出富集的整合位点，能够在重复的 rRNA 操纵子内实现插入位点的唯一定位，并揭示了共同被筛选出的自发性次级突变。该方法仅使文库制备时间增加不到 1 小时，将耗材成本降低了 90% 以上，并建立了一种经济、简便且具有高分辨率的长读长 Tn-seq 流程，特别适用于复杂及多组分基因组。
基于限制性位点的富集结合自适应采样实现长读长转座子插入测序 | bioRxiv
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基于限制性位点的富集结合自适应采样实现长读长转座子插入测序
Christian Jonas Lapp， Janek Weiler， Johannes Gescher
doi： https://doi.org/10.64898/2026.06.23.733934
Christian Jonas Lapp 汉堡工业大学，技术微生物学研究所 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者 Christian Jonas Lapp 的 ORCID 记录
Janek Weiler 汉堡工业大学，技术微生物学研究所 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者 Janek Weiler 的 ORCID 记录
Johannes Gescher 汉堡工业大学，技术微生物学研究所 在 Google Scholar 上查找该作者 在 PubMed 上查找该作者 在本网站上搜索该作者 Johannes Gescher 的 ORCID 记录
通讯作者： johannes.gescher{at}tuhh.de
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摘要
长读长转座子插入测序对于将基因型与表型联系起来至关重要，因为短读长方法难以处理复杂基因组区域。长读长测序需要较高的测序深度或靶向测序，而这两者要么需要繁琐的样品制备，要么净效率较低。我们开发了一种简单、低成本的流程，将酶切与自适应采样相结合，从而显著提高靶标回收率并简化分析。我们将 I-SceI 限制性位点引入 mini-Tn5 转座子中，以在食酸菌 Cupriavidus necator 中构建突变体文库。在 Nanopore 测序之前，对基因组 DNA 进行消化，以在插入位点精确引入双链断裂，随后结合自适应采样进行测序。该流程通过生物膜筛选实验得到了验证。I-SceI 消化与自适应采样相结合后，获得了有效的 11.3 倍富集（经孔道占用率标准化后）。高深度测序覆盖了 97.1% 的全部基因。由于读段始终从精确的插入位点开始，因此无需进行生物信息学剪切。生物膜筛选成功鉴定出富集的整合位点，能够在重复的 rRNA 操纵子中对插入进行唯一定位，并揭示出共同筛选出的自发性次级突变。该方法仅使文库制备时间增加不到 1 小时，将耗材成本降低了 90% 以上，并建立了一种经济、简便且高分辨率的长读长 Tn-seq 流程，特别适用于复杂及多复制子的基因组。
利益冲突声明
已声明资助信息
德国研究基金会 SFB 1615 503850735
版权
本预印本的。 本文依据 CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可协议 公开提供。
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发布于 2026 年 6 月 28 日。
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基于限制性位点的富集结合自适应采样实现长读长转座子插入测序
Christian Jonas Lapp， Janek Weiler， Johannes Gescher
bioRxiv 2026.06.23.733934； doi： https://doi.org/10.64898/2026.06.23.733934
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基于限制性位点的富集结合自适应采样实现长读长转座子插入测序
Christian Jonas Lapp， Janek Weiler， Johannes Gescher
bioRxiv 2026.06.23.733934； doi： https://doi.org/10.64898/2026.06.23.733934
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.23.733934v1?rss=1
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