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Orientia tsutsugamushi是一种由螨虫传播的专性胞内细菌，可引起具有潜在致死性的动物源性疾病——恙虫病。由于缺乏针对Orientia的遗传学工具，限制了对恙虫病发生基础中微生物—宿主相互作用的研究。为弥补这一空白，我们建立了一套针对O. tsutsugamushi Ikeda株的转化及等位基因交换方案。通过评估多种细胞系和抗生素，我们发现接触抑制的EA.hy926人类内皮样细胞最有利于Orientia复制，而氯霉素是有效的筛选标记。我们构建了一个同源重组盒，其中编码O. tsutsugamushi ank13基因（OTT_RS04140）的密码子优化版本（CMank13）及其启动子，同时包含在O. tsutsugamushi tsa22-up和tsa56-down启动子控制下分别表达mScarlet-I和氯霉素乙酰转移酶的基因。包含该重组盒及染色体侧翼区域的PCR产物通过电穿孔或CaCl2法转化入O. tsutsugamushi，其中后者能更好地保持细菌和宿主细胞的活性。接种了转化O. tsutsugamushi的EA.hy926细胞在含氯霉素的玻底培养板中培养，并通过活细胞显微成像鉴定含有mScarlet-I阳性细菌的培养物，这些培养物可被无限期维持。通过PCR和纳米孔测序证实了CMank13重组盒的染色体整合以及野生型ank13的缺失。本研究建立了对O. tsutsugamushi进行遗传操作并构建更多遗传学工具的平台，以推进对这一具有全球重要性病原体的研究。
Orientia tsutsugamushi 是一种由螨类传播的专性细胞内细菌，可引起具有潜在致死性的动物源性疾病——丛林斑疹伤寒。由于缺乏针对 Orientia 的遗传学工具，限制了对支撑丛林斑疹伤寒发生发展的微生物—宿主相互作用的研究。为弥补这一空白，我们建立了一种用于在 O. tsutsugamushi Ikeda 株中实现转化和等位基因交换的实验方案。通过评估多种细胞系和抗生素，我们发现接触抑制的 EA.hy926 人内皮样细胞最有利于 Orientia 的复制，且氯霉素是有效的筛选标记。我们构建了一个同源重组盒，其中编码 O. tsutsugamushi ank13 基因（OTT_RS04140）密码子修饰版本（CMank13）及其启动子，并同时包含 mScarlet-I 和氯霉素乙酰转移酶基因，这两个基因分别受 O. tsutsugamushi tsa22-up 和 tsa56-down 启动子调控。随后，将包含该重组盒及染色体侧翼区域的 PCR 产物通过电穿孔或 CaCl2 法导入 O. tsutsugamushi，其中后者能更好地保持细菌和宿主细胞的活力。将接种了转化 O. tsutsugamushi 的 EA.hy926 细胞在含氯霉素的玻底培养板中培养，并通过活细胞显微成像鉴定含有 mScarlet-I 阳性细菌的培养物，此类培养物可被无限期维持。通过 PCR 和纳米孔测序验证了 CMank13 重组盒的染色体整合以及野生型 ank13 的缺失。本研究建立了对 O. tsutsugamushi 进行遗传操作的平台，并为构建更多遗传学工具以研究这一具有全球重要性的病原体奠定了基础。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.22.733791v1?rss=1
🏷️ 恙虫病东方体 遗传转化 等位基因交换 同源重组 胞内病原体 基因操作平台