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非经典氨基酸（ncAAs）是化学生物学和生物化学中用于标记、探测和追踪生物分子的宝贵工具。能够利用大肠杆菌天然机制通过重组方式掺入的 ncAAs 尤其有用，因为它们能够实现蛋白质的全局性掺入，并避免复杂的遗传密码扩展。在此，我们证明了一种甲硫氨酸类似物——L-氰基高丙氨酸（Cha）——可由大肠杆菌的甲硫氨酰-tRNA 合成酶掺入到在甲硫氨酸营养缺陷型细菌培养物中表达的突变型超级折叠 GFP（sfGFP）中。我们将其与补加 L-甲硫氨酸（Met）或 L-叠氮高丙氨酸（Aha）的甲硫氨酸营养缺陷型细菌培养物进行了比较。在对照的原养型大肠杆菌中，高浓度 Aha 会抑制细菌生长速率，而 Cha 则不会。然而，与补加 Aha 和 Met 相比，补加 Cha 的营养缺陷型细胞产生的 sfGFP 更少。因此，尽管 Cha 对大肠杆菌无毒，但其掺入蛋白质的效率低于 Aha 或 Met。质谱分析证实，N 端的 Cha、Aha 和 Met 均如 sfGFP 突变体所预期的那样被切除。质谱还证实了 Cha 和 Aha 在其他位点的掺入，且标记效率因位点而异。纯化 sfGFP 的热变性分析表明，Cha 和 Aha 标记并不会显著扰动蛋白质稳定性。未来，Cha 可能可用于通过野生型甲硫氨酰-tRNA 合成酶进行蛋白质组标记，并可与其他甲硫氨酸类似物一起应用于新生蛋白质的代谢脉冲标记。此外，Cha 的腈基部分可用于进行与叠氮/炔点击化学正交的反应，或可作为环境振动报告基团。
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非经典氨基酸（ncAAs）是化学生物学和生物化学中用于标记、探测和追踪生物分子的宝贵工具。能够利用大肠杆菌天然机制通过重组方式掺入的 ncAA 尤其有用，因为它们能够实现蛋白质的全局掺入，并避免复杂的遗传密码扩展。在此，我们展示了一种甲硫氨酸类似物——L-氰基高丙氨酸（L-cyanohomoalanine，Cha）——可被大肠杆菌甲硫氨酰-tRNA 合成酶成功掺入到突变型 superfolder GFP（sfGFP）中，该蛋白在甲硫氨酸营养缺陷型细菌培养物中表达。我们将其与补充了 L-甲硫氨酸（Met）或 L-叠氮基高丙氨酸（Aha）的甲硫氨酸营养缺陷型细菌培养物进行比较。在对照的原养型大肠杆菌中，高浓度 Aha 会抑制细菌生长速率，而 Cha 则不会。然而，与补充 Aha 和 Met 相比，补充 Cha 的营养缺陷型细胞产生的 sfGFP 更少。因此，尽管 Cha 对大肠杆菌无毒，但其掺入蛋白质的效率低于 Aha 或 Met。质谱证实，N 端的 Cha、Aha 和 Met 均如 sfGFP 突变体所预期那样被切除。Cha 和 Aha 在其他位点的掺入也通过质谱得到证实，且标记效率因位点而异。纯化 sfGFP 的热熔解实验表明，Cha 和 Aha 标记不会显著扰动蛋白质稳定性。未来，Cha 可能有助于通过野生型甲硫氨酰-tRNA 合成酶进行蛋白质组标记，并可与其他甲硫氨酸类似物一起应用于新合成蛋白质的代谢脉冲标记。此外，Cha 的腈基部分可用于执行与叠氮/炔点击化学正交的反应，或可作为环境的振动报告基团。
利益冲突声明
已声明资助信息
Arnold and Mabel Beckman Foundation， https://ror.org/05avmtm72 National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program ，DGE2139841 NIH Office of the Director ，S10OD018034 ，S10OD019967 ，S10OD02365101A1 National Institutes of Health (NIH) ，T32 GM008283
版权
本预印本的。
本作品依据 CC-BY 4.0 国际许可协议 进行提供。
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发布于 2026 年 6 月 26 日。
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Caitlin M Davis ， Sydney O Shuster bioRxiv 2026.06.25.734610； doi： https://doi.org/10.64898/2026.06.25.734610
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Caitlin M Davis ， Sydney O Shuster bioRxiv 2026.06.25.734610； doi： https://doi.org/10.64898/2026.06.25.734610
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.25.734610v1?rss=1
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